pH值响应性透明质酸纳米粒的制备及作为阿霉素载体的研究

pH值响应性透明质酸纳米粒的制备及作为阿霉素载体的研究武敬亮;刘晨光;黄振华;林维平;王晓蕾;魏文浩
【摘要】Polymeric nanoparticles were constructed from hyaluronic acid (HA) and histone (His) as a tumor pH-responsitive anticancer drug carrier. As pH decreased from 7. 4 to 5. 5, the particle size increased from 230 to 780 nm, absolute zeta potential increased, and in vitro DOX release increased. DOX-loaded nanoparticles (< 300nm) showed higher cytotoxicity to MCF-7 cells. Cell uptake studies indicate that DOX uptake might be taken place by two ways: endocytosis mediated by HA receptor and uptake of DOX released from DOX-loaded nanoparticles. Consequently, the findings indicate that His-HA nanoparticles are pH-responsive and show a promising application as a doxorubicin carrier.%通过化学交联法合成组氨酸修饰透明质酸耦合物(His-HA),制备载阿霉素纳米粒,分析其pH值响应性和抗肿瘤特征.研究显示,随着pH值的降低(7.4～5.5),纳米粒的粒径增大(230～780nm),zeta电位升高,载药纳米粒的体外释放量增加.细胞毒性实验显示粒径＜300nm的载药纳米粒具更高的毒性.细胞摄入实验表明,阿霉素通过受体介导的胞吞和载药纳米粒的胞外释放两种途径被细胞摄入.以上研究显示组氨酸修饰透明质酸纳米粒具有显著的pH值响应性,具备作为阿霉素药物载体的应用前景.
【期刊名称】《功能材料》
【年(卷),期】2012(043)012
【总页数】4页(P1654-1657)
【关键词】pH值响应性;透明质酸;组氨酸;纳米粒
【作者】武敬亮;刘晨光;黄振华;林维平;王晓蕾;魏文浩
【作者单位】中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003;潍坊医学院药学与生物科学学院,山东潍坊261053;中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003;中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003;潍坊医学院药学与生物科学学院,山东潍坊261053;中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003;中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003
【正文语种】中文
【中图分类】TQ050.4
透明质酸（hyaluronic acid，HA）在体内广泛存在，是一种呈线性带负电的糖胺聚糖，由重复的双糖单位葡糖醛酸与N－乙酰葡糖胺通过β－1，3或1，4糖苷键连接而成。

HA具有较好的生物相容性和生物降解性，其受体CD44和RHAMM在大多数癌细胞过度表达［1，2］，因而，HA 可作为肿瘤药物的靶向载体用于抗肿瘤治疗［3，4］。

肿瘤组织微环境呈弱酸性（pH值为6.5～7.2），而肿瘤细胞内的内涵体和溶酶体具有更强的酸性（pH值为4～6）。

pH值响应性纳米粒在肿瘤组织微环境下能发生质子化或快速化学反应，导致其理化性质改变，进而导致药物的快速释放，促进纳米粒的细胞内吞，以及促使纳米粒从溶酶体/内涵体逃逸，从而实现被动靶向肿瘤细胞的作用［5－7］。

本文以组氨酸为疏水基，通过酰胺反应合成了组氨酸修饰透明质酸耦合物，分析其理化属性。

超声法制备载阿霉素纳米粒，在不同pH值下，分析载阿霉素纳米粒的体外药物释放、细胞毒性以及细胞摄入情况，为进一步将其作为肿瘤靶向药物载体
的研究提供依据。

透明质酸钠（HA，山东福瑞达生物制药有限公司）；碳化二亚胺（EDC）和 N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）（上海共价化学科技有限公司）；盐酸阿霉素（DOX﹒HCl，山西普德药业有限公司）；L－组氨酸（His）、芘（Sigma，USA）、DMEM 培养基（北京索莱宝有限公司）；人类乳腺癌细胞株细胞（MCF－7）（青岛大学）。

其它试剂均为分析纯。

VC750超声波细胞粉碎机，RF－5301PC荧光分光光度计，DAWN HELEOSⅡ动态激光光散射仪，PCS－100型 CO2培养箱，XSZ－D型倒置显微镜，Nikon TE2000－U荧光倒置显微镜，ELX800UV型酶标仪，FLx800B荧光酶标仪。

100mg HA溶于15mL蒸馏水中，磁力搅拌使其溶解，加入EDC和NHS，搅拌使其充分接触反应。

然后加入一定量His，室温搅拌24h。

混合液用蒸馏水充分透析5d，然后真空冷冻干燥，低温保存待用。

将冻干的His－HA耦合物溶于不同pH值的缓冲液中（pH 值为7.4～5.5），用RF－5301PC荧光分光光度计测定芘在 His－HA溶液（0.1mg/mL）中的荧光强度［8］。

测定参数如下：激发光谱为330nm，狭缝宽度为10nm，散发光谱为350～500nm，狭缝宽度为2.5nm，整合时间为3s/nm。

超声法制备 His－HA纳米粒溶液（1mg/mL），用DAWN HELEOSⅡ动态激光光散射仪测定His－HA纳米粒的粒径和zeta电位。

载阿霉素纳米粒的制备参照Park等方法［9］。

具体方法如下：称取100mg His －HA耦合物溶于5mL甲酰胺中；称取10mg阿霉素溶于含三乙胺的二甲基甲酰胺中；将上述两种溶液混合，漩涡振荡混匀，静置过夜。

用蒸馏水透析48h，去除未加载的阿霉素，超声制备纳米粒溶液，冻干保存。

称取3mg冻干的载药纳米粒，溶于5mL不同pH值的缓冲液中（pH值为7.4～5.5），将纳米粒溶液移至透析袋中，密封后分别投入相应pH值的50mL缓冲液
小瓶中，置入恒温摇床振荡（37℃，100r/min）。

定时取出4mL溶液，并补加
等量缓冲液；取出的透析液在紫外分光光度计上测定吸光度（480nm），根据标
准曲线计算释药量。

采用MTT法测定载药纳米粒在不同pH值下的细胞毒性。

用96孔板培养 MCF－
7细胞，培养条件：DMEM高糖培养基，10%胎牛血清，5%CO2，37℃。

利用0.1NHCl和0.1NNaOH调整培养液至相应pH值（7.4～5.5），培养24h后，
每孔加入20μL MTT，继续培养4h，然后每孔加入100μL DMSO，振荡10min，在酶标仪上测定490nm光吸收值。

用96孔板培养MCF－7细胞，细胞贴壁后，移除培养液，加入不同pH值
（5.5～7.4）的载药纳米粒溶液（5μg/mL DOX），并分别在4、37℃继续培养
4h。

用冷PBS溶液（pH值为7.4）冲洗3次，用1%曲拉通裂解细胞，用
ELX800UV荧光酶标仪测定吸收（λex＝478 nm，λem＝594nm）［10］。

用6孔板培养MCF－7细胞，贴壁后，加入载药纳米粒溶液，继续培养2h后，
用PBS冲洗3次，加入4%多聚甲醛固定细胞，然后加入DAPI染色10min，并
用PBS冲洗。

用Nikon Eclipse TE300荧光显微镜观察，拍照。

芘常作为荧光探针来研究纳米粒微环境的性质。

室温下，芘的单体荧光发射谱出现4个特征振动带，其中第一谱带强度（I372）与第三谱带强度（I383）之比与所处环境的极性相关，I372/I383值越小，对应的极性越小，可用I372/I383值表征芘所处介质微环境的改变。

图1显示，随着pH 值降低（pH 值为7.4～5.5），
I372/I383比值增加，这表明在酸性条件下，His－HA耦合物内核极性增加［11］。

粒径和zeta电位是表征纳米粒的主要指标。

图2显示，随着pH值降低，纳米粒
子的粒径从230nm增加至780nm，这可能是由于pH值降低引起His质子化，
进而导致纳米粒球肿胀。

zeta电位反应纳米粒子的表面电荷，研究显示，pH值从
7.4下降到5.5，zeta电位不断升高，但仍带负电荷，这是由于HA的弱酸性（PI
＝2.5）的原因。

为了检测载药纳米粒的pH值响应性，本文研究了不同pH值（7.4～5.5）下载药纳米粒的释放规律。

研究发现，在不同pH值下，载药纳米粒均为先突释后缓释。

12h后，酸性环境（pH 值为5.5～6.4）下阿霉素释放量明显增加，其中，pH值6.0介质中阿霉素释放量是pH值7.4介质的1.98倍，这可能是由于His的质子化作用，使得纳米粒内部失去亲水－疏水作用力平衡，纳米粒的核－壳结构遭到破坏，从而使其包埋的阿霉素迅速大量地释放出来［12］。

以自由阿霉素为对照，MTT法检测载药纳米粒的细胞毒性。

图5显示，与自由阿
霉素相比，在pH值7.4，载药纳米粒具有更强的毒性，随着pH值降低，载药纳
米粒细胞毒性有轻微的降低，低于自由阿霉素。

这可能是由于粒径200～300nm的纳米粒通过受体介导的胞吞被细胞摄入，有效地抵制了P－糖蛋白介导的药物外排，从而显示更高的细胞毒性。

随着pH值降低，粒径变大（300～800nm），受体介导的胞吞效率降低，细胞毒性也相应地下降［13］。

以4℃为对照，分析了不同pH值下载药纳米粒的摄入情况。

研究显示，在4℃，随pH值降低，阿霉素摄入量增加，在37℃，摄入量呈现先降低后提高，其中，
在pH值7.4，细胞在37℃培养下的摄取量是4℃的2.18倍。

原因可能是在4℃下，受体介导的胞吞在被抑制，此时细胞对阿霉素的摄取依赖于载药纳米粒的胞外释放，所以摄取量低，随着pH值降低，胞外释放量增加，细胞对阿霉素的摄取量也增加，这与体外释放实验相一致；在37℃下，受体介导的纳米粒胞吞和载药纳
米粒的胞外释放同时存在，细胞摄取量高，此时粒径大小和胞外释放量都会影响细胞的阿霉素摄入量。

为了定性检测细胞摄入，把载药纳米粒与MCF－7共培养2h，用荧光显微镜观察
细胞摄入情况。

图6显示，阿霉素分散于胞质中，说明阿霉素被摄入至细胞中。

通过化学交联法制备了组氨酸修饰透明质酸耦合物，超声法制备纳米粒，纳米粒具有pH值响应性质：随着pH值降低，内核极性增加，纳米粒径增大，zeta电位升高。

以阿霉素为药物，制备了载阿霉素His－HA纳米粒。

体外释放实验显示，随着pH值的降低，释放量明显增加；载药纳米粒的细胞毒性呈现pH值响应性，小粒径的载药纳米粒（＜300nm）具更高的毒性。

细胞摄入实验表明，阿霉素通过受体介导的胞吞和载药纳米粒的胞外释放两种途径被细胞摄入。

以上结果显示，His－HA纳米粒具有pH值响应性，具有作为抗肿瘤药物载体的应用前景。

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