RP-HPLC法测定人血浆中拉米夫定的浓度

RP-HPLC法测定人血浆中拉米夫定的浓度
朱旭;孙亚欣;邱枫;何晓静;赵明明;肇丽梅
【摘要】目的建立测定人体内拉米夫定血药质量浓度的RP-HPLC法.方法以氢氯噻嗪为内标,血样经质量浓度15％三氯醋酸沉淀蛋白,二氯甲烷反提后,采用乙腈-5 mmol·L-1庚烷磺酸钠(浓磷酸调pH3.5)(体积比为14∶86)为流动相,经Agilent Eclipse XDB C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm)分离,流速为1.0 mL·min-1,柱温为25℃,检测波长为275 nm.结果拉米夫定在10.00 ～5 000.00 ng·mL-1线性关系良好,最低定量限为10.00 ng·mL-1,低、中、高质量浓度提取回收率分别为
78.92％、78.29％和77.37％,日内、日间RSD均在±15％之间.结论本方法操作简单、快速、灵敏、准确,可用于拉米夫定体内药动学和生物等效性研究.
【期刊名称】《广东药学院学报》
【年(卷),期】2013(029)005
【总页数】3页(P494-496)
【关键词】高效液相色谱法;血药浓度;拉米夫定
【作者】朱旭;孙亚欣;邱枫;何晓静;赵明明;肇丽梅
【作者单位】中国医科大学附属盛京医院药学部,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院药学部,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院药学部,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院药学部,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院药学部,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院药学部,辽宁沈阳110004
【正文语种】中文
【中图分类】R945
拉米夫定(lamivudine，3TC)是第2代核苷类抗逆转录病毒药物(NRTIs)，在细胞
内代谢为其活性形式5′-三磷酸拉米夫定，主要通过作用于病毒逆转录时的链终止而发挥药理作用，临床上用于治疗慢性乙型病毒性肝炎和HIV感染[1]。

目前，国
内外文献报道测定该药浓度的血样预处理方法多为固相萃取法或蛋白沉淀法[2-4]。

采用固相萃取法的成本较高，而蛋白沉淀法内源性干扰较大且不能获得较高的灵敏度。

因此，本文采用三氯醋酸沉淀蛋白法，并增加了二氯甲烷反提步骤减少内源性物质干扰，建立了拉米夫定血药浓度测定的RP-HPLC法,考察了24名健康男性受试者单剂量口服拉米夫定片后的药动学特征，为临床合理用药提供参考。

1 仪器与试药
Agilent 1100 系列高效液相色谱工作站(配有四元泵，紫外检测器和Agilent 1200自动进样器)，美国Agilent公司。

拉米夫定对照品(质量分数：99.7%，批号：101007-200701，中国食品药品检定研究院)；内标氢氯噻嗪对照品(质量分数：99.8%，批号：100309-201103，中
国食品药品检定研究院)；拉米夫定片(规格：0.3 g，批号：R503147，英国Glaxo Wellcom Operations)；乙腈、甲醇、二氯甲烷均为色谱纯；三氯乙酸、
庚烷磺酸钠、H3PO4、NaOH均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Agilent Eclipse XDB C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-5 mmol·L-1庚烷磺酸钠(浓H3PO4调节pH 3.5)体积比为14∶86；流速：1.0
mL·min-1；检测波长：275 nm；柱温：25 ℃。

2.2 溶液的配制
精密称取拉米夫定对照品10.03 mg，置10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，配
制成1.00 mg·mL-1的拉米夫定储备液。

取拉米夫定储备液适量，用水稀释制成
拉米夫定质量浓度为0.10、0.30、1.00、3.00、10.00、30.00、50.00 μg·mL-1
的系列标准溶液，再配制质量浓度分别为0.30、3.00、30.00 μg·mL-1的拉米夫
定水溶液作为质控溶液。

精密称取氢氯噻嗪10.02 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成1.00 mg·mL-1的储备液。

取氢氯噻嗪储备液适量，用甲醇稀释成质量浓度为
20.00 μg·mL-1的溶液，备用。

2.3 血浆样品的预处理
取300 μL血浆于1.5 mL具塞塑料尖底试管中，补加30 μL水，加入内标氢氯噻
嗪溶液30 μL和质量浓度15%三氯醋酸100 μL，涡旋混合1 min，10 000 r·min-1离心5 min，定量取上清液300 μL，加入1 mol·L-1NaOH溶液20
μL(控制pH 值2～3)，涡旋混合5 s，定量加入300 μL二氯甲烷，涡旋混合1 min，10 000 r·min-1离心5 min，取上清液室温进样50 μL。

2.4 方法学专属性考察
分别取空白血浆、添加拉米夫定标准溶液以及内标的空白血浆和受试者血样，按“2.3”项下测定，记录色谱图，典型的血样色谱图见图1。

可见，空白血浆中内
源性物质不干扰样品以及内标的测定，拉米夫定以及内标的分离度良好，保留时间分别为7.66 min和5.57 min。

A.空白血浆；
B.空白血浆+对照品+内标；
C.受试者口服拉米夫定片后的血浆样品；
1.内标氢氯噻嗪;
2.拉米夫定。

图1 拉米夫定血浆样品色谱图Figure 1 Chromatograms of lamivudine
2.5 标准曲线和最低定量下限
取空白血浆300 μL，精密加入拉米夫定标准系列溶液适量，配制成相当于血浆质
量浓度为10.00、30.00、100.00、300.00、1 000.00、3 000.00、5 000.00 ng·mL-1的拉米夫定标准血浆样品，按“2.3”项下操作，取50 μL进行分析，以待测物的质量浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权
(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程Y=7.320×10-
4X+3.267×10-3，r=0.999 1，血浆中拉米夫定的线性范围为10.00～5 000.00 ng·mL-1，定量下限为10.00 ng·mL-1。

2.6 准确度与精密度
分别制备质量浓度为30.00、300.00、3 000.00 ng·mL-1拉米夫定血浆样品作为低、中、高浓度质控(QC)样品，每浓度6样本，连续测定3 d。

根据当日工作曲线，计算QC样品的测得浓度，根据QC样品结果计算本法的准确度与精密度，结果显示低、中、高3个质量浓度溶液的日内精密度分别为6.67%、1.65%、
2.85%，日间精密度分别为1
3.51%、1
4.88%、6.71%。

2.7 提取回收率
取低、中、高质量浓度QC样品，每浓度6样本。

同时另取空白血浆300 μL，按“2.3”项下操作，向提取后的空白血浆样品中加入拉米夫定质控溶液和内标溶液
各30 μL，涡流混合，配制成相应浓度的样品，经空气吹干复溶后进样分析获得相应峰面积，以每一浓度2种处理方法的峰面积比值计算拉米夫定低、中、高3个
质量浓度提取回收率，分别为(78.92±2.29)%、(78.29±0.45)%和(77.37±1.19)%，内标的提取回收率为(50.40±2.12)%。

2.8 稳定性考察
取低、中、高质量浓度QC样品，每浓度3样本，分别考察提取前室温放置4 h、
提取后室温放置24 h、-20 ℃反复3次冻融和-20 ℃冷冻放置1个月的稳定性，
结果在上述条件下样品的测定值和理论值的相对误差(RE)均在±15%以内，表明拉米夫定血样在以上各条件下均保持稳定。

2.9 临床应用
经中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准，招募健康受试者并签署知情同意书。

选择24名男性健康受试者，年龄为(25.54±3.09)岁，体质量为(67.42±6.37)kg，体质量指数为(22.03±1.51)kg·m-2，禁食10 h后，于第2日清晨空腹给予拉米
夫定片300 mg。

于服药前(0 h)和服药后0.33、0.67、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0、36.0、48.0 h，取前臂静脉血4 mL，置肝素抗凝
管中，3 500 r/min离心8 min，分离血浆，-20 ℃保存备用。

血浆样品按“2.3”项下操作，进样50 μL，以随行的标准曲线计算血浆样品中拉米夫定浓度。

24名
受试者平均血药浓度-时间曲线见图2。

主要药动学参数Cmax、tmax、t1/2、AUC0-t和AUC0-∞分别为(3 028.48±749.42 )ng·mL-1、(1.26±0.77) h、
(7.06±3.97)h、(12 180.19±2 420.25)ng·h·mL-1和(12 303.44±2
432.22)ng·h·mL-1。

图2 24名受试者口服拉米夫定片300 mg后平均血药质量浓度-时间曲线图Figure 2 Mean plasma concentration time curve of lamivudine in 24 healthy volunteers after oral administration of 300 mg lamivudine tablet
3 讨论
本研究采用离子对试剂庚烷磺酸钠作为流动相，与文献[3-4]报道的KH2PO4和醋酸铵流动相相比，能够较好地改善色谱条件，获得良好的峰型，同时该流动相不易结盐，对色谱柱损伤较小。

本研究还首次选取氢氯噻嗪作为内标物，该内标提取回收率稳定且与样品分离度良好。

本研究采用了三氯醋酸沉淀蛋白的方法进行血浆样
品的提取，在方法摸索阶段发现，酸沉淀后的上清液再经NaOH回调pH后直接
进样，在11 min和20 min处存在2个杂质峰，通过增加二氯甲烷反提步骤可以去除上述2个杂质峰，从而缩短了进样的时间，该提取方法样品回收率在高、中、低浓度均稳定在78%左右，重现性好，操作简便，适用于大批量样本的测定。

临床上用于治疗成人慢性HBV感染的拉米夫定常用剂量为100 mg/d，而治疗HIV感染常用给药剂量为300 mg/d。

本研究采用300 mg给药剂量获得的健康
人的主要药动学参数中，Cmax、tmax、AUC0-∞与文献[3-4]报道的基本一致，
为拉米夫定在抗HIV感染临床应用方面提供了参考数据。

本研究建立了测定人血浆中拉米夫定浓度的HPLC法，方法简单、快速、灵敏、
专属性强，可用于拉米夫定体内药动学和生物等效性研究。

参考文献:
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