一种胚胎干细胞的提取和分离方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910873703.8
(22)申请日 2019.09.17
(71)申请人 广州北斗生物科技有限公司
地址 510700 广东省广州市黄埔区瑞和路
39号G1座224至226、G2座224至226号
(72)发明人 朱瑜　
(51)Int.Cl.
C12N 5/0735(2010.01)
C12N 5/071(2010.01)
(54)发明名称一种胚胎干细胞的提取和分离方法(57)摘要本发明公开了一种胚胎干细胞的提取和分离方法，包括如下步骤：S1、切除哺乳动物的卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床；S2、发育4-6天后，由子宫冲取胚泡进行培养，结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；S3、ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代，获得胚胎干细胞样集落。

本发明采用组织培养法提取和分离胚胎干细胞，通过将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落，解决了现有的胚胎干细胞分离方法难度高，容易损伤细胞，影
响胚胎干细胞分离的问题。

权利要求书1页 说明书3页CN 112522182 A 2021.03.19
C N 112522182
A
1.一种胚胎干细胞的提取和分离方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、切除哺乳动物的卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床；
S2、发育4-6天后，由子宫冲取胚泡进行培养，结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；
S3、ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代，获得胚胎干细胞样集落。

2.根据权利要求1所述的一种胚胎干细胞的提取和分离方法，其特征在于：所述步骤S1中取小鼠3-5天的囊胚。

3.根据权利要求1所述的一种胚胎干细胞的提取和分离方法，其特征在于：所述步骤S1中取猪9-10天的囊胚或羊7-8天的囊胚。

4.根据权利要求1所述的一种胚胎干细胞的提取和分离方法，其特征在于：所述步骤S1中取牛6-7天的桑葚胚或早期囊胚。

5.根据权利要求1所述的一种胚胎干细胞的提取和分离方法，其特征在于：所述步骤S3中将原始胚胎干细胞悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上进行培养。

6.根据权利要求5所述的一种胚胎干细胞的提取和分离方法，其特征在于：所述胚胎干细胞培养1周后，发现典型的胚胎干细胞集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，进行传代培养，3-5天传代培养1次，经反复传代培养，获得生长旺盛的高纯度胚胎干细胞。

权　利　要　求　书1/1页CN 112522182 A
一种胚胎干细胞的提取和分离方法
技术领域
[0001]本发明涉及胚胎干细胞分离技术领域，具体为一种胚胎干细胞的提取和分离方法。

背景技术
[0002]胚胎干细胞是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞。

它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。

胚胎干细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。

体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。

用碱性磷酸酶染色，ES 细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。

[0003]现有的胚胎干细胞分离多采用免疫外科学方法和显微外科学方法，由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。

[0004]综上所述，现有的胚胎干细胞分离方法难度高，容易损伤细胞，影响胚胎干细胞的分离，为此，我们提出一种胚胎干细胞的提取和分离方法。

发明内容
[0005]本发明的目的在于提供一种胚胎干细胞的提取和分离方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

[0006]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种胚胎干细胞的提取和分离方法，包括如下步骤：
S1、切除哺乳动物的卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床；
S2、发育4-6天后，由子宫冲取胚泡进行培养，结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；
S3、ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代，获得胚胎干细胞样集落。

[0007]优选的，所述步骤S1中取小鼠3-5天的囊胚。

[0008]优选的，所述步骤S1中取猪9-10天的囊胚或羊7-8天的囊胚。

[0009]优选的，所述步骤S1中取牛6-7天的桑葚胚或早期囊胚。

[0010]优选的，所述骤S3中将原始胚胎干细胞悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上进行培养。

[0011]优选的，所述胚胎干细胞培养1周后，发现典型的胚胎干细胞集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，进行传代培养，3-5天传代培养1次，经反复传代培养，获得生长旺盛的高纯度胚胎干细胞。

[0012]与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用组织培养法提取和分离胚胎干细胞，通过将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞
群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落，解决了现有的胚胎干细胞分离方法难度高，容易损伤细胞，影响胚胎干细胞分离的问题。

具体实施方式
[0013]下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0014]本发明提供一种技术方案：一种胚胎干细胞的提取和分离方法，包括如下步骤：S1、切除哺乳动物的卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床；
S2、发育4-6天后，由子宫冲取胚泡进行培养，结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；
S3、ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代，获得胚胎干细胞样集落。

[0015]实施例一：
S1、取小鼠3-5天的囊胚，切除哺乳动物的卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床；
S2、发育4-6天后，由子宫冲取胚泡进行培养，结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；
S3、ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，将原始胚胎干细胞悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上进行培养，培养1周后，发现典型的胚胎干细胞集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，进行传代培养，3-5天传代培养1次，经反复传代培养，获得生长旺盛的高纯度胚胎干细胞。

[0016]本技术方案采用组织培养法提取和分离胚胎干细胞，通过将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落，解决了现有的胚胎干细胞分离方法难度高，容易损伤细胞，影响胚胎干细胞分离的问题。

[0017]实施例二：
S1、取猪9-10天的囊胚，切除哺乳动物的卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床；
S2、发育4-6天后，由子宫冲取胚泡进行培养，结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；
S3、ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，将原始胚胎干细胞悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上进行培养，培养1周后，发现典型的胚胎干细胞集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，进行传代培养，3-5天传代培养1次，经反复传代培养，获得生长旺盛的高纯度胚胎干细胞。

[0018]本技术方案采用组织培养法提取和分离胚胎干细胞，通过将胚泡接种在饲养层
上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落，解决了现有的胚胎干细胞分离方法难度高，容易损伤细胞，影响胚胎干细胞分离的问题。

[0019]实施例三：
S1、取羊7-8天的囊胚，切除哺乳动物的卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床；
S2、发育4-6天后，由子宫冲取胚泡进行培养，结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；
S3、ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，将原始胚胎干细胞悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上进行培养，培养1周后，发现典型的胚胎干细胞集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，进行传代培养，3-5天传代培养1次，经反复传代培养，获得生长旺盛的高纯度胚胎干细胞。

[0020]本技术方案采用组织培养法提取和分离胚胎干细胞，通过将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落，解决了现有的胚胎干细胞分离方法难度高，容易损伤细胞，影响胚胎干细胞分离的问题。

[0021]实施例四：
S1、取取牛6-7天的桑葚胚或早期囊胚，切除哺乳动物的卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床；
S2、发育4-6天后，由子宫冲取胚泡进行培养，结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；
S3、ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，将原始胚胎干细胞悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上进行培养，培养1周后，发现典型的胚胎干细胞集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，进行传代培养，3-5天传代培养1次，经反复传代培养，获得生长旺盛的高纯度胚胎干细胞。

[0022]本技术方案采用组织培养法提取和分离胚胎干细胞，通过将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落，解决了现有的胚胎干细胞分离方法难度高，容易损伤细胞，影响胚胎干细胞分离的问题。

[0023]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。