苗药验方皮部熏洗对骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡与增殖的影响

苗药验方皮部熏洗对骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡与增殖的影响姚合梅;王政;崔瑾;陈盼碧;王兴桂;胡科
【摘要】[Objective] Investigate Miao medicine fumigation and washing treating skin osteoarthriti(Osteoarthritis, OA) for the partial mechanism.[Methods] As for the 42 healthy rats, the randomly selected 8 of them were not built into a model group but as a normal control group, and the remaining 34 were adopted to establish the rat model, regarded as OA model of 4% Papuan inter-articulation injection. After checking whether the randomly selected 2 de-tection models were successful or not a week later, we adopted 32 model rats and randomly divided them in the model group, smoking group, washing and fumigation group and then after 4 weeks of treatment, we kil ed them and cut off their joints, using the HE staining for Mankin's testing, the Im-munohistochemistry staining method of PCNA and TGF-β1 in the determination of staining method. [Results] The Mankin's testing results showd:com-pared with the model group, the fumigation and washing group had significant difference. The normal group expressed a smal amount of PCNA and the expression of TGF-β1 positive cel s in the model group, the treatment group were higher than the model group( P<0.05), wherein the fumigation group compared with model group had significant difference (P<0.01).[Conclusion] (1) The intervention by Miao medicine fumigation on skin, knee Pain activi-ty behavior of OA model rats had obvious improvement.(2) Miao medicine fumigation regulating cartilage skin PCNA and TGF-β1, promoted the
prolif-eration of chondrocyte, accelerated the cartilage repair, and achievd the purpose of preventing OA. (3) The treatment of fumigation and washing group were more obvious than the single fumigation group and washing group.% [目的]探讨苗药皮部熏洗法治疗骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的部分机理。

[方法]取42只健康清洁级大鼠，随机选取8只不造模作为正常对照组，其余34只采用4%木瓜蛋白酶关节腔注射建立大鼠OA模型,一周后随机选取2只检测模型成功与否，将造模成功的32只大鼠随机分为模型组、熏组、洗组和熏洗组，治疗4周后处死动物,切取关节,采用HE染色进行关节软骨病理评分（Mankin's评分）,免疫组化染色法测定PCNA及TGF-β1的表达。

[结果]Mankin's评分结果显示：与模型组比较,各治疗组均降低Mankin's 评分(P<0.05，P<0.01),且熏洗组与熏组、洗组相比差异显著(P<0.01)。

正常组有少量PCNA和TGF-β1阳性细胞的表达,模型组中表达明显,治疗组均比模型组升高(P<0.05)，其中熏洗组与模型组比差异显著(P<0.01)。

[结论](1)通过苗药皮部熏洗的干预，对OA模型大鼠的痛行为及膝关节活动有明显的改善作用。

(2)苗药皮部熏洗通过上调软骨PCNA和TGF-β1的表达，促进软骨细胞的增殖，加速软骨的修复，达到防治OA的目的。

(3)熏洗法治疗大鼠OA比单独运用熏法、洗法效果更明显。

【期刊名称】《浙江中医药大学学报》
【年(卷),期】2013(000)007
【总页数】4页(P893-896)
【关键词】苗药;验方;皮部熏洗;外用疗法;骨关节炎;细胞凋亡;增殖调控基因;增殖细胞核抗原
【作者】姚合梅;王政;崔瑾;陈盼碧;王兴桂;胡科
【作者单位】河南南阳油田总医院河南，南阳 473132;贵州省黔东南州民族医药研究所;贵阳中医学院;贵阳中医学院;贵阳中医学院;河南南阳中心医院
【正文语种】中文
【中图分类】R331
骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种慢性、退变性关节疾病，是关节软骨发生变性，继之邻近软骨增生、骨化而形成的关节病变，是最常见的老年病。

目前认为OA病理学特征是关节软骨损伤，发病中心环节是关节软骨退行性改变[1]。

OA 以关节疼痛、僵硬、活动障碍为主要临床特点，是引起中老年人疼痛和伤残的主要原因。

但其确切发病机制尚不明确，以往研究大多侧重于基质酶性降解或合成新的基质受到抑制而导致软骨的破坏。

随着对其机制研究的深入，逐步认识到软骨细胞损伤，特别是软骨细胞凋亡与增殖平衡紊乱是其主要机制，因此，对OA的研究应从软骨细胞着手。

正常的软骨细胞是维持细胞外基质稳定的必要条件，细胞凋亡是OA关节软骨退变的关键因素[2]。

本课题重点从软骨细胞凋亡与增殖的角度去探讨，主要研究苗药皮部熏洗对OA大鼠软骨中PCNA和TGF-β1表达的影响。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物42只健康Wistar大鼠，清洁级，体重200～220g，雌雄各半，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，动物合格证号：0004161。

1.1.2 药物、试剂苗药验方[5]：透骨香30g，见血飞20g，黑骨藤 20g，追风伞20g，大风藤 10g，艾纳香 10g，艾叶10g，白酒30mL等。

用法：将以上诸药
用清水浸泡30min后，放入砂锅内煎煮，煎煮成浓度为70%的药液备用。

实验用药物由贵州贵阳同济堂药店提供。

木瓜蛋白酶：P-3250，由北京夏斯公司提供，
最小值0.52μg·mg-1，批号 200909；半胱氨酸：天津市科密偶化学试剂有限公
司提供，批号Q\12HB 4128-2009；乙二胺四乙酸二钠：成都金山化学试剂有限
公司，批号:060220；PCNA和TGF-β1免疫组化试剂由博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法
1.2.1 动物分组及造模所有大鼠适应性喂养7d后，随机选取8只不造模作为正常
对照组，其余34只采用4%木瓜蛋白酶关节腔注射建立大鼠OA模型，1周后随
机选取2只检测模型成功与否，将造模成功的32只大鼠随机分为模型组、熏组、洗组和熏洗组，每组大鼠雌雄分开分笼饲养。

1.2.2 造模方法以5%异氟烷(与空气混合)轻度吸入性麻醉。

用微量注射器迅速抽取4℃、4%的木瓜蛋白酶溶液与0.3mol·L-1半胱氨酸溶液混合液20μL，在后外侧
注入双后肢膝关节腔内。

34只大鼠依次进行，记下注射的顺序。

对任意1只大鼠，于实验造模进程的第1d、第4d、第7d，分别注射4℃、4%的木瓜蛋白酶溶液1次，共注射3次。

于第3次注射完毕的第1d起，可认为获得稳定的膝OA模型[3-4]。

1.2.3 治疗方法模型复制后第8d开始进行治疗，熏组进行熏蒸；洗组用药棉蘸取
药液洗渍患肢；熏洗组先熏后洗。

均采用40～45℃，68%～70%苗药液。

熏组每只熏蒸20min/d，洗组每只洗渍患肢20min/d，熏洗组用同样的熏蒸法和洗法，先熏后洗各10min，1次/d，10d为l疗程，疗程间休息1d，共治疗3个疗程。

1.2.4 标本采集所有实验大鼠采用颈椎脱臼法处死后，切取膝关节，剔净软组织，用PBS缓冲液冲洗后，肉眼观察并照相后用10%中性甲醛溶液固定，待测。

1.2.5 检测指标及方法取胫骨平台处软骨，常规处理，进行石蜡包埋，切片3μm，
先予HE常规染色。

光镜观察HE及Mankin’s评分，见表1。

然后分别进行PCNA和TGF-β1免疫组化染色。

表1 Mankin's软骨组织学分级标准Tab.1 Mankin's cartilage histological grading standard分级项目评分IⅡⅢⅣ炎性细胞浸润无或极少量炎细胞浸润少许炎细胞浸润(≤15个／HP)中量炎细胞浸润(16～3O个／HP)大量炎细胞浸润(＞30 个／HP)表层软骨细胞分裂增生正常轻度中度重度潮线完整多层次模糊血管通过软骨破坏范围正常轻度中度重度0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3
1.2.5.1 常规 HE染色
1.2.5.2 免疫组织化学染色采用超敏SP免疫组织化学方法观察PCNA和TGF-β1在OA软骨中的分布及变化。

1.2.6 阳性结果判断PCNA胞核呈棕色者为阳性。

鉴于关节软骨细胞少，尤其在OA时，软骨破坏，剥脱，细胞少的情况下，PCNA、TGF-β1的评定方法为根据阳性细胞数占高倍镜视野下细胞总数百分率。

1.2.7 统计学分析统计分析采用SPSS18.0统计软件处理，数据以x±s表示，组间比较用One-Way ANOVA方差分析，以P﹤0.05、P﹤0.01为有统计学意义和显著性标准。

2 结果
2.1 光镜下观察HE及Mankin's评分光镜下观察结果显示，正常组关节软骨4层结构清晰，软骨面光滑、完整，软骨细胞排列整齐，基质染色均匀。

模型组滑膜部分呈结节样增生，软骨细胞减少，软骨下骨暴露，骨赘形成，血管增生明显，潮线不完整或消失；熏组及洗组软骨表面稍不平整，裂隙少，细胞排列较规则，增生明显，潮线模糊。

熏洗组软骨表面光滑、完整，细胞排列规则，结构层次清晰，潮线清楚。

Mankin's评分结果显示，与正常组比较，模型组Mankin's评分的分值升高，具有显著性差异（P＜0.01）。

与模型组比较，各治疗组的Mankin's评分值
均降低（P＜0.05或P＜0.01），见表 2。

表2 Mankin's 评分（x±s）Tab.2 Mankin's score(x±s)注：与正常组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

Note：Compared with the normal group,**P＜0.01；compared with the model group,△P＜0.05,△△P＜0.01.组别 n Mankin's评分（平均积分）正常组8 0.53±0.50模型组 8
8.50±1.60＊＊熏组8 5.75±1.28△洗组8 6.50±1.77△熏洗组8 4.13±1.98△△2.2 苗药皮部熏洗对大鼠膝关节软骨PCNA、TGF-β1表达的影响正常组有少量PCNA阳性细胞的表达；模型组及治疗组表达明显，与正常组比有极显著性差异（P＜0.01）；各治疗组中的表达率较模型组升高（P＜0.05），其中熏洗组具有极显著性差异（P＜0.01），但熏组、洗组之间无差异（P﹥0.05）。

见表3。

表3 各组对大鼠膝关节软骨PCNA表达(x±s；%)Tab.3 All groups expression of rats'knee joint cartilage PCNA expression(x±s；%)注：与正常组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

Note:Compared with the normal group,**P＜0.01;compared with the model group,△P＜0.05,△△P＜0.01.组别 n PCNA正常组8 2.51±0.85模型组8 13.74 ±4.30＊＊熏组 8 24.85 ±5.21＊＊△洗组8 23.42 ±4.79＊＊△熏洗组8 28.13 ±5.75＊＊△△
TGF-β1在正常组有少量表达,造模及治疗后明显增加,模型组、熏组、洗组和熏洗组与正常组比有极显著性差异（P＜0.01），各治疗组与模型组比有显著差异（P ＜0.05），但熏组、洗组、熏洗组之间无差异（P﹥0.05）。

具体见表4。

表4 各组对大鼠膝关节软骨TGF-β1表达(x±s；%)Tab.4 The expression of all groups rats knee cartilage TGF-β1(x±s；%)注：与正常组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。

Note:Compared with the normal group,＊P＜0.05，**P＜0.01;compare with the model group,△P＜0.05.组别n TGF-β1正常组8 8.98±1.88模型组8 29.41 ±8.04＊熏组 8 43.43 ±10.52＊
＊△洗组8 39.22 ±7.93＊＊△熏洗组8 42.35 ±10.41＊＊△
由表3、4可以看出，熏组、洗组、熏洗组与模型组相比都有差异（P＜0.05），其中熏洗组有显著性差异（P＜0.01），熏组、洗组之间比较无差异。

3 讨论
湿热下注、瘀血阻络、经脉不通是膝骨关节炎的发病关键。

膝骨性关节炎的发病病位在骨，而湿热下注、瘀血阻络、经脉不通是其发病的主要原因。

本研究根据此特点，从而确立了清热利湿、活血化瘀、解毒、疏经通络等这一治疗原则，再根据苗医苗药本身所具有的特性，故选择苗族苗医外治法——苗药熏洗疗法。

PCNA是ProliferatingCellNuclearAntigen的简称，指增殖细胞核抗原，是一种分子量为36KD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白。

李平[6]等研究表明腰痛舒胶囊通过调节软骨bcl-2、p53以及软骨面、滑膜的PCNA和TGF-β1的表达,来延缓软骨细胞的凋亡,抑制滑膜的增殖促进软骨的修复。

TGF-β是一族具有多种功能的蛋白多肽,TGF-β1是TGF-β的五种异构体之一，存在于大多数哺乳动物。

TGF-β影响软骨细胞的发育、增殖分化、在软骨的修复重建、细胞外基质的形成过程中发挥重要的作用。

目前认为的骨关节炎的病理学特征是关节软骨的损伤。

关节软骨发生退行性改变是其发病的中心环节（软骨的变性、丢失，继之邻近软骨增生，骨化而形成的关节病变[5]），而造成软骨变性的重要因素就是关节软骨细胞外基质的合成与降解的失衡，其中起决定性作用的是软骨细胞的凋亡。

软骨细胞的过度凋亡，必然导致软骨破坏，但同时也启动了机体的增殖，破坏与增殖的平衡关系决定病变的趋势。

对软骨而言，软骨细胞反应性增殖，形成细胞集聚现象，这是软骨细胞代偿的表现，反映在外界损伤因素作用下，软骨细胞通过增殖来代偿，维持平衡的一种状态。

免疫组化检测软骨细胞PCNA的表达可以反映软骨细胞的增殖状况[7]，也可通过TGF 的表达来反映。

本实验观察结果表明正常组未见PCNA阳性细胞的表达；造模组
在软骨表浅层表达明显，熏洗组较造模组升高。

提示熏洗疗法能提高软骨的增殖，而促进软骨的修复。

TGF-β1表达在正常组有表达，在造模中明显表达；在熏洗组软骨的浅表层表达增强。

这也反映了熏洗疗法具有促进软骨修复的作用。

参考文献：
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