HPLC法同时测定猴头菇提取物中3种核苷

HPLC法同时测定猴头菇提取物中3种核苷
汪杨丽;陈晓虎;王慧;苏晶
【摘要】目的:建立高效液相色谱法同时测定猴头菇提取物中尿苷、鸟苷和腺苷的含量.方法:采用WelchUltimate AQ C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-0.05 mol· L-1磷酸二氢钾溶液,梯度洗脱;检测波长为260 nm.结果:尿苷、鸟苷、腺苷的线性范围分别为0.034 43～0.688 6 μg(r=1)、0.022 26～0.445
1μg(r=1)、0.026 93 ～0.538 6μg(r =0.999 9),尿苷、鸟苷、腺苷的平均回收率(n=6)分别为97.6％(RSD=2.0％)、96.3％(RSD=1.0％)、96.3％ (RSD =0.8％).结论:该方法简便、准确、可行,可为猴头菇提取物的生产和使用提供质量评价依据.【期刊名称】《中国现代中药》
【年(卷),期】2016(018)010
【总页数】4页(P1341-1343,1346)
【关键词】猴头菇提取物;核苷;高效液相色谱法
【作者】汪杨丽;陈晓虎;王慧;苏晶
【作者单位】重庆市食品药品检验检测研究院重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心,重庆401121;重庆市食品药品检验检测研究院重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心,重庆401121;重庆市食品药品检验检测研究院重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心,重庆401121;重庆市食品药品检验检测研究院重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心,重庆401121
【正文语种】中文
猴头菇为齿菌科猴头菌Hericum erinaceus(Bull.)Pers.的子实体[1]，为药食两用
的真菌，入药能助消化、利五脏、促进肠胃功能，并能提高人体的免疫力[2]。

猴
头菇含有多糖、核苷化合物、氨基酸等成分。

有关猴头菇多糖[1，3-4]的提取及含量测定的研究较多，戚雁飞[5]仅对猴头菇中腺苷进行确认和含量测定。

猴头菇提
取物是猴头菇子实体的水浸提液以10∶1的比例干燥浓缩干燥而得。

本试验参考
相关文献，采用高效液相色谱法，应用梯度洗脱测定猴头菇提取物中的尿苷、鸟苷、腺苷的含量。

结果表明，该方法简便、准确、重复性好，可作为猴头菇提取物的质量控制方法之一，为猴头菇保健品和药品的进一步开发利用提供质量评价依据。

1.1 仪器
Waters 2695-2489高效液相色谱仪系统；Bp221s 型电子天平(赛多利斯科学仪
器有限公司)；Ax205电子天平(梅特勒公司)；KQ-500DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；3-30KS离心机(德国Sigma公司)。

1.2 试药
尿苷对照品、鸟苷对照品(SIGMA公司，批号分别为1181124,101474373);腺苷
对照品(中国食品药品检定研究院，批号为110879-200202)；猴头菇提取物(纽西兰安发保健品有限公司)；乙腈、甲醇为色谱纯；水为超纯水。

2.1 色谱条件
Welch Ultimate AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱；乙腈为流动相A，0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液为流动相B，梯度洗脱，见表1；检测波长为260 nm；体积流量为1.0 mL·min-1；柱温为40 ℃；进样量为10 μL。

2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取尿苷、鸟苷、腺苷对照品适量，加水溶解，制成尿苷对照品储备液(质量浓度为0.430 4 mg·mL-1)、鸟苷对照品储备液(质量浓度为0.556 4 mg·mL-1)和腺苷对照品储备液(质量浓度为0.336 6 mg·mL-1)。

精密量取鸟苷对
照品储备液1 mL，尿苷和腺苷对照品储备液各2 mL，同置25 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，即得混合对照品溶液,冷藏保存。

2.3 供试品溶液的制备
取猴头菇提取物适量，研细，混匀，取约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min(功率：450 W，频率：50 Khz)，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，离心10 min(7000 r·min-1)，取上清液10 mL，蒸干，残渣加水溶解，转移至25 mL量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 专属性试验
分别精密吸取对照品、供试品溶液及水各10 μL，按上述色谱条件进行测定。

结果供试品色谱中，在与尿苷、鸟苷、腺苷对照品相同的保留时间处均有吸收峰，而水液在此保留时间无干扰，见图1。

2.5 线性关系考察
取2.2项下的混合对照品溶液，按上述色谱条件，分别进样1、5、10、15、20 μL测定。

以进样质量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得尿苷、鸟苷、腺苷回归方程分别为Y=2×106X-5 650.1(r=1)、Y=2×106X-7 488.5(r=1)、Y=3×106X-10 816(r=0.999 9)。

结果表明，尿苷、鸟苷、腺苷分别在0.034 43～0.688 6、0.022 26～0.445 1、0.026 93～0.538 6 μg线性关系良好。

2.6 精密度试验
取2.2项下的尿苷、鸟苷、腺苷混合对照品溶液，连续进样5次，每次10 μL，测定峰面积，结果尿苷、鸟苷、腺苷峰面积的RSD分别为0.04%、1.0%、0.06%,表明精密度良好。

2.7 稳定性考察
取同一批号样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12
h进样10 μL，测定峰面积，计算尿苷、鸟苷、腺苷的峰面积RSD分别为0.08%、
1.7%、1.5 %，表明供试品溶液至少在12 h内稳定。

2.8 重复性考察
取同一批号样品，按2.2项方法分别制备6份供试品溶液，分别测定尿苷、鸟苷、腺苷的含量，6次重复测定结果的RSD分别为0.76%、0.98%、1.7%。

2.9 加样回收率试验
分别精密量取尿苷对照品溶液(0.326 4 mg·mL-1)2.3 mL、鸟苷对照品溶液(0.476 4 mg·mL-1)1.0 mL、腺苷对照品溶液(0.336 6 mg·m L-1)1.7 mL，置锥形瓶中(平行6份)，置水浴上蒸干，加入已知含量的样品(尿苷质量分数为2.8 mg·g-1、鸟
苷质量分数为1.6 mg·g-1、腺苷质量分数为2.0 mg·g-1)约0.3 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表2。

2.10 样品的测定
取3批猴头菇提取物，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，用外标法计算，结果见表3。

3.1 提取方法的选择
试验中选用了体积分数为20%、50%、70%甲醇作为提取溶剂，进行超声提取，
结果表明，70%甲醇提取的样品充分，杂质少。

比较超声20、30、40 min样品
中各组分的提取率，发现30 min提取效率高。

核苷类成分水溶性较好，若采用甲醇-水混合溶液溶解样品，易造成色谱峰分叉，故选用70%提取液蒸干后用水溶解。

3.2 流动相的选择
参考相关文献[6-8]，分别采用甲醇-水、甲醇-磷酸缓冲盐(pH=6.5)、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾等作为流动相体系，梯度洗脱。

结果表明，本试验使用的流动相体系能使供试品色谱图基线平稳，色谱峰分离度好、峰形尖锐、对称性好、保留
时间适宜，且方法的重复性好。

3.3 供试品溶液终浓度的选择
3批样品的三苷含量较高，考虑到药材质量的波动可能使供试品溶液进样量超出线性范围，因此供试品提取后最终用水溶解并定容至25 mL，其较定容至10 mL更合理。

不同批次猴头菇提取物之间尿苷、鸟苷、腺苷的含量较稳定，表明三苷可以作为一个稳定的控制因子，为猴头菇提取物提供质量分析指标。

【相关文献】
[1] 贾联盟，刘柳，董群，等.猴头菇子实体中的主要多糖成分[J].中草药，2005，36(1)：10-12.
[2] 杜鹃，王琰.猴头菇种7种金属元素含量分析[J].微量元素与健康研究，2010，27(1)：46-47.
[3] 猴梁华，李雪华，陆亚春.猴头菇多糖提取工艺研究[J].食品与机械，2006，22(1)：35-38.
[4] 张帅，沈楚燕，董基.酶法提取猴头菇多糖的研究[J].河南工业大学学报(自然科学版)，2010，
31(2)：76-79.
[5] 戚雁飞.HPLC测定复方猴头胶囊中腺苷的含量[J].中成药，2002，24(3)：181-183.
[6] 孙忠华，肖建辉，迟强，等.高效液相色谱法测定三种虫草发酵液与菌丝体核苷化合物含量[J].天然产物研究与开发，2014，26(12)：2000-2003.
[7] 颜栋林.HPLC法测定冬草夏草胶囊中腺苷含量[J].药学实践杂志，2010，28(4)：293-294.
[8] 武彦舒，周丹蕾，鄢丹.天然虫草与虫草菌丝体的HPLC指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2008，33(19)：2212-2214.。