HPLC法测定罗氟司特片中的有关物质

HPLC法测定罗氟司特片中的有关物质
刘婷;张露勇;刘师卜;张斗胜
【摘要】目的建立高效液相色谱法测定罗氟司特片的有关物质.方法采用Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱,0.005 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-乙腈为流动相,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min-1,检测波长为250 nm.结果罗氟司特及各杂质在相应的浓度范围内,峰面积与浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.999.结论建立的方法快速、灵敏、准确,适用于罗氟司特片中的有关物质测
定.%Objective To establish a method for the determination of related substances in Roflumilast Tablets by HPLC method.Methods A Zorbax SB-C18 (4.6 mm×150 mm,5 μm)column was adopted,the mobile phase was consisted of 0.005 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate-acetonitrile with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1,and the detection wavelength was 250 nm.Results In the appropriate concentration range,roflumilast and the impurities peak area showed a good linear relationship with the concentration,the correlation coefficients were greater than 0.999.Conclusion The method was
rapid,sensitive,accurate,and suitable for the determination of related substances in Roflumilast Tablets.
【期刊名称】《药学研究》
【年(卷),期】2017(036)006
【总页数】5页(P322-326)
【关键词】罗氟司特;片剂;有关物质;高效液相色谱法
【作者】刘婷;张露勇;刘师卜;张斗胜
【作者单位】中国食品药品检定研究院,北京 100050;中国食品药品检定研究院,北京 100050;中国食品药品检定研究院,北京 100050;中国食品药品检定研究院,北京100050
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2
罗氟司特由瑞士耐科明公司(Nycomel)研制、用于治疗哮喘和慢性阻塞性肺病的一个选择性磷酸二酯酶－4抑制剂(phosphodiesterase－4，PED－4)，化学名为3－(环丙基甲氧基)－N－(3，5－二氯吡啶－4－基)－4－(二氟甲氧基)苯甲酰胺[1]。

2010年7月，罗氟司特片已在欧盟获准用于辅助支气管扩张剂维持治疗重度慢性阻塞性肺病患者。

本品用于治疗有严重慢性阻塞性肺炎(以下简称“COPD”)伴有
慢性支气管炎和加重史的患者以降低COPD加重的风险[2－3]，是近年在全球范
围内获准用于慢性阻塞性肺病治疗的第一个新型口服药物，具有良好的应用前景[4]。

目前国内罗氟司特片尚未上市，有关研究多集中在原料合成工艺、原料质量
以及临床前药代动力学研究等方面[5－7]，而对制剂中有关物质的系统研究尚未见报道。

鉴于此，本文参考有关文献[8－9]，尝试采用高效液相色谱(HPLC)法建立
罗氟司特片的有关物质的测定方法，试验结果证明该方法准确、可靠、简便、快速，可用于罗氟司特片在我国上市后的质量控制以及再评价研究。

1.1 仪器美国Waters高效液相色谱仪(2690泵，996检测器)；TU－1900紫外
可见分光光度计(普析通用)；电子天平(日本岛津AUW120D)。

1.2 试药罗氟司特片(武汉先路医药科技有限公司，批号:120401、120402、
120403)；罗氟司特对照品(武汉先路医药科技有限公司，由原料精制而成，批
号:110501，含量:99.83%，供含量测定用)；杂质1 (上海阳帆医药科技有限公司，批号:110201－1，纯度:97.6%)；杂质2(上海阳帆医药科技有限公司，批
号:110201－2，纯度:97.2%)；杂质3(上海阳帆医药科技有限公司，批号:110201－3，纯度:92.8%)；杂质4(上海阳帆医药科技有限公司，批号:110201－4，纯度:97.2%)；杂质5(上海阳帆医药科技有限公司，批号:110201－5，纯度:97.4%)；乙腈为色谱纯，其他试剂与试药均为分析纯，水为超纯水。

2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱为Zorbax SB－C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相A:0.005 mol·L－1磷酸二氢钾溶液，流动性B:乙腈，按表1进行
梯度洗脱。

流速为1.0 mL·min－1，检测波长为250 nm，柱温为40℃。

取罗氟
司特对照品约10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再精密量
取1 mL，置10 mL的量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精
密量取对照品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为灵
敏度测试溶液。

取灵敏度测试溶液，精密量取100 μL注入液相色谱仪，罗氟司特色谱峰的信噪比应大于10。

2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的配制精密取罗氟司特对照品适量，加50%乙腈超声处理30 min，放冷，用50%乙腈稀释制成0.2 μg·mL－1的溶液，作为对照溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制精密称取罗氟司特样品适量，按“2.2.1”项下方法制成0.1 mg·mL－1的溶液，作为供试品溶液。

2.2.3 专属性试验溶液的配制分别取罗氟司特片细粉适量(约相当于罗氟司特5 mg)，精密称定，分置50 mL量瓶中，按以下方法配制专属性试验溶液。

2.2.
3.1 高温破坏加5 mL乙腈，100℃水浴放置48 h，取出，放冷，用50%乙腈
稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.2.
3.2 碱破坏加5 mL乙腈，再加入0.1 mol·L－1NaOH溶液2 mL，60℃水浴加热2 h后，取出，放冷，用0.1 mol·L－1HCl溶液2 mL中和，用50%乙腈稀
释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.2.
3.3 酸破坏加5 mL乙腈，再加入0.1 mol·L－1HCl溶液2 mL，60℃水浴加
热30 min后，取出，放冷，用0.1 mol·L－1NaOH溶液2 mL中和，用50%乙
腈稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.2.
3.4 光照破坏加5 mL乙腈，置50 mL无色透明量瓶中，加50%乙腈适量，
混合均匀，超声提取30 min，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，置照度(4 500 Lx)太阳光下照射6 h后，取出，即得。

2.2.
3.5 氧化破坏加5 mL乙腈，加入10%过氧化氢溶液2 mL，100℃水浴加热1 h后，取出，放冷，用流动相A稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.2.4 空白辅料溶液取空白辅料适量，按处方量(未发表)，按“2.2.2”项下方法制成空白辅料溶液。

2.2.5 杂质溶液分别取杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、罗氟司特N－氧化物适量，精密称定，分别用50%乙腈溶液溶解并定量稀释制成
每1 mL约含0.2 μg·mL－1的溶液，作为各杂质对照溶液。

另取罗氟司特对照品，精密称定，用50%乙腈溶液溶解并定量稀释制成每1 mL约含0.2 μg·mL－1的溶液；精密量取上述对照品溶液各2 mL，同置100 mL的量瓶中，摇匀，作为杂质混合储备液。

2.3 方法学验证
2.3.1 专属性试验
2.3.1.1 空白辅料与各杂质色谱峰取空白辅料溶液、各杂质对照溶液各100 μL，
按“2.1”项下的色谱条件分别进样，记录色谱图，见图1。

由图1可知，空白辅料未干扰杂质峰，罗氟司特各杂质在该色谱系统中均能有效
检出。

2.3.1.2 加速试验取供试品溶液、专属性试验溶液各100 μL，按“2.1”项下的色谱条件进样，记录色谱图，见图2。

由图2可知，罗氟司特在酸、碱、氧化以及高温破坏条件下不稳定，易发生降解，其中氧化降解产生的杂质峰最多。

进一步比较杂质对照溶液(见图1)，确定罗氟司特片各杂质的峰定位与来源归属见表2。

综上分析，在新建立的色谱条件下，各降解产物均能与罗氟司特完全分离，辅料均无干扰，主峰纯度角度均小于纯度阈值，峰纯度符合要求。

结果表明，新建方法专属性强，可用于罗氟司特原料及制剂中有关物质的检测。

2.3.2 线性关系、校正因子的考察分别精密量取杂质混合储备液各0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分置25 mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，立即精密量取上述溶
液各100 μL，按“2.1”项下的色谱条件分别进样，按检出杂质峰的峰面积与浓度进行线性回归与校正因子考察。

罗氟司特及各杂质的线性回归方程及校正因子见表3。

由表3可知，罗氟司特及各杂质，在一定范围内，其浓度与峰面积成良好线性关系。

杂质1、杂质2与杂质4的校正因子在0.9～1.1范围内，可采用不加校正因
子的自身对照法测定其含量；杂质3、杂质5、杂质6与杂质7校正因子在0.9～
1.1范围外，须采用加校正因子的自身对照法测定其含量。

2.3.3 精密度试验精密量取杂质混合储备液100 μL，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，记录色谱图，分别计算罗氟司特及各杂质峰面积的RSD。

杂质1的RSD为0.61%；杂质2的RSD为0.66%；杂质3的RSD为0.46%；杂质4的RSD为0.78%；杂质5的RSD为0.56%；杂质6的RSD为0.39%；杂质7的
RSD为0.54%；罗氟司特的RSD为0.66%。

2.3.4 重复性试验精密称取同一批次罗氟司特片(批号:120401)，按“2.1”项下的方法，重复测定3次，计算各杂质的RSD；供试品溶液中未检出杂质。

2.3.5 回收率考察取同一批次罗氟司特片(批号:120401)2.360 g，精密称定，置50 mL的量瓶中，平行称取9份，备用。

另取杂质混合储备液作为各杂质回收率对照母液，
分别精密量取各杂质回收率对照母液各1 mL(50%)、2 mL(100%)、3 mL (150%)，每份平行取3份，置上述50 mL的量瓶中，按“2.1”项下的方法测定。

回收率考察结果见表4。

表4结果表明，新建方法准确，可用于罗氟司特片有关物质检查。

2.3.6 稳定性试验取“2.3.5”项下的供试品溶液，24 h内每间隔1 h分别量取
100 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

试验验结果表明，供试品溶液在24 h内
基本稳定，主峰峰面积RSD为1.5%，未检出其他杂质峰。

2.3.7 检测限和定量限取杂质混合储备液逐步稀释，按“2.1”项下的方法测定。

检测限按信噪比3∶1计，杂质1、2、3、4、5、6、7以及罗氟司特的检出限分
别为1.5、1.0、3.33、1.5、1.0、1.5、0.5、0.7 ng；定量限按信噪比10∶1计，杂质1、2、3、4、5、6、7以及罗氟司特的定量限分别为4.5、3.0、10、4.5、3.0、5.12、1.52、2.0 ng。

2.4 样品测定取罗氟司特片3批，照“2.3”项下方法分别制备供试品溶液和对照
品溶液，精密量取对照品溶液和样品溶液各100 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，杂质2、杂质5、杂质6和杂质7按校正后的峰面积计算(分别乘以校正因子1.0、1.3、1.5和0.8)均不得大于对照溶液主
峰面积(0.2%)，其他未知单个杂质峰面积不得大于对照品溶液主峰面积的0.5倍(0.1%)，按校正后的峰面积计算各杂质峰面积的和不得大于对照品溶液主峰面积2.5倍(0.5%)，供试品溶液色谱图中任何小于对照品溶液主峰面积0.1倍的峰可忽
略不计。

结果3批样品有关物质均未检出，符合规定。

3.1 检测方法的选择已有文献报道[8－9]，采用HPLC法测定罗氟司特及其杂质，但均采用等度洗脱，在210或215 nm处检测；在实际样品检测中，专属性试验
显示，在强力降解条件下，罗氟司特易产生降解杂质，而针对制剂中有关物质检测，笔者未见报道。

考虑到罗氟司特片质量控制的实际需要，本文选择HPLC法，优
化流动相洗脱方式和检测波长，建立新的罗氟司特片有关物质检查法，为有效进行质控提供技术支撑。

3.2 检测波长选择根据罗氟司特的紫外光谱特征，其在213 nm和251.5 nm波
长处有最大吸收，在238 nm波长处有最小吸收，考虑避免溶剂50%乙腈在截止
波长处(λmax:210 nm)对主药测定的干扰以及各杂质的紫外光谱特征，最终确定
有关物质的检测波长为250 nm。

3.3 流动相梯度洗脱在有关物质检查中，由于其流动相随时间调整的优势，相比
等度洗脱，梯度洗脱更有利于样品中不同来源、性质各异的杂质被检出，并在药品标准制定与提高中越来越受到重视。

已有文献报道[9]采用梯度洗脱方式测定罗氟
司特有关物质。

本文综合以往文献，针对罗氟司特片在生产、贮存过程可能产生的杂质种类与性质，以0.005 mol·L－1磷酸二氢钾溶液与乙腈为流动相进一步优化梯度洗脱表，以各杂质达到基线分离以及整体分析时效为标准，最终确定表1中
的梯度程序，试验结果表明其可满足罗氟司特片中有关物质检测需要。

3.4 杂质降解途径对供试品实际测定未发现上述降解杂质产生，同时所用辅料也
未干扰杂质峰检出。

通过加速试验，发现罗氟司特片在酸、碱、氧化及高温条件下不稳定，该结果与已有文献报道[9]一致，特别是氧化条件下降解产生N－氧化物外，还发现易产生杂质2、杂质5、杂质6和杂质7，为深入研究本品贮存条件提供参考。

3.5 本文针对罗氟司特片质量控制的实际需求出发，新建立了高效液相色谱法测定
片剂中的有关物质，通过方法学试验与验证表明新建方法不仅可用于罗氟司特片有关物质检查，还为提高本品质量与标准奠定基础。

【相关文献】
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