氯沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老作用机制的研究

氯沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老作用机制的
研究
焦素敏;傅淑霞;温丽颖;闫喆;李绍梅
【摘要】目的探讨氯沙坦对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的人肾小球系膜细胞(HMCs)衰老的作用及其可能机制.方法将HMCs随机分为对照组、AngⅡ组和氯沙坦干预组.衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色鉴别细胞衰老变化,流式细胞术分析细胞周期及3组细胞中活性氧(ROS)水平的变化,并采用蛋白免疫印迹法对
p53、p21蛋白的表达情况进行检测.结果AngⅡ可以诱导HMCs衰老,氯沙坦干预后,SA-β-gal染色阳性细胞百分率、G0/G1期细胞比例、ROS水平及p53、p21蛋白表达水平均低于AngⅡ组(P＜0.05).结论 p53/p21信号通路参与调控AngⅡ诱导的HMCs衰老过程,氯沙坦可能通过改变该通路的表达,减轻氧化应激而发挥其抗衰老的作用.
【期刊名称】《解放军医药杂志》
【年(卷),期】2018(030)004
【总页数】4页(P1-4)
【关键词】肾疾病;氯沙坦;肾小球系膜细胞;氧化应激;p53/p21通路
【作者】焦素敏;傅淑霞;温丽颖;闫喆;李绍梅
【作者单位】050000石家庄,河北医科大学第二医院肾内科;050000石家庄,河北医科大学第二医院肾内科;050000石家庄,河北医科大学第二医院肾内科;050000
石家庄,河北医科大学第二医院肾内科;050000石家庄,河北医科大学第二医院肾内
科
【正文语种】中文
【中图分类】R692
肾脏功能随年龄增长而下降，衰老是肾脏疾病进展的重要风险之一。

目前导致肾脏衰老的机制仍未完全清楚，在众多调控因素中氧化应激与肾素-血管紧张素系统(RAS)起着重要作用[1]。

血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)为RAS系统的主
要效应因子，已证实AngⅡ可以刺激内皮细胞、血管平滑肌细胞和血管成纤维细
胞过氧化物的产生，导致氧化应激[2-4]。

氧化应激是造成衰老的主要因素之一，
其中自由基和活性氧(ROS)在生物大分子的氧化中起着重要的作用[5]，抑制氧化应激及AngⅡ受体信号途径可减轻年龄相关的高血压和代谢异常[6]。

氯沙坦为
AngⅡ的Ⅰ型受体拮抗剂,可阻断AngⅡ与其Ⅰ型受体结合,从受体水平拮抗其生物学效应,从而降低肾小球毛细血管内压,改善肾血流动力学异常,缓解早期的高滤过、高灌注状态,减少尿蛋白,保护肾功能。

既往研究证明，氯沙坦能够改善老年冠心病
患者内皮功能[7]，可以抑制结缔组织生长因子(CTGF)、纤溶酶原激活物抑制物-
1(PAI-1)的表达,抑制细胞外基质的积聚,从而延缓D-半乳糖致大鼠肾脏的衰老[8]，而在急性冠状动脉综合征患者中，氯沙坦可减轻微粒诱导的内皮细胞的衰老[3]。

氯沙坦作为AngⅡ的Ⅰ型受体拮抗剂，在各种原发及继发肾脏疾病中广泛应用，
然而其是否可以减轻系膜细胞的衰老，及其可能的作用机制尚不清楚。

本研究通过本课题组前期所建立的人肾小球系膜细胞衰老模型,即：培养至5～8代的细胞，用10-6 mol/L AngⅡ刺激72 h[9]，观察氯沙坦对AngⅡ诱导的人肾小球系膜细胞(HMCs)衰老的影响,细胞内ROS的变化,并测定p53、p21蛋白的表达,探讨氯沙坦
保护HMCs衰老的作用机制。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂 HMCs购于美国Sciencen公司。

细胞在系膜细胞专用培养基(MsCM, ScienCell, USA)中培养，培养至5～8代的细胞用于实验。

氯沙坦(德国Merck公司)，AngⅡ(美国Sigma公司),细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)
染色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒和ROS检测试剂盒(中国碧云天)。

小鼠抗人多
克隆抗体β-actin,p21,兔抗人多克隆抗体P53(美国Santa Cruz)。

1.2 实验分组和处理对照组:在不含AngⅡ的MsCM培养液中培养；Ang组:10-6 mol/L AngⅡ刺激细胞72 h；氯沙坦+AngⅡ组:AngⅡ加入前l h加入10-5
mol/L氯沙坦培养72 h。

AngⅡ和氯沙坦的刺激浓度和时间由前期实验所得[9]。

1.3 SA-β-gal染色各组细胞培养72 h后，PBS清洗细胞1次，按试剂盒说明书
进行操作，染色后于37℃无CO2培养箱中孵育过夜，衰老的细胞染色后呈蓝绿色，镜下随机选取6个视野分别计数衰老细胞数和总细胞数，计算SA-β-gal阳性细胞的百分率。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期各组细胞培养72 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。

60 g/min离心5 min，弃去培养液，PBS洗2次。

加入70%冷
乙醇4℃固定过夜，离心去乙醇。

PBS洗2次后，悬浮于0.5 ml PBS中，分别加
入RNaseA和PI 4℃避光显色30 min上流式细胞仪对细胞周期进行检测及分析。

1.5 流式细胞仪检测细胞内ROS 参照碧云天试剂盒说明书操作，即按1∶1000用无血清培养液稀释荧光探针DCFH-DA，使终浓度为10 μmol/L。

各组细胞收集
后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为1×106～2×108/ml，37℃细胞培
养箱内孵育20 min。

每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

用
无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

流式细胞仪检测细胞内ROS水平。

1.6 蛋白免疫印迹法检测p53、p21蛋白表达各组细胞培养至相应时间后，提取
细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白加含β-巯基乙醇的上样缓冲液，并于沸水中煮5 min，用12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
进行分离。

电泳后电转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭，加兔抗人p53多克隆
抗体(1∶400)，鼠抗人多克隆抗体β-actin(1∶500)，p21(1∶200)4℃摇床过夜，
1×TBST洗膜3次，加二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶8000)，山羊
抗鼠IgG(1∶8000)孵育杂交，室温2 h,将ECL(增强化学发光)试剂盒中的A液和
B液等量混合，滴加于膜上，反应1 min后，在发光仪上发光。

1.7 统计学方法应用SPSS 13.0统计学软件，计量资料以均数±标准差表示，采用方差分析。

α=0.05为检验水准,两两比较采用t检验。

2 结果
2.1 细胞SA-β-gal染色变化对照组、AngⅡ处理组和氯沙坦干预组SA-β-gal染
色阳性细胞百分率分别为(13.03±0.96)%、(80.64±1.34)%、(29.37±0.78)%。

对照组和氯沙坦干预组SA-β-gal染色阳性细胞百分率低于AngⅡ处理组，差异有统计学意义(P<0.01)。

见图1。

2.2 细胞周期变化对照组、AngⅡ处理组和氯沙坦干预组G0/G1期细胞比例分别为(52.81±2.53)%、(77.18±1.11)%和(60.6±0.80)%。

对照组、氯沙坦干预组
G0/G1期细胞比例低于AngⅡ处理组，差异有统计学意义(P<0.01)。

见图2。

图2 3组人肾小球系膜细胞细胞周期变化A.对照组；B.AngⅡ处理组；C.氯沙坦干预组
2.3 细胞内ROS水平变化AngⅡ处理组人肾小球系膜细胞ROS水平高于对照组
和氯沙坦干预组(P<0.05)。

见图3。

图3 3组人肾小球系膜细胞细胞内活性氧含量变化A.对照组；B.AngⅡ处理组；C.
氯沙坦干预组
2.4 p53和/p21蛋白表达水平的变化AngⅡ处理组p53和/p21蛋白较对照组增高，氯沙坦干预组低于AngⅡ处理组，差异有统计学意义(P<0.05)。

见图4。

图4 3组人肾小球系膜细胞p53和/p21蛋白表达水平A.对照组；B.AngⅡ处理组；
C.氯沙坦干预组
3 讨论
许多年龄相关疾病(age-related disease， ARD)包括心脑血管疾病、神经退行性变、肾脏疾病等发病率也在逐年增高。

其中肾脏是受年龄影响比较明显的器官之一，肾小球滤过率(GFR)随年龄增长每年下降0.40～1.02 ml/min[10],老年肾脏疾病正逐渐成为影响人们健康和社会发展的主要疾病，因此研究肾脏衰老机制及研发干预药物具有重要意义。

关键细胞的衰老是器官和组织衰老的病理基础，肾小球系膜细胞作为肾脏重要的固有细胞，其表型和功能的改变在肾脏衰老进程中必然发挥着重要的作用。

多数正常细胞在体外培养时不能无限传代，而是经过一个时期的增殖后，分裂速度降低，最后停止，对任何有丝分裂原无反应，称为“复制性衰老”。

有研究报道，正常细胞在各种应激下，如DNA损伤、氧化应激、癌基因激活等，可以快速进入衰老，称为“应激性衰老”[11]。

有关衰老机制的假说和理论众多，如基因功能紊乱、线粒体损伤和干细胞耗竭等[12]。

然而，目前最公认的衰老学说之一仍是氧化应激学说。

在正常情况下，机体处于氧化与抗氧化的动态平衡状态，从而保护机体免受损伤。

随着年龄增长或在外界有害刺激因素下，机体内ROS的数量会显著增多，造成脂质过氧化反应，引起机体内包括蛋白、核酸等的氧化损伤，对细胞功能和活性造成损害，可以说衰老是自由基损伤性效应的综合结果[13-14]。

多种分子通路参与调
控衰老的过程，如MAPK/NF-kB通路、抑癌基因PTEN、Klotho蛋白等[15-17]，但是现公认各种诱发细胞衰老的信号最后主要通过p53-p21-PRb途径和p16-
PRb途径导致衰老[18]，细胞衰老后具有细胞周期阻滞于G0/G1期、SA-β-gal
表达增加等特征性改变。

p53蛋白不仅是重要的细胞周期、凋亡调节因子，还是细胞衰老过程中重要的调
节因子，能感知衰老相关信号的刺激，如端粒缩短、DNA损伤等。

p53被激活时结合到DNA特殊的序列上并增强其下游靶基因的表达。

p53活化的一个主要效应分子就是p21，p21蛋白为广谱的细胞周期蛋白,是依赖于细胞周期蛋白激酶(CDK)的抑制物，p21水平上调可抑制CDK2和CDK4的活性,使其不能磷酸化视网膜母细胞瘤抑制蛋白(Rb)，Rb是CDK4-6/D激酶的主要底物，处于非磷酸化或低磷酸化形式的Rb可与转录因子E2F结合，屏蔽其转录激活结构域，抑制其转录活性，而后者能激活重要的细胞周期蛋白E和A，启动DNA复制，从而抑制了从G1期进入S期所需的下游基因的表达，使细胞周期停滞[16]。

有研究证实，RAS系统参与器官衰老过程[19-20],血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)可降低肾小球内压和蛋白尿，减轻局灶节段性肾小球硬化和间质纤维化。

氯沙坦作为血管紧张素受体拮抗剂经典药物之一，广泛用于各种肾脏疾病，但对于其在肾小球系膜细胞衰老中的作用报道尚少。

本实验应用AngⅡ刺激HMCs，成功建立HMCs衰老模型，衰老细胞中p53、
p21蛋白表达增多，说明p53/p21通路参与了AngⅡ诱导的HMCs的衰老过程，应用氯沙坦干预后，细胞内ROS水平降低，p53、p21表达下降，提示氯沙坦可
能通过减轻氧化应激，调控p53/p21通路而延缓HMCs的衰老过程，为临床应用氯沙坦治疗衰老相关性肾脏疾病提供了理论依据,但是具体应用到临床还有待于基
础研究的进一步深入和大规模的临床实验来证实。

另外，至于P16-PRb通路是否也参与了AngⅡ诱导的HMCs的衰老过程亦需要进一步证实。

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