肽结合力与稳定性试验相关知识

本科生毕业设计相关内容课题背景知识：++对靶
CD8CD8CTL(CytotoxieTlymphoeyteepitopes)T细胞免疫应答中起重要作用。

类分子结合的特异性抗细胞发挥杀伤作用，必须能识别靶细胞表面与相应MHC-I表位。

课题组已经根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，原表位，即CTL初步筛选到表CTL表位进行了预测分析，2对蛋白抗原的HLA-A＊/ HLA-A3限制性细胞结合力以及稳定性试验，对初步筛选的表位进行验证，获取与T2位。

通过HLA 分子具有高结合力的表位，用于后续体外免疫活性检测。

一、T2细胞结合力实验相关文献
（一）理论知识
1 什么是T2细胞? T2细胞是内源性抗原提呈途径中必需的抗原多肽转运蛋白(TAP)缺陷的细胞株[1] ，为HLA-A
2 阳性的T, B 淋巴细胞杂交瘤细胞，可用于研究抗原递呈过程和T细胞与MHC-分子的相互识别[2] 。

2 为什么要做结合力试验? MHC-I类分子与CTL表位的有效结合是特异性细胞免疫应答的一个重要环节。

因为个体内仅存在少数几个型别的MHC-I类分子，由于每个MHC-I类分子可与一系列同种类的抗原肽结合.进而形成多种多样的MHC-肽复合物，这样就使机体免疫系统可以针对众多抗原发生特异性的免疫应答。

另外，在细胞外游离肽浓度近乎为零的环境中，MHC-I类分子还必须使相+ T 细胞对它的识别。

应的抗原肽在细胞表面保留足够长的时间，实现特异性CD8有文献报道[1] 绝大多数CTL表位以高或中等亲和力与MHC-I类分子有效结合。

3 什么是T2细胞结合力实验? 由于T2其自身不能提呈抗原肽到HLA-I类分子上，所以T2细胞表面空载的HLA-A2分子表达极不稳定，表达后很快降解。

但当有外源性抗原肽与之结合后，HLA-A2的表达就被稳定。

抗原肽与HLA-A2的结合力越强，则T2细胞表面HLA-A2分子的降解就越少，表现为表达量越高。

T2表面HLA-A2分子表达量的增加直观地反映了外来抗原肽与HLA-A2的结合力[1] 。

4怎么设计候选表位肽T2细胞的结合力实验?（1）阳性对照，文献中报道的
大家公认的与T2细胞有强的结合力的多肽；（2）阴性对照，单纯的PBS；（3）背浓、A细胞的结合力的判定依据：T2）肽与4（细胞；T2不用多肽冲击的景对照，
度对比法来表示待测肽与HLA的相对亲和力(RA)。

RA=诱导HLA表达20%的待测肽的浓度/诱导HLA表达20%的阳性肽的浓度，RA值越小，肽与HLA的亲和力越强[3-4] 。

B、间接免疫荧光法检测各肽与HLA-A2.1分子的结合情况。

外源性多肽与T2细胞表面MHC I类分子的结合可使其表面MHC I类分子的表达量增加，两者结合越稳固，可检测到的MHC I类分子越多，最终以平均荧光强度为检测指标，以荧光系数（FI）作为衡量指标[1-2, 5]。

尽管不同的文献报道的FI的算法略有差别。

（二）具体实验方法
1 Measurement of peptide relative affinity (RA) for HLAA*0201.
（1）Briefly, T2 cells were incubated with various concentrations of peptides (0.1–100μM) for 16 hours and then stained with the mAb BB7.2to quantify the
surface expression of HLA-A*0201. For each peptide concentration, the
HLA-A*0201-specific staining was calculated as the percentage of the staining obtained with 100 μM of the reference peptide HIVpol589 (IVGAETFYV). The RA is determined as the ratio between the concentration of each peptide and the concentration of the reference peptide that induces 20% of HLA-A*0201
expression[4] 。

5 cells/ml) were incubated x10with various concentrations of （2）T2 cells (3 peptides ranging from 100 to 0.1 μM in serum-free RPMI 1640 medium supplemented with 100 ng/ml human β2m at 37°C for 1
6 h. Cells were then washed
twice and stained with the BB7.2 mAb, followed by FITC-conjugated goat anti-mouse Ig mAb to quantify the expression of HLA-A*0201. For each peptide concentration,
the HLA-A*0201-specific staining was calculated as the percentage of the staining obtained with 100 μM of the reference peptide HIVpol589 (IVGAETFYV). The relative
affinity (RA) is determined as: RA =concentration of each peptide that induces 20%
of HLA-A*0201-expression/concentration of the reference peptide that induces 20%
of HLA-A*0201 expression. The definitive RA value for each peptide was determined from at least three independent experiments[3] 。

2 间接免疫荧光法检测各肽与HLA-A2.1分子的结合情况
6次后，3，洗涤6 min离心800r/min 、PBS细胞用冰T2的l/m1x10首先将）1
（
o C共孵育4h。

孵育好的细胞用冰的候选肽37PBS，同样离心条件洗再与10μg/ml 涤3次，加入100μl BB7.2 杂交瘤细胞培养上清液，冰浴40min。

PBS洗涤3次，加入100μl 1:100 稀释的二抗FITC标记的羊抗鼠IgG溶液，在冰上孵育40min，洗涤后于流式细胞仪检测平均荧光强度，波长488nm。

阳性已知肽MAGE-2作为112-120阳性对照，未加肽刺激的单纯T2细胞为背景对照。

荧光系数（FI）=(样本
平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度[5]。

6个T2 细胞用冰PBS, 800r/min离心6 min, ）首先将1x10洗涤3 次后, 再与
（2o C 共孵育4 h. 孵育好的细胞用冰PBS, 同样离心条件洗涤3710 ?g/ml 待测
肽3
次, 加入100 ?L BB7.2 杂交瘤细胞培养上清液, 冰浴40 min. PBS 洗涤3 次后,
加入100 ?L 稀释度为1:100 的FITC-羊抗鼠IgG溶液, 在冰上孵育40 min, 洗涤
后于流式细胞仪(FACS)检测平均荧光强度, 波长488 nm. 以单纯的T2 细胞加二
抗为阴性对照, T2 细胞加一二抗为背景对照。

荧光系数(FI) =（样品平均荧光强度-背景平均荧光强度）/（T2细胞荧光强度-背景荧光强度) ×100[2] 。

6/ml，铺于洗三次后，调细胞浓度至1 x 10）首先收集T2细胞，用冰PBS （30C 37、微球蛋白于g/ml的(β96孔板中，10μl/孔。

再与50μM的候选多肽，2.5 μ25% CO孵箱中共孵育18h。

之后，收集孵育好的细胞，用冰PBS洗三遍，
加入2μl 2FITC标记的HLA-A2特异性的mAb BB7.2，放置4℃冰箱，孵育30min，之后PBS洗三遍，接着用流式细胞仪检测平均荧光强度。

用已经证明的
HLA-A*0201限制+CTL表位肽SSp-1作为阳性对照，多肽OVA性CD8作为阴性对照，未加肽257-264刺激的单纯T2细胞作为背景对照。

结果判定:以荧光系数(FI)作为衡量指标。

荧光系数(FI)=（样本平均荧光强度一背景平均荧光强度）/
背景平均荧光强度。

多肽的FI> 1被认为是高亲和力的表位[1] 。

（4）T2 cells were incubated for 3 h in humidified 5% CO chamber at 37°C with
2each peptide. Anti-HLA-A2.1 monoclonal antibody, BB7.2, was added in saturating amount and incubated for 30 min at 4°C. After two wash steps with cold PBS,
2 fragments of goat anti-mouse IgG fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled
F(ab)were added and incubated for another 30 min at 4°C. The cells were washed twice
with cold PBS and fluorescence was measured on a FACScan flow cytometer。

The fluorescence index was calculated by the formula: FI=(mean fluorescence of
T2-mean
of fluorescence background)/(mean of fluorescence sample-mean
fluorescence of background)x100[6] 。

（5）T2 cells were incubated with 50 μM of the synthesized peptides and 3 μg/ml
of human β2-microglobulin in serum-free RPMI 1640 medium for 16 h at 37°C/5% CO2. Expression of HLA-A*0201 on T2 cells was then determined with FACS Calibur Xow cytometer by staining with anti–HLA-A2 Ab derived from BB7.2 and
FITC-labeled
goat-antimouse IgG used as the second antibody. The data were analyzed using CellQuest software. The Xuorescence index (FI) was calculated as follows: FI = (mean FITC Xuorescence with the given peptide-mean FITC Xuorescence without peptide)/(mean FITC Xuorescence without peptide). Samples were measured in three replications.[7]
（6）我们实验室所做的T2细胞结合力试验：待测肽(50 μg/ml) 加入含β微2球蛋白(3 μg/ml) 的无血清RPMI1640培养基中37 ℃共孵育18h-24 h后，冷PBA洗涤3次，加100 μl稀释度为1:200的一抗（T2A2细胞加单克隆抗体BB7.2，T2A3细胞加单克隆抗体鼠抗人β-M），4 ℃放置30 min。

冷PBA洗涤3次后，加50 μl稀释度2为1：50的FITC-羊抗鼠IgG溶液，4 ℃放置30 min，洗涤后于流式细胞仪检测。

另外,已被鉴定的Flu matrix(GILGFVFTL)和Flu NP (ILRGSVAHK)在该实验中265-27358-66
分别作为T2A2 和T2A3 的阳性肽，PBS作为阴性对照。

结果用荧光系数(FI) 表示：荧光系数(FI) = (表位肽平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度。

如果FI>1.5，说明候选肽与HLA-A*0201/03具有强结合力；1.5>FI>1.0中等结合力；：FI<0.5：弱结合力（阴性结果）[8] 。

总结（）：上述红色部分为各文献中的差异部分 1 在备选的两种T2细胞结合力实验方法中，优先选择第二种，即间接免疫荧光法。

因为我们实验室以前采取的也是这种方法，已经有一定的实验基础，并且实验结果也比较明显。

我认为关于低亲和力候选表位的改造可以考虑第二种方法，因为其直观性比较强。

2 关于用间接免疫荧光法检测候选肽与HLA结合力的实验设计方面：
A、不同的文献报道了不同的荧光系数算法，甚至是同一个实验室同一作者（样本平均(FI)=，但大多偏向于如下算法：荧光系数[2, 5] 的不同报道均有差别
荧光强度一背景平均荧光强度）/背景平均荧光强度，因此，我们也采取这种算法。

B、关于荧光系数的大小与亲和力的判断（即临界值的选取），不同的文献报道的也不一样，一般最低设为1.2。

C、关于背景对照的设置，文献报道趋于一致，即未加任何肽刺激的单纯T2细胞。

3 为保证结果的可靠性，每次实验必须设至少3个重复。

二、T2稳定性相关试验
根据经典免疫学理论，CD8+ CTL识别的是HLA-肽复合物，机体要想最大限度地激发免疫应答的级联反应，不仅要求候选肽与HLA结合以保证CTL的识别；而且要求它们要稳定性的结合，以避免因复合物存在的时间过短而导致的无效免疫监视。

因此，从实验设计方面，稳定性实验数据必不可少。

本实验室方法：
肽/HLA-I复合物稳定性分析
待测肽(50 μg/mL)加入含β2微球蛋白(3 μg/mL)的无血清RPMI1640培养基中37 ℃共孵育18 h后，冷PBA洗涤4次，洗净未结合的肽。

加入10 μg/mL的BrefeldinA
孵育1 h，洗涤。

37 ℃，5%CO孵育0、2、4、8 h。

然后，冷PBA洗涤3次，加2一抗（T2A2细胞加单克隆抗体BB7.2，T2A3细胞加单克隆抗体鼠抗人β-M），4 ℃2放置30 min，冷PBA洗涤3次后，加FITC-羊抗鼠IgG溶液，4 ℃放置30 min，
洗涤后于流式细胞仪检测。

结果以DC（即肽/HLA-I复合物的半衰期）表示。

50。