MMP-9在中耳胆脂瘤中的表达和意义

MMP-9在中耳胆脂瘤中的表达和意义
叶放蕾;朱丽雅;崔艳红;郝少娟
【摘要】目的研究基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase,MMP-9)在中耳胆脂瘤上皮中的表达,并探讨其与中耳胆脂瘤的血管形成以及胆脂瘤侵蚀行为的关系.方法采用免疫组织化学SP法检测MMP-9、Ⅳ型胶原蛋白在44例患者中耳胆脂瘤组织标本与10例正常外耳道组织中的表达.结果 MMP-9在胆脂瘤上皮各层均有表达,在外耳道皮肤中为弱阳性表达;胆脂瘤基质周围微血管计数均数高于正常外耳道皮肤,二者差异具有统计学意义(P＜0.05);MMP-9在胆脂瘤中的表达与周围微血管计数间呈正相关关系.结论 MMP-9可能在中耳胆脂瘤血管生成中起重要作用.
【期刊名称】《听力学及言语疾病杂志》
【年(卷),期】2008(016)005
【总页数】3页(P412-414)
【关键词】中耳胆脂瘤;基质金属蛋白酶-9;微血管密度
【作者】叶放蕾;朱丽雅;崔艳红;郝少娟
【作者单位】郑州大学第一附属医院耳鼻喉科,郑州,450052;郑州大学第一附属医院耳鼻喉科,郑州,450052;郑州大学第四附属医院耳鼻喉科;郑州大学第一附属医院耳鼻喉科,郑州,450052
【正文语种】中文
【中图分类】R764.21
胆脂瘤型中耳炎是一种发生于中耳的常见慢性疾病，其特征是中耳乳突腔内过度增殖的角化鳞状上皮，以及邻近骨质的破坏和对听力的损害。

胆脂瘤对人体的危害与其对周围正常组织的侵袭能力有关，这种异常过度增殖的上皮需要有丰富的血管系统支持，研究胆脂瘤中新生血管的形成有助于了解胆脂瘤的侵袭机制。

本文通过对基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase,MMP-9)在中耳胆脂瘤中的表达情况进行研究，探讨其与中耳胆脂瘤的血管形成以及胆脂瘤侵蚀行为的关系，报告如下。

1 材料与方法
1.1 材料
44例胆脂瘤组织标本均取自郑州大学第一附属医院2004年6月～2005年6月后天继发性胆脂瘤型中耳炎手术患者，术后HE染色均确诊为胆脂瘤，其中，男25例，女19例，年龄17～62岁，平均41.7岁。

另取10例外耳道正常皮肤组织作为对照。

所有标本常规甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后备用。

1.2 试剂
兔抗人MMP-9多克隆抗体、鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体、浓缩型DAB显色试剂、SP试剂盒等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 检测方法
取两组石蜡标本，制备成4 μm厚连续切片，采用免疫组织化学SP法，切片常规脱腊，梯度酒精脱水，其后步骤分别以兔抗人MMP-9多克隆抗体、鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体为一抗，严格按照SP法试剂盒的要求进行。

用已知的阳性片作阳性对照，用PBS液代替一抗作阴性对照，以排除非特异性着色。

1.4 结果判定
1.4.1 MMP-9以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性,Ⅳ型胶原蛋白以血管内皮细胞或基底膜出现棕黄色颗粒为阳性，通过光镜目测将染色强度分为弱阳性(淡黄色)、中等阳性(棕色)和强阳性(棕褐色)。

1.4.2 采用Biosens彩色病理图像分析系统，于200倍视野下每张切片选取5个代表部位对MMP-9阳性细胞表达的灰度进行定量分析，并取其平均值。

1.4.3 微血管计数方法按照Weidner法，先在低倍镜下全面观察切片以确定上皮下基底膜周围1 mm内血管密度最高区，在200倍视野下计算5个最高密度区的微血管密度(MVD)，并取其均数。

1.5 统计学处理
应用SPSS11.0统计软件进行统计分析。

两组间均数比较采用成组资料t检验，指标间的相互关系采用Spearman等级相关分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果
2.1 MMP-9在胆脂瘤组织及正常外耳道皮肤中的表达(图1、2)
MMP-9阳性产物主要定位于细胞浆，在胆脂瘤上皮各层细胞均有表达，从基底层至角质层染色逐渐增强，胆脂瘤上皮下结缔组织中可见散在的阳性细胞。

正常外耳道皮肤组织为弱阳性表达。

MMP-9在胆脂瘤组织中的平均灰度值为
119.60±14.20,在正常外耳道皮肤组织中的平均灰度值是154.73±6.93，两组间差异有统计学意义(t=11.46,P<0.05)。

2.2 Ⅳ型胶原蛋白在胆脂瘤组织及正常外耳道皮肤中的表达(图3、4)
图1 MMP-9在胆脂瘤上皮的阳性表达(SP×100) 图2 MMP-9在外耳道皮肤的弱阳性表达(SP×100)图3 Ⅳ型胶原蛋白在胆脂瘤上皮的表达(SP×100) 图4 Ⅳ型胶原蛋白在外耳道皮肤的表达(SP×100)
胆脂瘤组织中见新生的微血管较丰富、密集，且在形态上表现出异常的改变，包括管腔扩大、囊状改变、窦状改变、血管扭曲等。

正常外耳道皮肤组织中的微血管较
少、较稀疏，没有明显的形态学上的改变。

胆脂瘤组织平均MVD为37.85±3.93
个/mm2，正常外耳道皮肤组织平均MVD为13.28±2.58个/mm2,两组间差异有统计学意义(t=18.81,P<0.05)。

2.3 胆脂瘤中MMP-9与MVD之间的关系
经Spearman等级分析，胆脂瘤组织中MMP-9与MVD之间存在正相关关系
(r=0.533,P<0.05)。

3 讨论
基质金属蛋白酶(MMPs)是一组在结构上具有极大同源性、能降解细胞外基质蛋白的内肽酶的总称，因含金属锌离子和钙而得名，在体内可由多种基质细胞和炎症细胞分泌，在组织重建与修复、炎症反应、肿瘤血管生成及侵袭转移中发挥重要作用[1]。

根据其作用底物的特异性和敏感性分为三类：间质胶原酶、明胶酶和间质溶
解素。

MMP-9是明胶酶的一种，其作用底物主要是Ⅳ型胶原蛋白和明胶。

许多实验表明，活性角质细胞具有合成及分泌基质金属蛋白酶的功能。

Shonermark等[2]发现MMP-2、9的表达局限于胆脂瘤上皮的基底层和基底上层，而在肉芽组织中，则未见阳性着色。

祝威等[3]研究表明MMP-2和MMP-9在胆脂瘤上皮的各层细
胞均有表达，基底膜染色最强，其表达强度明显高于外耳道皮肤。

本实验发现MMP-9在胆脂瘤上皮各层细胞均有表达，从基底层到角质层染色逐渐增强，研究结果不一致，可能原因是胆脂瘤标本处理方式不同或抗体来源不同。

胆脂瘤上皮下结缔组织中可见散在的阳性细胞，Eriko等[4]的研究结果也显示胆脂瘤基质细胞有MMP-9阳性表达。

血管系统的生成有两种途径，即血管发生和血管生成。

当组织受到缺氧、炎症、机械压力等刺激时，局部组织中的血管生长因子表达增加，同时参与血管生成的细胞表面受体表达也增加。

各种生长因子与其受体结合后启动细胞内的信号传导系统，产生一定的生物学效应，促使新生血管的生成。

Anniko等(1981年)报道，与正常
外耳道皮肤相比，胆脂瘤基质血管很丰富。

Sudhof等[5]研究发现胆脂瘤基质周围的微血管密度分别是鼓膜、外耳道上皮的4.3倍和3.2～4.0倍，微血管密度、炎
症程度与被研究血管因子密切相关。

陈雄等[6]研究发现随着炎症程度的不断增加，胆脂瘤基质周围血管形成增多，并观察到主要是小血管占优势，这进一步证实中耳胆脂瘤新生血管的形成和微循环的建立。

本实验结果显示胆脂瘤组织中平均微血管密度高于正常外耳道皮肤，胆脂瘤组织有更活跃的血管生成活性，与上述实验结果一致。

新生血管形成是一个连续的过程，包括内皮细胞的活化增殖，基质降解及新生血管分化成熟阶段，其中关键一步是血管内皮细胞周围的蛋白水解、基质重塑，这对毛细血管内皮细胞的迁移、增殖及毛细血管腔的生成必不可少。

在血管生成因子如VEGF、FGF、TGF的刺激下，微静脉内的血管内皮细胞产生多种蛋白水解酶，包
括MMPs及纤溶酶原激活因子，降解微静脉周围的基底膜，进而毛细血管出芽，管腔生成，这一系列连续过程都伴随着蛋白水解活动，MMPs在此过程中发挥着
重要作用，其中MMP-9主要参与基底膜主要成分Ⅳ型胶原蛋白及明胶的降解。

人们已经在一系列体内外实验中证实了MMP-9表达与肿瘤血管生成的密切关系。

Riedel等[7]报道MMP-9阳性表达的头颈肿瘤的微血管密度远高于MMP-9阴性表达者。

本实验结果说明MMP-9的表达与胆脂瘤的血管生成之间也存在着密切
关系。

经等级相关分析发现，MMP-9与MVD之间呈正相关关系，说明MMP-9可能促进胆脂瘤中新生血管的形成。

4 参考文献
1 Kleiner DE,Stetler-Stevenson WG.Matrix metalloproteinase and metastasis[J]. Cancer Chemother Pharmacol,1999,43:42.
2 Schonermark M,Mester B,Kempf HG，et al.Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human cholesteatomas[J]. Acta
Otolaryngol,1996,116:451.
3 祝威，谢燕，王苹，等.两种基质金属蛋白酶在胆脂瘤和中耳癌中的表达[J].中华耳鼻咽喉科杂志,2001,36:119.
4 Eriko S. Stromal expression of matrix metalloproteinase-9 in middle ear cholesteatoma[J]. Am J Otol,2000,21:621.
5 Sudhof H,Dazert S,Gonzales A，et al.Angiogenesis and angiogenic growth factors in middle ear cholesteatoma[J].Am J Otol,2000,21:793.
6 陈雄，孔维佳.血管内皮生长因子在中耳胆脂瘤中的表达及其临床意义[J].中华耳科学杂志,2004,2:129.
7 Riedel F,Gote K,Schwalb J,et al.Expression of 92-kDa type N collagenase correlates with angiogenic makers and poor survival in head and neck squamous cell carcinoma[J].Int J Oncol,2000,17:1 099.。