【基础研究】多孔块体生物活性玻璃对成骨细胞生物学行为影响的体外研究

【基础研究】多孔块体生物活性玻璃对成骨细胞生物学行为影响的体外研究
文章来源:中华骨科杂志,2016,36(03): 168-176
作者：胡腾龙厉晓杰赵雄陆清达郝旭光张斌杨柳颉强
摘要
目的
探讨多孔块体生物玻璃在体外环境中对成骨细胞黏附、增殖及分化的影响。

方法
多孔块状生物玻璃浸泡于α-MEM培养基中制备浸提液，采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪
检测生物玻璃培养基及α-MEM培养基中的离子浓度。

通过Giemsa染色、黏着斑蛋白（Venculin
）免疫荧光染色检测生物玻璃培养基培养的MC3T3-E1细胞（生物玻璃培养基组）及α-MEM培
养基培养的MC3T3-E1细胞（普通培养基组）的细胞个数、核质比、Venculin免疫荧光强度；通
过细胞周期检测、MTT检测、Brdu检测比较两组细胞的各个细胞周期数量构成比、OD值、Brdu
阳性细胞比；提取两组细胞总RNA并行成骨相关基因碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白分析，
经碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察两组培养基培养细胞的碱性磷酸酶活性率及细胞矿化率。

结果
生物玻璃培养基中的Si离子和F离子浓度分别为（40.02±0.67）mg/L、（0.02±0.001）mg/L，α-
MEM培养基分别为（2.02±0.01）mg/L、0.00 mg/L。

Giemsa染色后生物玻璃培养基组和普通培
养基组400倍镜下的细胞个数分别为（106.0±6.025）个、（40.20±3.639）个，差异有统计学意
义；免疫荧光染色结果显示生物玻璃培养基组细胞的核质比、Venculin免疫荧光强度（分别为
40.85±5.720、0.050 88±0.021 78）较普通培养基组（分别为21.93± 4.137、0.023 60±0.003
18）增高。

生物玻璃培养基组处于S期和G2/M期细胞数量构成比较普通培养基组高。

生物玻璃
培养基组OD值至第3天开始较普通培养基组增高，BrdU阳性细胞比较普通培养基组增高。

生物
玻璃培养基组细胞碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原的表达较普通培养基组增多，碱性磷酸酶活性
率（1.328%±0.015 36%）高于普通培养基组（0.979%± 0.030 59%），细胞矿化率
（2.953%±0.536 3%）高于普通培养基组（1.000%±0.208 1%）。

结论
多孔块体生物玻璃培养基相对于α-MEM培养基含有较多的Si离子，能促进MC3T3-E1细胞黏
附，并对其增殖、活力及成骨分化都具有明显的促进作用，具有较好的生物活性。

20世纪70年代Hench等[1]通过熔融法制备出了Na2O-CaO-
SiO2-P2O5系统的生物玻璃45S5，它由一个硅酸盐网络（包含
质量分数45％的SiO2）合并24.5％的Na2O、24.5％的CaO、
6％的P2O5作为网络改性剂。

到目前为止，已经有多种生物玻
璃材料应用于临床[2,3]，但主要应用于非承重部位骨缺损的修
复，如脊柱融合术、髋关节脱位髋臼截骨术及骨折的修复愈合
等方面。

生物玻璃植入体内后能以一个可控的速率释放各种离
子，这些在降解过程释放的离子有利于骨生成和血管生成，其
中Si离子发挥了最重要的作用[4]。

Si离子局部增加能引起局部
钙磷比值增加，有利于矿化过程的进行[5]；促进细胞的新陈代
谢，激发促创伤愈合因子的自分泌反应，加速创伤修复；还可
以聚集在羟基磷灰石层表面，使新生组织能够在整个创面顺利
爬移和覆盖[6,7,8]。

虽然生物活性玻璃有很高的生物活性，但
目前已用于临床的生物活性玻璃的机械性能及力学强度还相对
较差，尚不能应用于承重部位骨缺损的植骨修复[9,10,11]。

有鉴于目前临床应用的生物活性玻璃的机械性能较差，我院骨科与美国诺邦生物制品有限公司联合研制了一种新型的多孔块体（macro-pore bone block，MPBB ）生物活性玻璃。

它通过改良制作工艺及调整材料配方，在保留经典生物活性玻璃固骼生? （NOVABONE?）[12]生物活性的同时，提高了其力学性能，并加大了孔隙率及孔径范围，以期为将来应用于承重部位的骨移植提供可能。

但目前还没有MPBB生物活性玻璃与活体细胞作用的相关研究，来证实其对成骨细胞黏附、增殖及分化的影响。

本研究于体外检测MPBB生物活性玻璃对成骨细胞的影响，采用MPBB生物活性玻璃培养基与α-MEM培养基体外培养MC3T3-E1细胞，比较两种培养基中的离子浓度，观察两组培养基中的细胞形态、细胞数量、细胞黏着斑蛋白，检测两组细胞的增殖周期、细胞的增殖状况和细胞活性，成骨相关基因表达、碱性磷酸酶活性[13]及细胞矿化率。

研究目的：①分析MPBB生物活性玻璃培养基与α-MEM培养基中的成分差异；②探讨MPBB生物活性玻璃对成骨细胞形态、黏附及增殖等生物学行为的影响；③探讨MPBB生物活性玻璃对成骨细胞分化及矿化的影响。

材料与方法
一、材料制备
MPBB生物活性玻璃的组成包括质量分数为24%~45％的CaO、34%~50％的SiO2、
0~25％的Na2O、5%~17％的P2O5、0~5％的MgO及0~1％的CaF2。

孔隙率
20%~80%，孔径50~600 μm，孔相互连通。

MPBB含有磷酸钙和硅酸钙结晶，采用
干压方法或凝胶注模成型法制备工艺制备。

该材料由我院骨科与美国诺邦生物制品
有限公司联合研制，并委托诺邦公司生产（图1）。

图1 MPBB生物活性玻璃，有圆盘状和圆柱状两种。

本实验采用圆盘状。

具有较高的
孔隙率，表面疏松多孔、不平整，有利于细胞黏附
二、主要试剂及设备
α-MEM培养基（Corning，美国），胎牛血清（四季青生物工程材料有限公司，中
国），青链霉素（Sigma，美国），MC3T3-E1细胞（ATCC，美国），MTT试剂
（Sigma，美国），碱性磷酸酶染色工作液（碧云天生物技术研究所，中国），激光
共聚焦显微镜（Olympus，日本），FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson，
美国）。

三、MPBB浸提液培养基的制备及离子浓度检测
以2 g/L的浓度将MPBB生物活性玻璃浸泡于浸提介质α-MEM培养基中，于37 ℃的
CO2培养箱中孵育24 h[14]。

吸取浸提液后离心5 min，1 500 r/min。

取上清液，无
菌过滤，调整pH为7.4，即为生物玻璃培养基。

α-MEM培养基作为普通培养基。

两组
培养基均于4 ℃冷藏，于24 h内使用。

加入MC3T3-E1细胞进行培养，两组培养基培
养的MC3T3-E1细胞分别为生物玻璃培养基组和普通培养基组。

培养基每两天更换一
次。

采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪测定生物玻璃培养基与α-MEM培养基中Si、
Ca、P、Na、F离子浓度[15]。

四、组织学和免疫荧光观察
两组细胞分别培养至第7天，将细胞培养皿放置于光学显微镜（Olympus，日本）下观察细胞大体状态。

用1∶3比例配置的甲醇-异丙醇固定溶液将细胞固定15 min；Giemsa染液稀释10倍，染色15 min。

随机选取6个视野，400倍镜下对两组细胞进行计数。

将MC3T3-E1细胞以5×104个/ml的密度种植于培养皿中，细胞贴壁后分别更换为生物玻璃培养基与α-MEM培养基，每两天更换一次培养基。

培养至第7天，吸出培养基，以PBS冲洗；以体积分数4％的甲醛溶液固定，行黏着斑蛋白免疫荧光染色、细胞核DAPI染色及用鬼笔环肽对肌动蛋白进行染色。

于激光共聚焦显微镜60倍镜下，每组随机选取5个视野进行观察、拍照。

采用Image-Pro Plus （IPP）软件（Olympus，日本）计算两组细胞的核质比和Venculin免疫荧光强度。

五、细胞周期和细胞增殖检测
将MC3T3-E1细胞以1×105个/ml的密度种植于培养瓶中，细胞贴壁后分别更换为生物玻璃培养基与α-MEM培养基。

72 h后用胰酶消化离心，加入PBS重悬，固定，用FACSCalibur流式细胞仪检测两组细胞各个周期的细胞数量构成比。

六、MTT细胞增殖检测
采用96孔板培养细胞，每孔2 000个细胞，分别加入生物玻璃培养基和α-MEM培养基200 μl，即细胞密度为1×104个/ml。

分别培养至第1、3、5天后加入5 g/L的MTT溶液20 μl，继续培养4 h。

吸出培养基，每孔加入150 μl的DMSO溶解蓝色结晶，在振荡器上振荡10 min，检测波长492 nm的吸光度。

七、BrdU检测
将MC3T3-E1细胞以2×104个/ml的密度种植于培养皿中，细胞贴壁后分别更换为生物玻璃培养基和α-MEM培养基。

培养48 h后加入BrdU ，2 h后以体积分数4％的多聚甲醛溶液固定，按照说明书进行细胞BrdU免疫荧光染色及细胞核DAPI染色。

于
FV1000激光共聚焦显微镜20倍镜下，每组随机选取5个视野进行观察、拍照；采用IPP软件计算两组细胞的BrdU阳性细胞比。

八、RT-PCR检测
将MC3T3-E1细胞以1×105个/ml的密度种植于六孔板中，细胞贴壁后分别更换生物玻璃培养基和α-MEM培养基。

分别培养至第4天和第7天，提取细胞总RNA，检测RNA浓度；进行RNA反转录，分析碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原mRNA与β-肌动蛋白mRNA的比率。

引物序列如表1所示。

九、碱性磷酸酶染色
将MC3T3-E1细胞以1×104个/ml的密度种植于六孔板中，细胞贴壁后分别更换为生物玻璃培养基和α-MEM培养基，每两天更换一次培养基。

培养至第7天时吸出培养基，以PBS冲洗，加入工作液，室温孵育30 min。

40倍光镜下每组随机选取5个视野进行观察、拍照，使用IPP软件计算碱性磷酸酶活性率[16]。

十、茜素红染色
将MC3T3-E1细胞以1×104个/ml的密度种植于六孔板中，细胞贴壁后分别更换为生物玻璃培养基和α-MEM培养基，每两天更换一次培养基。

培养至第14天时吸出培养基，以PBS冲洗，以体积分数4%的甲醛固定10 min。

加入茜素红染液，37 ℃染色30 min，以蒸馏水冲洗。

在40倍光镜下每组随机选取5个视野进行观察、拍照，观察钙结节数量，使用IPP软件计算细胞矿化率。

十一、统计学处理
采用SPSS 16.0统计软件（SPSS，美国）进行统计分析。

数据以均数±标准差表示。

两组培养基的离子浓度，细胞个数，核质比，黏着斑蛋白荧光强度，OD值，BrdU阳性细胞比，碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白mRNA与β-肌动蛋白mRNA的比率，碱性磷酸酶活性率，细胞矿化率的比较采用成组设计资料t检验；两组细胞周期构成比的差异采用卡方检验。

检验水准α值取双侧0.05。

结果
一、MPBB生物活性玻璃培养基中的离子浓度
生物玻璃培养基中的Si离子浓度明显增高，接近普通培养基的20倍，两组差异有统计学意义；普通培养基中不含有F离子，生物玻璃培养基有少量F离子。

生物玻璃培养基中Ca离子浓度较普通培养基低，两者差异有统计学意义。

两组培养基中P、Na 离子浓度的差异均无统计学意义（表2）。

二、MPBB生物活性玻璃对MC3T3-E1细胞形态和黏附的影响
Giemsa染色可将MC3T3-E1细胞的细胞核染色。

细胞培养第7天，与普通培养基组相比，生物玻璃培养基组的细胞数量更多，排列规则紧密（图2）。

400倍镜下生物玻璃培养基组细胞计数为（106.0±6.025）个，普通培养基组为（63.80±3.184）个，两组差异有统计学意义（t=6.19 ，P=0.003）。

图2 光镜下MC3T3-E1细胞的组织形态学观察Giemsa染色×100 A生物玻璃培养基组，成骨细胞数量更多，排列规则紧密，表现出很旺盛的增殖能力B普通培养基组成骨细胞数量少，排列较稀疏
Venculin免疫荧光染色可见，生物玻璃培养基组较普通培养基组细胞更加铺展，细胞内的黏着斑蛋白表达更广泛（图3）。

经计算生物玻璃培养基组细胞的核质比为40.85±5.720，均值较普通培养基组（21.93±4.137）高出近1倍，两组差异有统计学意义（t=3.68 ，P=0.010 ）。

生物玻璃培养基组细胞的平均黏着斑蛋白荧光强度为0.050 88±0.021 78，均值较普通培养基组（0.023 60±0.0031 83）高出1倍，两组差异有统计学意义（t=2.45 ，P=0.049）。

图3 激光共聚焦显微镜下MC3T3-E1细胞免疫荧光观察A生物玻璃培养基组细胞黏着斑蛋白具有较高的荧光强度，黏附性强　黏着斑蛋白免疫荧光染色×60 B生物玻璃培养基组细胞核呈蓝色，其细胞核面积与普通培养基组大致相同　细胞核DAPI染色×60 C生物玻璃培养基组细胞质面积较普通培养基组大肌动蛋白鬼笔环肽染色×60 D普通培养基组，细胞黏着斑蛋白荧光强度低　黏着斑蛋白免疫荧光染色×60 E普通培养基组细胞核呈蓝色，其细胞核面积与生物玻璃培养基组大致相同　细胞核DAPI染色×60 F普通培养基组细胞质面积较生物玻璃培养基组小肌动蛋白鬼笔环肽染色×60
三、MPBB生物活性玻璃对MC3T3-E1细胞周期和细胞增殖的影响
流式细胞仪细胞增殖周期检测结果显示，生物玻璃培养基组处于S期和G2/M期细胞所占的百分比较普通培养基组多，G0/G1期细胞百分比较普通培养基组少，两组细胞周期构成比的差异有统计学意义（χ2＝9.35，P＝0.025，图4）。

图4 生物玻璃培养基组与普通培养基组各个细胞周期细胞数量构成比，生物玻璃培养基组S期和G2/M期细胞比例较普通培养基组高
MTT检测结果显示，在培养至第1、3、5天时生物玻璃培养基组的OD值均较普通培养基组高，其中第3天和第5天两组差异有统计学意义（图5）。

图5 MTT检测成骨细胞增殖，生物玻璃培养基组与普通培养基组比较，除第1天外OD值均有明显增高，差异有统计学意义
BrdU免疫荧光染色显示，生物玻璃培养基组BrdU阳性细胞较普通培养基组多（图6）。

生物玻璃培养基组BrdU阳性细胞比为0.445 7%±0.038 29%，较普通培养基组（0.231 9%±0.044 70%）高，差异有统计学意义（t=4.02 ，P=0.015）。

图6 激光共聚焦显微镜下MC3T3-E1细胞BrdU免疫荧光染色及细胞核DAPI染色观察A 生物玻璃培养基组BrdU阳性细胞较多BrdU免疫荧光染色×20 B生物玻璃培养基组细胞核为蓝色，细胞核数量与普通培养基组大致相同　细胞核DAPI染色×20 C普通培养基组BrdU阳性细胞较少BrdU免疫荧光染色×20 D普通培养基组细胞核为蓝色，细胞核数量与生物玻璃培养基组大致相同　细胞核DAPI染色×20
四、MPBB生物活性玻璃对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响
两组细胞在不同培养条件下分别培养至第4天和第7天，利用RT-PCR检测成骨相关基因表达、结果显示生物玻璃培养基组碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白mRNA与β-肌动蛋白mRNA的比率较普通培养基组高，差异均有统计学意义（表3，图7）。

图7 两组细胞分别培养第4天和第7天时的成骨基因表达A碱性磷酸酶mRNA与肌动蛋白mRNA的比率，生物玻璃培养基组从第4天开始较普通培养基组高B骨钙素mRNA 与肌动蛋白mRNA的比率，生物玻璃培养基组从第4天开始较普通培养基组有明显增高CⅠ型胶原蛋白mRNA与肌动蛋白mRNA的比率，生物玻璃培养基组从第4天开始较普通培养基组高
细胞培养至第7天碱性磷酸酶染色结果显示，生物玻璃培养基组的碱性磷酸酶表达量更高（图8）。

经统计，生物玻璃培养基组碱性磷酸酶活性率为1.328%±0.015 36%，较普通培养基组（0.979%±0.030 59%）增高，两组差异有统计学意义
（t=9.33，P=0.007）。

图8 光镜下MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性观察　碱性磷酸酶染色×40　A　生物玻璃培养基组着色深且着色面积大，表明其碱性磷酸酶表达量高B普通培养基组着色面积小
细胞培养至14天，茜素红染色显示钙结节为红棕色，生物玻璃培养基组钙结节较普通培养基组多且面积大，普通培养基组钙结节生成较少（图9）。

生物玻璃培养基组细胞矿化率2.953%±0.536 3%，较普通培养基组（1.000%±0.208 1%）高近2倍，差异有统计学意义（t=3.36 ，P=0.028）。

图9 光镜下MC3T3-E1细胞矿化率观察茜素红染色×40 A生物玻璃培养基组，钙结节成橙红色，数量多且面积大B普通培养基组，钙结节数量少且面积小
讨论
一、MPBB生物活性玻璃培养基与α-MEM培养基的成分差异
为检测MPBB生物活性玻璃材料的生物学活性，我们采用其浸提液制备MPBB生物玻璃培养基来进行体外研究。

通过对两种培养基成分的分析发现，生物玻璃培养基中Si 离子浓度明显高于普通培养基，而Na和P离子浓度没有明显不同，同时生物玻璃培养基还含有少量F离子。

既往文献报道Si离子可以促进成骨细胞增殖，不仅有利于骨生成和血管生成，也能影响软骨形成。

实验研究表明适量的Si离子在体外对破骨细胞有明显的抑制作用，对成骨细胞则有激活作用，其生物活性的主要机制是其具有内在的对抗NF-KB激活的能力[17]。

NF-KB是一种信号转导通路，它可促进破骨细胞吸收，抑制成骨细胞形成。

相关动物实验表明，Si离子能显著提高小鼠的骨密度。

给小鼠饮食中摄入Si离子，有益于小鼠的骨骼发育。

也有临床研究证实在同龄人群饮食中含有Si离子会对骨密度的提高产生积极影响[18]。

另外，Si离子在细胞周期和细胞活性调控中也起到非常关键的作用[19]。

F离子能够提高碱性磷酸酶活性，增加骨矿化，从而促进成骨细胞分化[20]。

同时
MPBB生物玻璃培养基还含有较高的Ca、Na、P离子，有利于羟基磷灰石的生成及沉积。

因此，我们推测生物玻璃培养基相对于α-MEM培养基在促成骨方面具有一定的优势。

二、MPBB生物活性玻璃对MC3T3-E1细胞形态、黏附及增殖的影响
本研究中生物玻璃培养基组黏着斑蛋白表达量明显高于普通培养基组，证明MPBB生物材料的活性成分能够促进成骨细胞黏附；生物玻璃培养基组细胞核质比较普通培养基组高，说明细胞生长得更加铺展。

细胞在有丝分裂结束后，必须首先经过休息期（G0期），然后经G1期、S期、G2期，最后再次进入有丝分裂期。

其中从G1期进入S期是控制细胞增殖的关键步骤。

通过流式细胞仪检测细胞分裂周期显示，生物玻璃培养基组细胞S期与G2期细胞明显较普通培养基组多，说明其能促进成骨细胞从G1期进入S期，而且也能加速细胞从G2期进入M期，从而促进细胞增殖。

MTT不仅能检测细胞增殖情况，而且能检测细胞活性，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为非水溶性的蓝紫色结晶并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

根据测得的OD值来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

BrdU可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S
期）采用活体注射或细胞培养时加入，而后利用抗BrdU单克隆抗体进行免疫荧光染色，可显示增殖细胞，BrdU检测进一步证明了其活性成分可促进成骨细胞增殖。

三、MPBB生物活性玻璃对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响
骨形成是一个涉及从间质干细胞向成骨细胞分化的复杂的发育过程。

成骨细胞定向分化受到一个多步骤的分子通路控制，通过不同的转录因子和信号蛋白调控。

成骨细胞的基质成熟期以碱性磷酸酶活性升高为其特征，因此碱性磷酸酶是成骨细胞分化的主要特征酶之一，是成骨细胞矿化过程中主要的功能活性酶。

本研究中RT-PCR 检测和碱性磷酸酶染色结果都证实生物玻璃培养基组的细胞碱性磷酸酶活性更高。

骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白、钙结节也是成骨细胞分化的标志。

本研究中RT-PCR、碱性磷酸酶染色和茜素红钙结节染色结果显示，MPBB生物玻璃培养基的活性成分在基因转录、蛋白表达和矿化率形成方面都具有促成骨作用。

从上述结果可以看出，生物玻璃培养基能够促进MC3T3-E1细胞增殖及细胞周期，并从基因水平、蛋白水平促进成骨细胞分化和钙结节形成，具有更强的骨激发能力。

因此，生物玻璃在修复骨缺损时可以形成正常的骨组织[21]，而不是使用羟基磷灰石生成的由异源材料加强的结合骨[22,23]，避免了不可降解人工材料的缺点。

四、MPBB生物活性玻璃的前景
通过本研究，我们发现MPBB生物活性玻璃能够促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化，证明了这种新型生物活性玻璃材料具有良好的生物活性和生物相容性，其浸提液能够对成骨细胞形态、增殖、分化及细胞周期起到积极作用。

MPBB生物活性玻璃有望发展成为新型的能够应用于承重部位骨缺损修复的植骨材料。

但目前这种材料的生物学活性研究尚有可完善的空间，如材料植入动物体内或人体后的生物相容性等生物活性尚不明确。

参考文献（略）。