血小板功能检测

：血小板在止血和动脉血栓形成中的作用包括粘附到受损血管处或破裂的动脉粥样硬化斑块
处，形成止血栓或凝块；加速凝血瀑布导致凝血酶的形成。

本文综述了血小板的作用，列举了遗传性的血小板缺陷及异常出血性疾病，并讨论了各种血小板致聚剂。

本文综述了各种血小板功能检测方法以及它们的优缺点：出血时间测定；利用透光性的改变来检测枸橼酸钠抗凝的富含血小板血浆中血小板的聚集功能；阻抗聚集仪检测枸橼酸钠抗凝
全血中血小板的聚集功能；高切变力血小板功能分析仪〔PFA-100〕和 Ultegra快速血小板功能测定仪检测血小板相关的止血功能；用锥板分析仪检测高切变力下血小板的粘附和聚集
功能；检测血小板颗粒内容物的分泌〔ATP, 14C-5- 羟色胺 , 血小板第 4 因子和β－血小板球
蛋白〕和血栓烷 B2 的形成；流式细胞术检测体内和体外使用致聚剂的血小板激活情况〔包
括血小板膜糖蛋白构象改变，P-选择素和磷脂酰丝氨酸的表达〕；检测遗传性缺陷中血小板
膜糖蛋白的水平。

1 简介
血小板在止血和血栓中的作用
当血管损伤时，血小板会迅速粘附到损伤处，聚集形成由纤维蛋白固定的止血块。

在微血管损伤处及破裂的动脉粥样硬化斑块处也会发生类似的过程，最终形成血小板－纤维蛋白血
栓，引发动脉硬化症的血栓性并发症。

体内能够激活血小板的诱导剂主要有胶原蛋白，ADP，血栓烷 A2〔TXA2〕，凝血酶，弱诱导剂有 5－羟色胺和肾上腺素。

血小板上不仅有针对这些介质的受体，还有纤维蛋白原和VWF 的受体。

TXA2的形成和释放以及血小板致密颗粒中分泌的ADP和 5－羟色胺会加速血小板的
激活过程，促凝外表的暴露促进凝血酶的形成，而凝血酶是强有效的激活剂。

激活也会诱导α-颗粒内容物的分泌和颗粒跨膜蛋白P- 选择素出现在血小板的外表上。

所有血小板致聚剂
都具有协同作用，因此当凝集过程的某个途径存在缺陷或被抑制时，血小板的凝集功能将被大大
受损。

在血管壁的损伤处，血小板与内皮下细胞外基质中的Von Willebrand 因子〔 VWF〕，胶原蛋白和纤维结合素粘附在一起。

在高切变力情况下，血小板糖蛋白GPIb/IX/V复合物与 VWF
的相互反响是非常短暂的，但当VWF与血小板外表
的GPIIb/IIIa结合，这一过程会变成不
可逆的。

血小板外表胶原蛋白受体包括GPIa/IIa 〔α 2β 1〕，它在粘附过程中具有非常重要
的作用；而 GPVI 在血小板活化引起TXA2的形成和释放以及致密颗粒和α贮存颗粒内容物的
分泌过程中起作用。

血小板存在TXA2和 ADP受体，在损伤处流动的血小板受刺激后会改变
形状，伸出伪足，进而在粘附血小板周围形成聚集物。

聚集过程需要血小板外表的异二聚体整合素分泌和血小板外表磷脂双分子层翻转暴露促凝
磷脂外表，通常为磷脂酰丝氨酸〔PS〕翻转到血小板外表。

也会产生促凝活性的微粒。

PS 的暴露大大加速了凝血途径因子Ⅹ和凝血酶原酶的反响，产生了最有效的血小板诱导剂--凝血酶。

凝血酶切开血小板外表的蛋白酶激活受体，导致 GPIIbGPIIb/IIIa复合物转变成纤
维蛋白原的受体或某些情况下作为VWF的受体。

这些蛋白会在邻近的受刺激的血小板之间搭
桥。

激活的正常的 GPIIb/IIIa在血小板聚集过程中非常重要。

当血小板受胶原蛋白和凝血酶等致聚剂刺激，能引起血小板颗粒的/IIIa的激活，形成TXA2和引起血小板颗粒内容物的分泌。

凝血酶同样促使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，包裹在血小板聚合物外表形成巩固的止血块或血栓。

在磷脂酶 A2 作用下膜磷脂释要目的在于确定异常出血的原因或确保在手术或牙科侵入性操作
〔包括拔牙〕过程中的正常止血功能。

多种方法尝试来证实高血小板活性有血栓形成的倾向，
这个专题最近被 Thiagarajan 和 Wu等进行综述。

异常出血常见的原因为血小板减少症，这可通过血小板计数来确定。

当血小板计数低放出花
生四烯酸时可产生TXA2。

在环氧化酶〔 COX-1〕和血栓烷合酶作用下，花生四烯酸转变为T XA2。

TXA2只能短期存在，很快形成无活性的稳定产物TXB2。

COX－ 1 被阿司匹林不可逆地灭活，
因此血小板生成TXA2的能力受到它们在外周循环停留时间的影响。

任何一项血小板功能受损，都会削弱凝血功能。

血小板功能检测的主于50-70 × 109/l ，就会导致瘀斑和凝血异常。

血小板减少症会影响大多数血小板功能检测方法，但对流式细胞术
除外。

遗传性和获得性血小板功能缺陷
表 1 列举了局部遗传性疾病，它们的血小板功能存在某种程度的受损，有明显的出血病症。

除 Von Willebrand 病 (VWD) 外，大多数缺陷非常罕见。

虽然某些食物和天然物质中含有抑制物，但是药物因素仍是最主要的引起获得性血小板功能
低下的原因。

抑制血小板功能的药物中有能抑制COX的阿斯匹林和其它非甾醇类抗感染药，
抗生素如青霉素，thienopyridines〔噻氯匹定和clopidogrel〕，GPIIb/IIIa拮抗剂，影响 cAMP水平的药物，抗凝剂如肝素，纤溶制剂，心血管药物，神经科药物和麻醉药物等。

到目前为止阿司匹林是最常见的抑制剂，至少有 250 种药物中含有这种成分。

阿司匹林的作
用是长期的，它对COX-1的乙酰化作用是不可逆的。

非血液系统疾病引起血小板功能降低的疾病有：尿毒症，慢性肝病，骨髓增殖性疾病和获得
性 VWD。

表 1 遗传性出血疾病
Glanzmann 血小板机能不全： GPIIb/IIIa 〔α IIb β3〕缺失或异常它是纤维蛋白原和 VWF 的受体，对任何血小板致聚剂无反响。

Bernard-Soulier 巨大血小板综合症： GPIb/IX/V 缺失或异常它参与血小板与内皮下的 VWF 粘附。

对瑞斯霉素无反响。

GPIa/IIa〔α 2β 1〕缺失或异常。

不能粘附胶原蛋白
GPVI 缺失或异常。

不能被胶原蛋白激活
P2Y12缺失或异常。

它是ADP和腺苷酰环化酶的受体。

非常罕见
贮存池疾病包括血小板分泌缺陷
初级分泌缺陷。

是由于颗粒内容物缺陷或放大途径缺陷之外的原因引起的一大类分泌性疾病
—最常见的先天性分泌缺陷病
致密颗粒缺陷〔δ－颗粒〕〔如Hermansky-Pudlack综合症，Chediak-Higashi综合症〕α－颗粒缺陷〔α－颗粒〕〔灰血小板综合症〕
致密颗粒和α－颗粒缺陷
Quebec 血小板综合症
Jacobsen 或 Paris-Trousseau综合症
Scott 综合症。

刺激后不形成促凝外表
花生四烯酸发动，环氧化酶，血栓烷酶或TXA2受体、 VWF缺陷
1型 VWD-VWF局部减少〔占80％病例〕2型 VWD－ VWF异常〔占 15-20 ％病例〕
3型 VWD－ VWF缺失〔罕见〕
血小板型VWD。

GPIb/IX/V表型功能增强
纤维蛋白原缺乏症
2血小板功能检测
最早的检测血小板功能的方法是出血时间。

Thiagarajan和Wu定义的皮肤外表出血时间为：在上臂处用血压绷带加压到40mmHg，然后采用一次性的自动的设备在前臂的掌侧皮肤外表
上划一道长10mm，深 1mm标准的切口，每隔30 秒吸去伤口处的血液，直到出血停止。

正常
的出血时间少于10 分钟。

当血小板计数小于100× 109/l时，出血时间会延长，因此这一方法“在血小板减少的患者测定血小板功能的缺陷时作用有限〞。

它的优点在于操作简单，快速，不需要对血液进一步的检测和处理，缺点是受技术人员的操作技术，皮肤厚度和温度的影响。

本方法缺乏一致性，在判断出血倾向方面是不敏感指标。

其它血小板功能检测方法需要小心抽血和处理。

患者不能加绷带和一周不能服用影响血小板功能的
药物。

19-20 号针头和塑料注射器用于静脉穿刺，从静脉穿刺到实验的间隔时间必需标准化，这是
因为血样中丧失的 CO2会使 pH 值升高，增加血小板对致聚剂的反响能力。

必须防止溶血，因为溶
解的红细胞会释放出血小板的诱导剂 ADP。

容器必须是塑料的或硅化玻璃以防止血小板吸附到容器
外表。

抗凝剂的选择以及温度也会影响血小板的功能，抗凝血应置于室温或 37℃，而不能置于4℃。

一般不推荐使用真空管，除非使用自动血小板功能分析仪〔见和〕。

最常见的抗凝剂是枸橼酸钠，它可以将钙离子的浓度降到微摩尔级〔枸橼酸钠终浓度为，钙离子的浓度为 40μ M；枸橼酸钠终浓度为，钙离子的浓度＜ 5μ M〕。

如果使用 EDTA抗凝剂，钙离子的浓度将能低至不能使血小板凝集。

肝素的效果不好，因为血小板经常粘附到试管壁，并且会使
血小板集聚，在离心中沉积到红细胞中，使富含血小板血浆中的血小板数目减少。

水蛭素和 PPACK通过抑制凝血酶的活性来抗凝，它们可以维持生理性浓度的钙离子，而某些实验中正需要这种浓度，但水蛭素的价格非常昂贵无法常规使用。

血小板聚集
到目前为止评价血小板功能最常见的方法是测定血小板的聚集功能，抗凝血在离心力135g 离心 15 分钟，制备富含血小板血浆〔PRP〕。

如果可能，血小板计数应当标准化〔如在浓度
为 250× 109/ l时测定〕,这可以通过参加少血小板血浆来实现。

1 毫升〔或毫升〕PRP 在37℃参加到装有金属磁棒的玻璃试管中，在聚集仪中磁棒以1100rpm 转动，通过比色计记录
穿过 PRP的光强度。

大多数诱导剂参加后，血小板形态由片状转变为圆形，形成伪足，引起短暂的光透过率的下降，然后由于血小板聚集，光透过率大幅度增加。

光透过率增加的速度
和程度会被记录下来。

致聚剂主要为ADP，肾上腺素，胶原蛋白，花生四烯酸，TTXA2的类似物如 U46619，或凝血酶受体活化肽如SFLLRN。

〔凝血酶不能作为PRP的促凝剂，因为会引起凝结〕。

正常情况下枸橼酸抗凝的PRP，对高浓度致聚剂反响的聚集程度，与TXA2的形成，颗粒内容物的分泌和血小板外表P- 选择素的形成有关。

低血小板计数会影响血小板聚集试验，如果PRP中血小板计数低于100× 109/l结果就不可靠。

如果是脂血，也不能进行此试验。

如果血小板改变了形态，但不能与所有的致聚剂发生聚集，那么其原因可能是罕见
的Glanzmann 血小板减少症。

与胶原蛋白或凝血酶相比， ADP是弱的致聚剂，在枸橼酸抗凝的PRP中，低浓度 ADP只引起初步的，不完全的，可逆的聚集。

但当浓度高于1-3 μ M时，初级的血小板聚集将不可逆，
而且紧接着会引起第二相不可逆的过程〔图 1〕。

这个两相血小板聚集过程依赖TXA2的形成。

高浓度 ADP情况下，这两相聚集过程会融合，形成一个平滑的曲线〔图1〕，类似于胶原蛋白或凝血酶的刺激效果。

药物，如阿司匹林，会抑制TXA2的形成，阻碍了ADP介导的第二相聚集过程。

在生理性的钙离子介质中，只会发生第一相的聚集反响。

ADP诱导聚集严重减弱，以及胶原蛋白和凝血酶诱导聚集受损，提示为罕见的P2Y12ADP受体异常。

噻氯匹定和 clopidogrel通过此受体作用，产生类似的对ADP诱导选择性抑制。

弱的致聚剂，肾上腺素〔5-10uM〕，可聚集 PRP中的血小板，而不改变血小板的形态，但肾
上腺素的致聚作用并不一致。

如果服用了阿司匹林或其它抑制TXA2形成的药物，血小板对
任何浓度的肾上腺素都不反响，不会产生聚集。

胶原纤维〔 1-5 μ g/ml 〕会引起特征性滞后〔可达 1 分钟〕的血小板聚集 , 聚集需要 TXA2形成和颗粒内容物的分泌，而且根本上是不可逆的。

虽然血小板形态发生了变化，但是阿司匹林及其它抑制 TXA2 形成的药物可以阻断低浓度的胶原蛋白引起的聚集反响。

罕见的GPVI 缺陷症表现为血小板受胶原蛋白刺激后并不发生聚集，但在受到其它致聚剂的刺激后通常会
发生聚集。

花生四烯酸可以转变为TXA2，因此可作为聚集剂。

阿司匹林和其它可以抑制环氧化酶的药
物具有抑制作用。

但是TXA2的类似物 U46619，却可以在此类抑制剂的存在状况下产生聚集
作用。

在罕见的环氧化酶缺失的病人，花生四烯酸不诱导血小板聚集，但U46619 会引起血小板的聚集。

SFLLRN(TRAP)具有凝血酶的诱导血小板强聚集作用的功能，只有当TXA2形成障碍时，这一作用才会稍有减弱。

分泌缺陷，特别是致密颗粒缺少ADP的增强作用，会造成异常的聚集，即存在正常的第一相
过程，而无第二相过程。

分泌缺陷时低浓度的胶原蛋白和SFLLRN诱导血小板聚集会减弱。

瑞托霉素聚集血小板
这一试验同样用聚集仪对枸橼酸抗凝的 PRP进行测试。

抗生素瑞托霉素可作为致聚剂，终浓度常
见为 ml 。

正常的样本是第一相聚集后紧接着会发生第二相聚集。

缺乏反响提示为
Bernard-Soulier综合症或VWF缺乏。

全血血小板聚集
用阻抗血小板聚集仪可测定稀释的抗凝全血的血小板聚集功能。

将两个电极插入样本中，当有电流通过时，血小板会粘附到电极上。

然后添加致聚剂加以搅拌，在电极上的血小板周围
血小板聚集，记录阻抗变化的速率和幅度。

这一试验的优点在于不用制备PRP，而且脂血中的血小板功能也可测量，但不适合血小板计数极低的病人。

血小板功能分析仪－100
Dade Behring血小板功能分析仪〔PFA－100〕是微处理器控制的仪器，它可定量测定高切
变力下血小板和血小板相关的止血功能。

试验过程为枸橼酸抗凝血加到装有一次性试验管的
槽内〔要求 4 小时内血样〕，预温到37℃，然后利用真空吸力使血样通过一个直径200μ m 的不锈钢毛细管和直径为150μ m的硝酸纤维膜微孔，膜上包被胶原蛋白和肾上腺素〔CEPI〕或胶原蛋白和ADP〔 CADP〕。

在 5000-6000/s的高切变和诱导剂的作用下，血小板产生聚集，阻碍血液穿过微孔，堵塞微孔的时间称为终止时间〔CT〕，最大测定值为300 秒。

血小板最
初通过 GPIb/IX/V和VWF间的相互作用以及GPIa/IIa,VWF的直接连接粘附到膜上的胶原蛋
白上导致聚集，而不是由纤维蛋白原连接到活化血小板的GPIIb/IIIa引起聚集。

的枸橼酸钠抗凝时得到的 CT值比浓度为枸橼酸钠抗凝 CT值要大，因此选择适宜的抗凝剂浓度是
非常重要的。

PPACK也可用作抗凝剂。

仅在 CEPI 管 CT时间延长，可能是轻微的遗传性血小板功能缺陷〔如贮存池异常〕和阿司匹
林抑制。

CEPI 管和CADP管 CT 时间均延长，可能为严重的遗传性血小板功能障碍〔如Glanzmann 血小板机能不全和Bernard-Soulier综合症〕和VWD。

实际上PFA-100 是有效的
筛选 VWD的手段，特别是 1 型－ VWD，而且对妇女月经过多及儿童的鼻出血疑心有血小板异
常或 VWD进行鉴别是非常有用的。

它同时有利于监测 1 型－ VWD患者对 DDAVP的反响和PTCA 患者对 GPIIb/IIIa拮抗剂的反响，也可用于评估血库提供的浓缩血小板质量和血小板输注
的效果。

PFA-100 具有操作简单，快速，重复性好，全血用量少的优点。

血小板计数少于
和红细胞比容＜ 25％时会引起 CT时间延长。

50× 109/L Ultegra快速血小板功能检测
Accumetrics 快速血小板功能实验〔RPFA〕提供了一种简单，快速，准确的血小板功能检测
方法，它用于床边监测接受GPIIb/IIIa拮抗剂的患者。

枸橼酸钠抗凝全血采集后，马上取
样本加到有 2 个样本通道的一次性试管中。

通过由微处理器驱动的钢珠运动，血液与血小板
致聚剂〔 iso-S 〕 FLLRN和纤维蛋白原包被的聚苯乙烯珠混匀70 秒，检测样本的透光强度。

激活的血小板和包被纤维蛋白原的珠子之间发生凝集，沉入底部，引起光透过率的增加。

凝集的速度和强度可用血小板凝集单位〔PAU〕计算，当有GPIIb/IIIa拮抗剂存在， PAU值会迅速下降，这是因为凝集发生与活化血小板上的未被阻断的GPIIb/IIIa受体成正比关系。

RPFA用来监测 GPIIb/IIIa拮抗剂 abciximab, tirofiban,eptifibatide和 orofiban 对血小板的阻断效果。

锥板分析仪
Varon 及其同事开发了锥板分析仪〔CPA〕，在高切变力的条件下使用锥板粘度计检测血小板
的粘附和聚集。

这一装置通过锥体的旋转在板外表产生均一的切变压力引起层流。

的枸橼酸
钠抗凝全血加到聚苯乙烯板上，以1800/s 切变速度旋转 2 分钟，随后染色。

图形分析仪分
析粘附的血小板和血小板聚集，可提供大小分布的的直方图，外表覆盖的百分比(SC) 和平均
大小 (AS) 。

血小板粘附到聚苯乙烯板上依赖于板上包被的VWF和纤维蛋白
原，GPIIb/IIIa ，
GPIb/IX/V 以及血小板的激活。

CPA可快速确定先天性和获得性的血小板缺陷及VWD，也可测试抗血小板疗效和确定血小板功能亢进患者的血栓前形成状态。

CPA的优点在于快速，简单，只需全血。

颗粒内容物分泌的检测
发光聚集仪可同时检测血小板聚集和 ATP〔一种致密颗粒的组成局部〕的释放。

用荧光素酶检
测 ATP，ATP的浓度参照正常人 PRP和 ATP浓度制备的标准曲线进行计算。

参加诱导剂，检测已标记血小板的14C-5- 羟色胺的分泌状况可指示致密颗粒的分泌情况。

当诱导分泌内容物时，α颗粒跨膜蛋白 P- 选择素会出现在血小板的外表，这可通过流式细胞仪
检测〔见〕。

血小板第 4 因子〔 PF4〕和β－血小板球蛋白是血小板特异性蛋白，贮存于α颗粒，在血小
板激活时释放。

可用放射性免疫方法测定，但应注意静脉穿刺对结果影响比拟大。

花生四烯酸的发动和血栓烷B2 的形成
在正常情况下，诱导剂可将花生四烯酸从血小板的磷脂层中发动出来，并通过血小板转变为
血栓烷 B2。

血栓烷 B2 是一种稳定的复合物，可通过商用的放射性免疫测定法和酶免法来测
定。

流式细胞术
流式细胞术可快速检测抗凝血、稀释全血、PRP、人工介质中悬浮的少量血小板。

使用全血
可以防止操作过程中血小板被激活。

通常血小板与联接不同光谱的荧光素的两种单克隆抗体〔MoAbs〕反响。

为确定血小板的特异性，第一个MoAb特异性针对 GPIb,IIb或 IIIa，并在近饱和溶液中使用。

为确定血小板上的抗原决定簇，血小板还与另一标记MoAb反响。

这种MoAb 特异性针对表位，也在饱和溶液中使用。

与抗体孵育后，稀释样本以1000-100 ， 000细胞 /min 的速度在流式细胞仪上检测。

聚焦激光束在其相应的吸收光谱内激发了联接的荧
光。

血小板通过标识的荧光素以及前向角和侧向角的特性进行确认。

第二个单抗发出的荧光强弱与某一抗原决定簇的密度成正比，并可通过获取上千个血小板来计数。

这些数据均可用软件来分析。

因为激发光谱有局部被重叠，每一混合荧光需设置补偿。

如果抗原决定簇的表达随着时间而变化〔如膜GPs 的滑动〕，着色前血小板可先用1％的多聚甲醛固定，它不干扰抗体结合。

如果不是立即进行流式细胞仪检测，血小板也可在参加着
色剂后再固定〔原理同上〕。

许多荧光素标记的抗体及非抗体源的探针均可标记血小板抗原决定簇。

MoAbs除可以和未被活化血小板的 GPs 结合外，某些激活依赖MoAbs 可检测 GPs 构象变化〔如 PAC1 可检测GPIIb/IIIa 〕或颗粒膜蛋白表达〔如抗P－选择素〕。

非抗体探针包括PKH亲脂性膜染料，可用链亲和素标记荧光检测的生物素和用于检测血小板活化促凝外表的暴露情况的荧光标
记的 annexin V 。

流式细胞仪可有效评估离体血小板活化程度及评价体外使用致聚剂后血小板的敏感性。

它用来检测某些病程中血小板的活化情况，如不稳定心绞痛，急性心肌梗死，顽固冠心病，初期子痫，外周血管病，脑血管缺血和冠状动脉血管成形术。

流式细胞仪还被用来监测血库提供
的浓缩血小板的质量，因为保存期内血小板会有所变化。

遗传性血小板膜GP 缺陷如Glanzmann 血小板机能不全和Bernard-Soulier综合症也可通过流式细胞仪检测。

虽然流式细胞仪检测需要复杂的设备和试剂，但它有不少优点：只需微量的样本〔5μ l 〕，
可检测血小板减少的样本、全血和血小板亚群。

血小板促凝外表的表达
活化血小板外表的PS可使用荧光标记的annexin V通过流式细胞仪检测〔见上〕，也可选择发色凝血酶原酶实验测定促凝外表凝血酶的产生情况。

3总结
血小板在血管严重损伤时止血栓的形成，血管损伤处及动脉粥样硬化斑块破裂处凝块的形成
中起重要作用。

血小板功能检测的主要目的在于确定止血受损时异常出血的原因。

同时它也被用来监测血小板高活性状态，以及估计血栓形成倾向的可能性。

进行血小板功能检测，抽血及处理时应非常仔细，并使用适宜的抗凝剂。

最常见的血小板功能检测方法是测定PRP 中参加 ADP、胶原蛋白，肾上腺素，花生四烯酸等致聚剂后血小板的聚集功能；对特定致聚
剂的聚集反响有缺陷说明特定途径中血小板活性受损。

阻抗聚集仪检测全血中的聚集功能不
需要处理血液。

目前有多种快速，自动和只需少量样本的检测方法：PFA-100，能提供在高切变力作用下血小板及其相关的止血功能；RPFA用来评估使用GPIIb/IIIa拮抗剂的治疗效果； CPA利用锥板粘度计在高切变力下测定血小板的粘附和聚集功能。

除检测血小板的聚集
功能外，还可检测血小板的释放功能，包括颗粒内容物的分泌，凝血烷的形成和促凝外表的
表达等。

流式细胞仪采用荧光标记的抗体和非抗体源探针检测血小板的活性或体内血小板的
激活状态。

虽然需要复杂的仪器，但它的优点在于使用微量的样本和检测血小板亚群。

参考文献〔略〕。