荧光光谱基础知识

荧光光谱基础知识
荧光光谱(Fluorescence Spectroscopy )
韩荣成(10303023)
北京⼤学,03级⽣物医学⼯程
⼀、背景知识：
1.荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。

除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X 射线荧光等。

在很多情况下，分⼦从激发态回到基态过程中，能量通过热量等形式散失到周围。

但是在某些情况下，能量能以光⼦发射的形式释放出来。

分⼦的能量状态在光学分析中涉及的分⼦能量有：E 0=Ee+Ev+Er ，其中Ee:价电⼦运动能（electron ）； Ev ：原⼦在平衡位置的振动能（vibration ）；Er ：分⼦绕其重⼼的转动能（rotation ）。

Ee ⼤
约为1eV 数量级；Ev ⼤约为10－1～10－2 eV ；Er ⼤约为10－4～10－5eV 数量级，
可见⊿Ee>⊿Ev>⊿
Er
分⼦吸收能量后，处于激发态的分⼦通过⾮辐射过程丢失能量，⾸先到达S1的最低振动能
级，这⼀过程称为内转换（internal conversion）,发⽣在10－11s内。

从S1的最低振动能级以光⼦形式放出能量⽽回到基态的不同振动能级，这⼀过程称为荧光
（fluorescence）,发⽣在10－9s内；如果以⾮辐射的形式丢失能量则称为淬灭
（quenching）。

如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出⽐
荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。

磷光产⽣的机制与荧光是不同的，虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第⼀电⼦激发态的最低振动能级的分⼦直接释放出光⼦回到基态的结果，⽽是从某种能量低于第⼀电⼦激发态的最低振动能级的另⼀种亚稳能级?三重态向基态的各振动能级以辐射⽅式产⽣跃迁时发出的光。

所谓三重态或三线态，是指分⼦中电⼦⾃旋量⼦数S=1，即原来两个配对的⾃旋
⽅向相反的电⼦之⼀⾃旋⽅向改变，以⾄电⼦⾃旋之和不为0的情况。

处于第⼀电⼦激发态最低振动能级的分⼦，有可能通过⽆辐射跃迁(系间交连，intersystem crossing)消耗部分能量，其中⼀个电⼦的⾃旋⽅向倒转，从⽽处于三线态。

从三线态的最低振动能级向基态的各振动能级跃迁并释放出光⼦，则其发光为磷光。

由于三线态的电⼦⾃旋和不为零，这种跃迁是⼀种被禁跃迁，即跃迁⼏率很⼩。

这样，
在三线态停留的时间即寿命就⽐较长(从10-3秒到数秒)，强度很弱。

由于三线态能
量低于第⼀电⼦激发态最低振动能级，因此磷光的波长⽐荧光长。

⼆、荧光光谱：
荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。

激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作
⽤下测得的某⼀波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某⼀固定波长的激发光作⽤下荧光强度在不同波长处的分布情况，
也就是荧光中不同波长的光
成分的相对强度。

激发谱既然是表⽰某种荧光
物质在不同波长的激发光作
⽤下所测得的同⼀波长下荧
光强度的变化，⽽荧光的产⽣
⼜与吸收有关，因此激发谱和
吸收谱极为相似，呈正相关。

由于激发态和基态有相似的
振动能级分布，⽽且从基态的
振动能级跃迁到基态各振动能级的⼏率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系.λex:maximum excitation wavelength; λem(λax): maximum emissio
wavelength
最低振动能级跃迁到第⼀电⼦激发态各振动能级的⼏率与由第⼀电⼦激发态的最低n
2.荧光光谱仪和主要谱参数
2．1荧光光谱仪
荧光谱仪结构上的最主要特点是⼊射的激发光与荧光探测⽅向垂直。

1. 光源：现在多⽤氙灯，氙灯在200-800nm范围内具较好的发射谱。

2. ⼊射光单⾊器：⼊射光单⾊器是⽤来选择特定波长的单⾊光，⼊射到样品上。

荧光分光度计中采⽤光栅作为单⾊器。

激发波长择描就是靠它来改变波长。

3. 监视探测器：这个探测器⽤来监测光源的恒定性。

4. 光闸：光闸关闭时，⼊射光被挡住，不能照到样品上，这样可以防⽌样品长期受到照射⽽产⽣化分解。

另外，在打开样品室的盖时，关上光闸，可以防⽌读数过⼤，给图笔撞击端部。

5. 样品杯：样品杯是10mm×10mm的⽯英杯，四⾯透明，且⽤去荧光⽯英材料制成。

注意荧光样品杯不能⽤紫外谱仪中的样品杯代替。

6. 发射光单⾊器：⽤来选择⼀定波长的光进⼊探测器测量。

发射光择描就是⽤它来实现的。

7. 计算机辅助记录系统：⽤以完成绘图及荧光强度的测量。

2.2主要的谱参数
2．2．1荧光寿命(fluorescence lifetime)
去掉激发光后，分⼦的荧光强度降到激发时最⼤荧光强度的1/e所需要的时间，称为荧光寿命，常⽤τ表⽰:
τ=1/k――――――（1）
证明：I t=I 0e-kt
其中I 0是激发时最⼤荧光强度，I t是时间t时的荧光强度，k是衰减常数。

假定在时τ时测得的I t为I 0的1/e，则τ是我们定义的荧光寿命。

01I e
I t = 则有：τ=1/k
如果激发态分⼦只以发射荧光的⽅式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射的速率常数成反⽐，速率常数即为单位时间中发射的光⼦数，因此有τF
=1/K F 。

K F 是速率常数。

τF 表⽰荧光分⼦的固有荧光寿命，k F 表⽰荧光发射过程的衰减常数。

如果除荧光发射外还有其它释放能量的过程 (如淬灭和能量转移)，则寿命τ还和这些过程的速率常数有关，结果是荧光寿命降低。

由于吸收
⼏率与发射⼏率有关，τF 与摩尔消光系数εmax (单位为cm 2mol -1或(mol dm --3) -1cm -1)也就密切相关，
从下式可以得到τF 的粗略估计值(单位为秒)。

1/τF ≈104εmax
在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时间混淆起来。

跃迁时间是跃迁频率的倒数，
⽽寿命是指分⼦在某种特定状态下存在的时间。

通过量测寿命，可以得到有关分⼦结构和动⼒学⽅⾯的信息。

2．2．2荧光量⼦产率(quantum yield)：
荧光量⼦产率是物质荧光特性中最基本的参数之⼀，它表⽰物质发射荧光的本领。

荧光量
⼦产率通常⽤φ来表⽰，定义为发射量⼦数和吸收量⼦数之⽐，即由荧光发射造成的退激分⼦在全部退激分⼦中所占的⽐例，⼜称为荧光效率。

φ＝发出量⼦数/吸收量⼦数。

处于激发态的分⼦，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过⼀些其它过程回到基态。

其结果是加快了激发态分⼦回到基态的过程(或称退激过程)。

φ =τ/τF
证明：总的退激过程的速率常数k 可以⽤各种退激过程的速率常数之和来表⽰:
k =k F +∑k i
k i 表⽰各种⾮辐射过程的衰减速率常数。

则总的寿命τ为:
τ=1/k =1/(k F + ∑k i )
因此，量⼦产率⼜可以表⽰为
∑+=i
i F F F k K K φ
因为 1/k F =τF ，τ=1/(k F +∑k i )
所以φ =τ/τF
φ的绝对值是较难⽤实验的⽅法测量的，因为必须事先知道仪器的修正因⼦。

实际测量中⼤多采⽤相对法，即⽤已知量⼦产率的标准样品与待测样品进⾏⽐较。

证明：对稀溶液来说，荧光强度F 与吸收度A 成正⽐:
F =kI 0A ?
这⾥k 是⽐例常数，I 0是吸收前的光强度，φ是荧光量⼦产率。

若两种溶液测量条件完全相同，则:
F 1/F 2=A 1φ 1/(A 2φ 2)
φ 1/φ 2=F 1A 2/(F 2A 1)
已知φ 2就可求出φ 1。

由于各种竞争性过程⽽使荧光量⼦产率减⼩的现象称为淬灭(quenching)，如温度淬灭，杂质
淬灭等。

量⼦产率对于⽣⾊团周围的环境以及各种淬灭过程很敏感。

量⼦产率的改变必然会
引起荧光强度的改变。

因此，如果只要研究量⼦产率的相对值，只要量测荧光强度也就⾜够了。

2．2．3荧光强度：
荧光强度F 取决于激发态的初始分布I A 与量⼦产率φ的乘积。

Ｆ=I A φ这⾥的F 指的是向各个⽅向上发射的荧光强度的总和，实际上，谱仪收集的只是其中的⼀⼩部分。

因此仪器测到的荧光强度Ｆ=I A φ Z ，这⾥Z 是仪器因⼦。

椐据Beer-Lambert 定律（A = KCL ，朗伯-⽐⽿定律同时反映了溶液厚度L 和浓度C 对光吸收A 的关系,其数值随光的波长、溶液浓度和溶液的性质⽽定）
I A =I 0-I t =I 0{1-exp[-2.3ε (λA )·C ·l]}
式中ε (λA )为激发波长处的消光系数，Ｃ为样品分⼦的浓度，I 0为⼊射光强度，I 0为透过样品后的光强度，l 为光程（样品池光径）。

对于稀溶液，吸收很稀，ε (λA )很⼩?<<2.3ε (λA )C ·l ＜＜1，因此，1-2.3ε (λA )C ·l ≈exp(-2.3ε (λA )C ·l)
I A =I 0(1-(1-2.3ε (λA )C ·l)) =2.3I 0ε (λA )C ·l
F λ=I A φZ =2.3I 0ε (λA )C ·l ·?·Z
如果激发光强保持不变，且?和Z 与激发波长⽆关，则F ∝ε (λA )很显然，荧光强度与样品在波度λA 处的消光系数有关，⽽消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化⽽变化。

激发谱与吸收谱的正相关关系在此⼀⽬了然。

当然，实际上仪器因⼦Z 与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。

2.2.4荧光偏振（fluorescence polarization ）
偏振⽚：吸收某⽅向光振动，⽽与其垂直⽅向的光振动能通过的装置
偏振化⽅向：能通过光振动的⽅向
⾃然光通过偏
振⽚后变为线偏振光，称为起偏; 线偏振光:光⽮量只沿⼀个固定⽅
向振动的光(⼜称平⾯偏振光)
利⽤偏振⽚检
验光线的偏振化
程度，称为检偏
荧光偏振度P＝（I //- I ⊥）/ (I //+ I ⊥)
荧光各向异性A= (I //- I ⊥)/(I//+2I ⊥)
可以证明I //+2 I ⊥为荧光总强度，
（1/P-1/3）-1=(2/3)A
Perrin公式：1/P±1/3=(1/P 0±1/3)(1+3τ/ρ)
=(1/P 0±1/3)(1+RTτ/ηV 0) 其中，P 0为极限偏振度，τ为荧光寿命，R⽓体常数，T绝对温度，η为粘滞系数
V 0为分⼦体积（按球形计算），ρ旋转迟豫时间。

研究⼤分⼦性质以及与⼩分⼦的相互作⽤。

不同⽣理条件下⽣物⼤分⼦的P 不同，可以借此诊断疾病。

3 讨论：
（1）环境因素对λmax 的影响：
a.环境(如溶剂)的极性对λmax 的影响---同⼀种荧光物质在不同极性的环境中，其λmax 可能会有所差别。

⼀般来说，激发态的极性⽐基态要强，因此被激发的荧光分⼦将趋向于与极性溶剂（或极性环境）相互作⽤，使溶剂分⼦的电⼦分布会发⽣变化，偶极⼦重新取向，⽽这⼜会反过来影响荧光分⼦的基态和激发态能级，减少激发态的能量，引起发射谱的红移这种影响的结果可
以⽤Lippert ⽅程来解释：32
*22)(1211212a n n hc f a µµεεσσ＋常数
其中，σa 与σf 分别为荧光分⼦的吸收波数与发射波数，σa ?σf 反映了吸收光与发射光
能量的差别；ε为溶剂的介电常数；h为普朗克常数；c为光速，a为荧光分⼦在溶剂
中所占空⽳的半径，
µ?与µ分别为荧光分⼦处于基态和激发态时的偶极矩。

由上式可见，折射率增加使能量差减少，⽽介电常数增加会使能量差增⼤。

由于荧光分⼦激发态的偶极矩µ?⼀般要⼤于基态偶极矩µ，荧光分⼦偶极矩的增⼤与溶剂分⼦相互作⽤，使溶剂分⼦的电⼦分布和偶极⼦取向发⽣变化。

溶剂偶极⼦的重新取向需要⽐电⼦重新分布长得多的时间。

介电常数ε不仅与偶极⼦取向有关，也与电⼦取向有关，
上式中第⼀项(ε?1)/(2ε?1)是电⼦和偶极⼦重新取向的结果；
折射率n与电⼦重新分布有关，因此上式中第⼆项是电⼦重新分布的结果。

由于⾮极性溶剂分⼦没有偶极矩，因此没有在激发态荧光分⼦的作⽤下偶极⼦重新取向的问题，ε≈n 2，σa ?σf 很⼩。

⽽在极性溶剂中σa ?σf 较⼤，产⽣红移.值得
提出的是“环境极性加强，λmax 红移”的规律，并不是绝对的。

例如，如果在激发态
的寿命之内，分⼦没有⾜够的时间来重新排列并降低激发态的能量，则可能发⽣λmax 兰移的情况。

这种现象称为“orientation constraint”。

这说明
在利⽤λmax 作为环
境极性的探针时要⼗分谨慎。

b.pH值对λmax 的影响：
如果荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对λmax 有影响。

这是因为弱酸
和弱碱分⼦和其离⼦在电⼦结构上有所不同，因⽽荧光λmax 也可能发⽣变化。

例如，
1-萘胺-5-磺酸在不同pH值时，会以两种不同离⼦的形式存在，这两种离⼦的荧光波长是不同的。

利⽤这种效应，可以将其荧光波长作为pH值的指⽰剂。

C. 溶液粘度对λmax 的影响
溶液粘度有时也会对λmax 有影响，例如TNS在蔗糖⽔溶液中的λmax 会随蔗糖浓度的
变化⽽变化。

当蔗糖浓度由10%增加到60%，粘度从1.3分泊增加到58分泊，λmax 以580nm兰移到555nm。

d.共振能量转移对λmax 的影响
如果两种⽣⾊团荧光频率接近，则当两种基团⾜够接近时，⽤⼀种⽣⾊团能吸
收的光激发使之处于激发态后，处于激发态的这种⽣⾊团可能将激发能转移到另⼀种⽣⾊团，使第⼆种⽣⾊团进⼊激发态，产⽣第⼆种⽣⾊团特有的荧光，这种现象称为共振能量转移。

显然，共振能量转移对λmax 可能造成影响。

(2) 环境对荧光量⼦产率φF 和荧光强度的影响
由于稀溶液中荧光强度F λ=KI 0A φ F ，（这⾥I 0是激发光强度，A是光密度或吸收
度，φ 0是荧光量⼦产率，K为常数）因此凡是会影响荧光量⼦产率φF 的环境因素也
必然会影响荧光强度。

a.溶剂（或环境）极性的影响
量⼦产率（荧光强度）会随着溶剂（或环境）极性的减⼩⽽增加。

这⼀点前⾯
已经提到过。

⼀种可能的机制是：在⾮极性的溶剂中系间交连（转移到另外的激发态）的速率会减少。

B.光化分解
荧光物质因吸收光能⽽造成某⼀键断裂的现象称为光化分解
（photodissociation），光化分解会造成荧光逐渐减弱。

尤其是对于稀溶液来说，光化分解就更为严重。

通常，为减少光化分解现象造成的影响，可采取以下措施：
I. 减少光照时间和强度II. 由于稀溶液更容易变质，⽽样品在浓溶液中要稳
定⼀些，因此储备液要配得浓⼀些，使⽤前再稀释。

III. 仪器本⾝的改进如提⾼检测器灵敏度，降低光源强度等，也有利于减少光化分解。

C. 温度对荧光强度的影响
⼀般来说，溶液的荧光强度随温度的降低⽽增强，温度的升向与荧光强度的减弱在⼀定范围内是线性关系。

温度每升⾼1°C，荧光减弱的百分数称为温度系数。

⼀般荧光物质的温度系数⼤约为1%，但有些荧光物质可⼤到5%。

温度升⾼，荧光强度减弱的原因主要是溶液的粘度减⼩，溶剂与溶质分⼦的动能增加，使得荧光分⼦的其它分⼦之间的碰撞⼏率增加，激发态荧光分⼦通过分⼦间碰撞或分⼦内能量的转移，将⾃⼰的能量转移出去。

以⾮荧光发射的形式回到基态，这就造成荧光淬灭，量⼦产率降低的情况。

如果溶液中有淬灭剂存在，则淬灭剂的作⽤也会随温度升⾼⽽增⼤。

为减少温度对荧光强度的影响，可采⽤恒温样品架维持样品温度的恒定。

d.样品浓度对荧光强度的影响：
在样品浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度成正⽐。

但到了⼀定浓度以后，就不再存在这种正⽐关系。

这是因为：荧光强度F=KφεI
(1?e?εlc)，这⾥K是仪器常数，φ是量⼦产率，I0是激发光强度，ε是克分⼦消光系数，l是样品池光径，C是样品浓度。

浓度增加到⼀定程度后，接近0，浓度继续增加，荧光强度不再增加。

只有样
品浓度很稀时F=KI
0φ [1?(1?εlc)]=KI
φεlC。

荧光浓度过⼤时，常常发⽣淬灭现象。

这样就使荧光强度反⽽⼤⼤低于接近饱和时的荧光强度。

淬灭产⽣的原因⾄今仍众说纷纭，最简单的解释是：单线能级的激发分⼦在发出荧光之前就和未激发的荧光物质分⼦碰撞⽽⾃淬灭浓度过⾼，可能形成样品分的⼆聚体或多聚体。

因⽽降低荧光强度。

产⽣浓度淬灭的重要原因之⼀是荧光分⼦在样品池中分布均匀：当溶液较稀时，均匀分布在样品池中的荧光收强烈，越进⼊溶液，发荧光分⼦越少，因⽽⼤量的激发光在到达池内之前就被吸收了。

这样，从垂直于激发光⽅向的⾓度来接收荧光，检测到的荧光就很微弱了。

即使是在靠近⼊射光的⾯上，也只有靠近检测器的⾯上荧光容易被接收到。

离探测器较远的荧光分发出的荧光⼜会被瓣⾯的荧光分⼦吸收（如果物质本⾝的吸收光谱和发射光谱有重叠的话），即⼤部分荧
光发射在离开吸收池前就⼜被吸收。

解决浓度淬灭的办法之⼀，是将样品尽量稀释到荧光强度与荧光染料宵度成范围线性关系的深浓度来测量。

浓度淬灭的现象有时也可以加以利⽤，例如在脂质体⾥包裹⾼浓度的荧光染料，由于浓度淬灭，包裹在脂质体内的荧光染料荧光强度很低。

⼀旦荧光染料从脂质体内泄漏出来，由于荧光染料浓度下降，进⼊线性区，因此荧光强度⼤⼤增加。

e.杂质对量⼦产率（荧光强度）的影响
f. pH值对量⼦产率和荧光强度的影响
如荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对荧光强度有较⼤影响。

利⽤这些物质对pH值的敏感性，可以将它们⽤作pH指⽰剂，或利⽤它们在不同pH值溶液中荧光强度的改变来判断酸碱滴定的络点（特别是在有⾊或混浊的溶液中）。

g.溶液粘度对荧光强度的影响
荧光强度⼀般随介质粘度的升⾼⽽增强。

因为介质粘度增加，减少了分⼦碰撞，
从⽽减少了能量损失。

例如荧光物质NTS在不同浓度的蔗糖⽔溶液中，荧光强度随
粘度增加⽽增加。

H.膜电位的影响
有些能和膜结合的荧光分⼦的荧光强度会随着膜电位的改变⽽改变，这种变化
有的是由于带电的荧光染料随膜电位变化⽽在膜内外重新分布。

有的是由于荧光分
⼦的荧光谱在电场下发⽣改变（电⽣⾊性， electro chronism）。

按照对膜电位变
化的反应速度，⼤⼩和光学信号改变的机制，这类电位敏感的荧光染料⼜可以分为
慢反应染料和快反应染料。

这种现象可以⽤来监测膜电位的变化。

i.其它各种⼲扰因素:
还有⼀些其它的⼲扰因素可能影响荧光强度，例如光散射就可能影响荧光强度。

区分散射光和荧光发射的依据，是散射光与激发光波长相同，离荧光峰较远。

荧光
污染也是影响荧光强度的⼀种因素
三．荧光分析在⽣物学中的应⽤
荧光分析应⽤的范围很⼴。

⽣物学和医学的各个学科，包括⽣理、⽣化、
⽣物物理、药理、免疫、细胞、遗传等，都可以使⽤这⼀技术。

从研究的材料来
看、氨基酸、蛋⽩质核酸、维⽣素酶、药物、毒物等都可以采⽤。

下⾯就内源荧
光和外源荧光在⽣物学、医学中应⽤的可能性，举⼀些例⼦。

3.1内源荧光的探测和应⽤
⽣物学中⽐较重要的天然荧光分⼦多属具有共轮双键的系统。

如芳⾹氨基酸、核黄素、维⽣素A、卟啉、叶绿素、NADH和tRNA中的Y碱基（⼆氢尿嘧啶）等。

对于
含有这些天然荧光物质的样品，可以直接通达量测其荧光来确定其存在，分布及数量。

3.1.1蛋⽩质的内源荧光
蛋⽩质的荧光来⾃⾊氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。

它们的相对荧光强度为
100:9:0.5。

检测蛋⽩质的天然荧光，可采⽤280nm的激发波长，发射波长范围
在340-350（蛋⽩溶液为中性时）。

如果蛋⽩中不含⾊氨酸，只含苯丙氨酸和酪
氨酸，则荧光光谱主要表现酪氨酸的特征，最⼤发射波长约为304nm。

对于含有
⾊氨酸的蛋⽩，荧光光谱则主要表现⾊氨酸的特征，最⼤荧光发射在320-350nm
之间。

3.1.2维⽣素的内源荧光分析
3.2 外源荧光的应⽤：
荧光探针，即外源荧光技术。

⽬前，荧光探针的种类已经有上千种，⼈们可以根据所研究问题的不同，选择不同的荧光探针。

3.2.1蛋⽩质的荧光标记：
3.2.2核酸的荧光标记：
3.2.3 ⽣物膜的荧光标记
3.2.4⾦属代谢的荧光监测
3.2.5 荧光探剂作为pH指⽰剂
参考⽂献：
1.赵南明，周海梦，⽣物物理学，北京：⾼等教育出版社，海德堡：施普林格出版社，2000
2.林克椿，⽣物物理技术　波谱技术及其在⽣物学中的应⽤，北京：⾼等教育出版社，1989
3.林克椿，吴本玠，医学⽣物物理学，北京医科⼤学。

中国协和医科⼤学联合出版社，1996 4．SNL讲义
⽣物物理技术综述。