步骤
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五．底物浓度对ppo活力的影响:
1.不同浓度的邻苯二酚溶液的配制:
分子量：110.11
0.002mol／L:取0.02202g邻苯二酚溶于水中，定容至10ml，将溶液转入棕色试剂瓶中备用。
0.005mol／L:取0.05505g邻苯二酚溶于水中，定容至10ml，将溶液转入棕色试剂瓶中备用。
0.008mol／L:取0.08808g邻苯二酚溶于水中，定容至10ml，将溶液转入棕色试剂瓶中备用。
0.01mol／L:取0.11011g邻苯二酚溶于水中，定容至10ml，将溶液转入棕色试剂瓶中备用。
0.08mol／L:取0.8808g邻苯二酚溶于水中，定容至10ml，将溶液转入棕色试剂瓶中备用。
0.1mol／L:取1.1011g邻苯二酚溶于水中，定容至10ml，将溶液转入棕色试剂瓶中备用。
0.2mol／L;取22.02g邻苯二酚溶于水中，定容至10ml，将溶液转入棕色试剂瓶中备用。
0.3mol／L:取3.3033g邻苯二酚溶于水中，定容至10ml，将溶液转入棕色试剂瓶中备用。
0.4mol／L:取4.4044g邻苯二酚溶于水中，定容至10ml，将溶液转入棕色试剂瓶中备用。
2.具体步骤：
（1）打开722型分光光度计，预热20—30分钟。
（2）取4个比色皿，分别装入pH6.5的磷酸盐缓冲液，其中一个作为对照，消零，测其他3个比色皿的A值，记录数据，以消除误差。
（3）取pH6.5，0.2mol／L磷酸缓冲溶液6.6mL，加0.002mol／L邻苯二酚0.9mL；
（4）混匀后于30℃恒温水浴锅中预热5min，迅速加入0.5mL（不确定，可以换成1 mL，酶尽量过量）PPO透析液;
（5）混匀后立即用分光光度计在420nm波长下测其A值
（6）每隔30s读取1次A值，读取11次为止，3个比色皿均读11次，记录并计算PPO活性。
（1个酶活性单位为每毫升酶液在1min内使A值升高0.001(0.001A／min)）
（7）取pH6.5，0.2mol／L磷酸缓冲溶液6.6mL，加xmol／L(x: 0.005、0.008、0.01、0.08 、0.1、0.2、0.3、0.4)邻苯二酚0.9mL；
（8）重复上述4--6步骤
（9）绘图，根据双倒数法求米氏常数和最大速度。
六．抑制剂对酶的影响：
抗坏血酸(0．02％~ 1%): 分子量：176.12
取xg抗坏血酸溶于水中，定容至10ml，将溶液转入棕色试剂瓶中备用。
百分含量0.02 0.10 0.30 0.60 0.80 1.0 X 0.002 0.01 0.03 0.06 0.08 0.1
(0.05％~ 0.3%) 分子量：338.23
EDTA-Na
2
百分含量0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 X 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 CaCl
(0.5%-2.0%) 分子量：110.98
2
百分含量0.5 0.8 1.2 1.5 1.8 2.0 X 0.05 0.08 0.12 0.15 0.18 0.20 柠檬酸(0.2%-1%) 分子量： 192.14
百分含量0.2 0.4 0.5 0.7 0.9 1.0 X 0.02 0.04 0.05 0.07 0.09 0.1 NaCl(0.5%-2.0%) 分子量：58.5
百分含量0.5 0.8 1.0 1.3 1.6 2.0 X 0.05 0.08 0.1 0.13 0.16 0.2 硫酸氢钠(0.01%-0.05%) 分子量：120.06
百分含量0.01 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 X 0.001 0.002 0.0025 0.003 0.004 0.005 硫脲（0.1%-2.0%）分子量：76.12
百分含量0.1 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 X 0.01 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 二乙基二硫代氨基甲酸钠（0.05%-2.0%）分子量：225.31
百分含量0.05 0.20 0.50 1.0 1.5 2.0 X 0.005 0.02 0.05 0.1 0.15 0.2 四硼酸钠(0.4％-2．0％) 分子量：381.37
百分含量0.4 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 X 0.04 0.08 0.1 0.12 0.16 0.2 巯基乙醇（0.5%-2.0%）分子量：78.14
百分含量0.5 0.8 1.2 1.4 1.7 2.0
X 0.05 0.08 0.12 0.14 0.17 0.2
步骤：
抗坏血酸抑制剂的影响：
（1）打开722型分光光度计，预热20—30分钟。
（2）取4个比色皿，分别装入pH6.5的磷酸盐缓冲液，其中一个作为对照，消零，测其他3个比色皿的A值，记录数据，以消除误差。
（3）取pH6.5，0.2mol／L磷酸缓冲溶液6.6mL，加0.002mol／L邻苯二酚0.9mL，再加入0.5mL x%抗坏血酸抑制剂；
（4）混匀后于30℃恒温水浴锅中预热5min，迅速加入0.5mL（不确定，可以换成1 mL，酶尽量过量）PPO透析液;
（5）混匀后立即用分光光度计在420nm波长下测其A值
（6）每隔30s读取1次A值，读取11次为止，3个比色皿均读11次，记录并计算PPO活性。
（1个酶活性单位为每毫升酶液在1min内使A值升高0.001(0.001A／min)）
（7）绘图，说明抑制剂对酶的影响。