基因芯片在环境毒理学研究中的应用进展

基因芯片在环境毒理学研究中的应用进展
倪余文　梁鑫淼①　陈吉平　张　青
(中国科学院大连化学物理研究所,大连116011)
摘　要　基因芯片可以将大量的DNA 信息集成到1cm 2左右的芯片上,对生命信息具有大规模平
行处理的能力,为环境毒理学研究提供了一个理想的平台。

基因芯片可以精确地完成污染物对人类基因表达影响的分析,并对污染物进行分类与分级,筛选毒物靶标和确定毒性机理。

本文描述了基因芯片技术、毒理学应用研究现状及应用前景。

引用文献29篇。

关键词　基因芯片　环境毒理学　污染物
Advance in gene chip application in environmental toxicology
Ni Yuwen Liang Xinmiao Chen Jiping Zhang Qing
(Dalian Institute of Chemical Physics ,Chinese Academy of Sciences ,Dalian 116011)
Abstract G ene chip may integrate abundant information of DNA within a 1cm 2array and have an ability to deal with massive life 2information simultaneously.It provides a valu 2able platform for environmental toxicology research.G ene chip may be used not only to accu 2rately perform the analysis of human gene expression on which contaminations have an effect but also to categorize and classify contaminations.Progressively ,it can be used to screen tox 2icant targets and to clarify the mechanism of action of contaminations.G ene chip application in the field of toxicology are summarized in the paper.The 29references are reviewed.
K ey w ords gene chip ;environmental toxicology ;contaminations
生物芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项新技术,它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对蛋白质、DNA 以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。

常用的生物芯片分为三大类,即基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室。

基因芯片是按特定的排列方式固定有大量DNA 探针/基因片段的硅片、玻片、塑料片[1,2]。

目前,该技术平台上开展的研究主要集中在基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序和基因毒理学分析等领域。

从20世纪80年代初SBH (sequencing by hybridization )概念的提出[3],到20世纪90年代初以美国为主开始进行的各种生物芯片的研制,不到10
年的时间,芯片技术得以迅速发展。

生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。

①通讯联系人
第2卷第4期环境污染治理技术与设备
Vol .2,No .42001年8月Techniques and Equipment for Environmental Pollution Control
Aug .,2001
芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列,能够在短时间内分析大量的生物分子,快速准确地获取样品中的生物信息。

基因芯片技术在毒理学研究领域也具有广阔的前景,对诸如污染物分类分级、毒性机制及剂量效应关系的确定、生物评价等毒性毒理研究方面将产生革命性的影响。

1　基因芯片的类型及制作方法
基因芯片的制作主要有接触点加法、喷墨法和原位合成法等。

芯片种类较多,制备方法也不尽相同,但基本上可分为两大类:一类是原位合成法[4,5];一类是点样法[6]。

原位合成适用于寡核苷酸阵列。

将光刻蚀技术和DNA的化学合成法相结合,把光不稳定保护基团保护的四种DNA模块固定在玻片上,通过光脱保护,用少量的保护寡核苷酸和试剂按照设计的序列进行DNA合成。

技术原理是在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个光敏保护基。

合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护,然后一个5’端保护的核苷酸单体连接上去,这个过程反复进行直至合成完毕。

使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列,在合成循环中探针数目呈指数增长。

某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸,通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。

该方法合成的芯片密度和精度较高,但需要花费大量的时间去设计和制造价格很高的照相掩蔽网。

目前美国Affymetrix公司已有同时检测6500个已知人类基因的DNA 芯片,并且正在制备含500000—1000000个寡核苷酸探针的人类基因检测芯片。

点样法分为接触点样法和喷印点样法。

点样法多用于大片段DNA,有时也用于寡核苷酸,甚至mRNA。

点样法需要合成好的DNA或寡核苷酸。

两种点样法的区别只在于接触与否。

与原位合成法比较点样法较简单,只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其他材料上即可[6]。

2　基因芯片的杂交方法
待分析基因在与芯片结合探针杂交前必须进行分离、扩增及标记。

根据样品来源、基因组成及检测方法和分析目的不同,采用的基因分离、扩增及标记方法各异。

高度集成的微型样品处理系统如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和发展方向[7]。

杂交条件的选择与研究目的有关。

影响异源杂交双链形成的因素包括靶标浓度、探针浓度、杂交双方的序列组成、盐浓度及温度。

选择的条件是使成千上万对杂交反应中的最大多数处于最佳状况中,使尽可能多的正确配对物不遗漏,错配的杂交降低至最低[8]。

因此表达检测需要长的杂交时间、更高的严谨性、更高的样品浓度和更低的温度,这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。

由于探针和检测基因均带负电荷,因此影响它们之间的杂交结合,为此有人提出用不带电荷的肽核酸(PNA)做探针[9]。

虽然PNA的制备比较复杂,但与DNA探针比较有许多特点,如不需要盐离子,因此可防止检测基因二级结构的形成及自身复性。

由于PNA2DNA结合更加稳定和特异,因此更有利于单碱基错配基因的检测。

3　基因芯片的扫描和读取[7,10]
现有的大部分基因芯片是荧光标记芯片。

完成基因芯片测定的是基因芯片扫描仪。

根据基因芯片扫描仪采用的光电耦合器件,可以将芯片扫描仪分为激光共聚焦型和CCD型。

前者的特点是灵敏度和分辨率较高,扫描时间长,比较适合研究用;后者的
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环境污染治理技术与设备 2卷　
特点是扫描时间短,灵敏度和分辨率较低,比较适合临床诊断用。

根据激发光源的不同还可将芯片扫描仪分为激光型和非激光型。

基因芯片多用激发波长较长、斯托克斯位移较大的荧光染料标记,以提高芯片测定的稳定性、降低背景和提高灵敏度。

实践中首先用荧光素标记扩增(也可以有其他放大技术)过的靶序列或样品,然后与芯片上的大量探针进行杂交,之后将未杂交的分子洗去。

这时,用落射荧光显微镜或其他荧光显微装置对片基进行扫描,采集每点荧光强度并对其进行分析比较。

由于正常的Watson2Crick配对双链要比具有错配碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性,如果探针与样品分子在不同位点配对有差异则该位点荧光强度就会有所不同,而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。

用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号,通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。

常用的基因芯片分析方法主要有直观视图分析、统计学分析和生物学分析。

4　基因芯片在毒理学研究中的应用大量的人工、天然化合物及其次生产物严重威胁人类的健康并造成生态环境的破坏。

为了了解这些物质的毒性及其作用机制,通常利用动物试验进行研究评价[12]。

近年来,基因芯片技术应用于毒理学研究已逐渐成为该领域的热点之一。

基因芯片技术可以帮助科学家解决诸多的基因毒理学问题,提高基因毒理学研究的效率和准确性。

N IEHs的研究者提出基因芯片技术可应用于以下环境科学研究领域:(1)通过评价分子信号对化学物质暴露的响应确定毒性专一的基因表达模式;(2)阐述环境物质引起基因表达变化的反应机制;(3)使用毒性诱导的基因表达作为毒物暴露的生物标记;(4)研究将一种化合物的毒性影响推及另一种化合物的方法;(5)研究混合化学物质毒性的相互作用;(6)解释低剂量暴露与高剂量暴露对基因表达影响的对应关系;(7)研究毒物与毒物诱导基因表达的剂量效应关系;(8)在毒物暴露之前之后进行生物个体间基因表达的比较;(9)研究年龄、食物与其他因素对基因表达的影响[11]。

4.1　毒物靶标的筛选
靶标筛选的关键问题是选择合适的靶标和提高筛选效率。

基因芯片作为一种高度集成化的分析手段能够很好地胜任。

基因芯片可以从疾病及药物两个角度对生物体的多个参量同时进行研究以发掘、筛选靶标(疾病相关分子)并同时获得大量其他相关信息。

利用基因芯片可比较正常组织及病变组织中大量相关基因表达的变化,发现疾病相关基因作为药物筛选的靶标[13]。

基因芯片在药物研究中的应用同样可以用于毒物靶标的筛选,这种筛选具有平行和快速的特点。

由鼠的113种cDNA作为微阵列单元组成的基因芯片可以检验鼠肝脏被暴露到肝毒素(包括peroxisome proliferator、醋氨酚或它的相应代谢物、多环芳烃、苯并(a)芘)时的基因响应[14],这种方法可用于有毒化合物的筛选及指定化合物代谢机理的研究。

4.2　污染物的分类与分级
cDNA微阵列或寡核苷酸芯片可以用于基因表达分析,包括基因组DNA的序列变化分析、筛选DNA突变的个体或基因多态性研究。

基因芯片技术用于毒物(或药物)作用下受体基因组目标模式的变化,具有并行解释上千种基因的能力,为研究化学物质或药物对生物系统的影响提供了新的认识工具[15,16],能够使被研究的毒理学问
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　4期 倪余文等:基因芯片在环境毒理学研究中的应用进展
题发生革命性的方法学进步。

组织中基因表达的变化可以是病理学、生理学或环境暴露的结果。

这些变化可以通过cDNA或寡核苷酸基础上的微阵列进行研究,直接比较处理和未处理两种RNA 样品的基因表达谱图,获得分析结果。

芯片技术可以用于确定单独的或混合的毒性物质的遗传毒性,并测定低剂量下的毒性影响。

根据基因芯片测定的基因表达谱图对暴露到不同类型毒性物质的基因表达信号进行分析和比较,结合并发的毒性响应,微芯片技术能够直接分类和分级毒物的影响。

根据测定的毒物信号获得一系列基因表达变化信息,在甄别处理样品与未处理样品基因诱导和抑制信号的基础上,交叉分类所有实验数据并选择交叉样品系列的不同信号评价毒性,根据响应信号的不同评价原型毒物的等级。

使用基因芯片对毒性和非感受性的响应可以在临床出现明显的组织毒性前测定毒性,提供一个快速、灵敏的用于改善临床尝试必需的安全性代用品。

4.3　毒性机制及剂量效应关系的确定
在环境健康科学领域,cDNA微阵列技术将用于确定潜在的风险。

基因芯片可以评价模型系统、通过体内和体外实验去比较基因表达的变化,以此作为化学影响的结果是比较方便的。

在那些确定的模型系统中,用已知毒性物质处理,如多环芳烃、生殖毒素、氧胁迫和雌激素化合物,毒性物质导致的信号响应将改变基因芯片上基因表达的信号,这些信号代表组织或分子对毒性物质的响应[12]。

分子对不同毒性物质的反应将诱导很多对毒性产生响应的指示基因表达上的变化。

而且一套基因表达对一类特殊化合物的响应是特定的,这种方法尤其适于低剂量毒物实验。

使用cDNA芯片研究人类脊髓细胞对电离辐射(IR)响应,处理和未处理细胞的荧光标记RNA杂交后通过计算机分析发现了基因表达水平的相对变化[17]。

48个序列、30个未确定的响应基因明显地受IR调节,这些被IR及其他胁迫诱导的一系列基因包括以前被表征过的基因存在于12种人类组织细胞中。

这种响应广泛地存在于不同起源的组织与不同背景的基因中,并发现两个新的IR响应基因。

由已知毒性物质确定的响应基因,可以通过未知的、怀疑的毒性物质处理同样系统产生的信号与一个或多个标准信号进行比较来确定。

这可以标记确定化合物作为潜在的致突变、致畸、致癌物或毒物,并通过反应信号传导途径的确定阐明毒性的反应机理[18]。

野生型霉菌对药物暴露的信号响应与霉菌突变基因的比较研究表明,基因芯片可以确定化合物作用的潜在目标和实现药物依赖性在基因表达中的区分[19]。

特制的cDNA芯片可以确定人体及其他生物体内毒性反应的作用目标[20]。

cDNA芯片允许同时测定受体反应、共栖物代谢酶、细胞循环组分、癌基因、肿瘤基因、DNA碱基对基因、雌激素响应基因、氧胁迫基因和其他与细胞健康有关的基因。

随着芯片技术的发展,可以很容易地评价剂量效应关系。

几乎没有例外,基因表达总是在毒性作用下被改变,包括直接的和间接的毒物暴露[18]。

肝毒素能够通过不同的机制引起肝损伤,基因芯片技术可以用来确定与四氯化碳肝毒性相关的基因转录[21]。

被标记的人类肝细胞被暴露到四氯化碳8h后杂交到人类cDNA微阵列膜上。

47个不同基因的表达均因肝毒素上调或下调两倍以上,其中白细胞介素28(IL28)被上调7倍。

四氯化碳引起Hep G2细胞中白细胞介素28的mRNA 表达快速增加,而且这种增加与延后的白细胞介素28蛋白水平的增加直接相关,由此可以推测肝毒素的作用机制。

当前,毒理学面临的挑战是在给定的实验条件下确定给
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环境污染治理技术与设备 2卷　
定毒物作用下基因表达的特征和特有的模型。

基因芯片技术提供了一个理想的平台用于这种平行分析并将成为新的毒理学检验的基础。

在最近几年,大量的体外检测技术被用于毒性的测定,其中很多是测量毒性诱导下DNA的变化。

这些体外评价包括Ames检验、Syrian田鼠胚胎细胞转录评价、micronucleus评价、同源染色体改变测定等。

在很多情况下,使用基因芯片技术测定基因表达的变化可以使毒性指标更特征化、更灵敏、更易测量。

N IEHs的科学家通过对毒性诱导的基因表达谱图进行测定和比较,确定毒性,并推测它们的反应机制[12]。

在一个或多个定义的模型系统中,剂量效应关系和时间过程参数用于估计给定的原型毒物毒性,然后细胞被固定毒性水平的化合物处理,收获RNA,毒性诱导基因表达的变化通过在基因芯片上的杂交被确定。

为了更好的表征细胞生理过程对不同类型毒素损伤的响应结果,在芯片中包含一些功能基因和对PAHs、二 类化合物、peroxisome pro2 liferators、雌激素化合物与氧胁迫响应的基因[18],通过怀疑毒物响应结果与已知毒物响应结果的比较,在同一模型系统中研究未知毒物的反应机制。

4.4　改进生物评价方法
基因与环境相互关系研究考虑的是多因子疾病如癌症、糖尿病、心脏病、哮喘和神经紊乱等的评价。

个体的基因组成可以影响人体暴露到环境后患病的危险性,基因芯片可以反映出环境胁迫下来自不同个体的基因表达谱发生的变化,确定新的致突变、致畸、致癌物和药物的毒性,改进现有的检验模型,了解毒物的反应机理。

基因表达信号能够测定不同类型的组织特异基因,而且新的化合物能够通过那些特征信号被筛选出来,通过基因芯片可以迅速地评价不同个体对环境胁迫的响应[22]。

这有助于生物评价方法的选择或替代性生物方法的发现,同时减少实验时间、降低成本以及减少动物的使用。

将芯片技术加入到标准的生物评价方法中,可以显著地提高生物评价的灵敏性和判断性。

牛津大学的Pennie等构建了ToxBlot芯片,对基因芯片技术应用于毒性机制和毒性预测进行了研究[23]。

ToxBlot 芯片能够完成有关内分泌的破坏、肝细胞毒性与胰岛素敏感(insulin2sensitizing)化合物骨髓毒性的研究。

N IEHs致力于基因芯片在环境毒理学上的应用研究,并先后生产出两种毒理学研究芯片ToxChip v1.0和ToxChip v2.0[18]。

其中ToxChip v1.0包含由2090个人类基因组成的一个子阵列。

ToxChip可以减少毒理学实验对实验动物的依赖,允许使用较低剂量的毒物进行实验,使得实验更接近于人类暴露的水平,而各种动物评价方法是无法实现如此低剂量实验的。

通过研究暴露到毒性物质的持续时间与产生的基因表达谱图相关性的研究,基因芯片可用于研究急性与慢性毒性之间的相关性和确定毒物的其他作用[24]。

目前使用的评价化学毒素暴露安全性的方法是建立在测定组织毒性水平或代用的毒性指标基础上的。

由于基因表达是一个灵敏的结点,基因芯片技术测定的基因表达可以用做新的生物指标或更准确地确定暴露毒性。

例如,包含生物体内异物代谢酶、谷胱甘肽调节蛋白酶、DNA修补酶、热冲击蛋白与辅酶基因表达序列的芯片被用于研究暴露到beta2NF的基因表达[25]。

鼠体中细胞色素P4501a1与P4501a2上调在beta2NF供给后8h达到最大,基因芯片测定的P4501a2的变化较对照高10倍。

使用包含597个人类基因的cDNA芯片测定HeLa细胞暴露到BPDE后基因表达的变化[26],在0.4M BPDE中暴露53h后,9种基因的表达被上调,3种基因表达被下调。

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　4期 倪余文等:基因芯片在环境毒理学研究中的应用进展
基因芯片在环境容量控制研究中用于测量潜在污染物对生物基因表达谱图的影响。

通过样品暴露前和暴露后的基因表达谱图进行比较,获得毒性暴露的特征和相应的安全因子。

基因表达在个体之间是不同的,这种不同能够成为环境起源的人类疾病的影响因子。

N IEHs已经开始环境基因组目标的研究以确定包括在环境疾病中的200个基因共同的序列多态性[27]。

例如, N IEHs对暴露到PAHs和其他污染物环境中的波兰煤炭炉工人的血液、淋巴系统基因表达进行了研究。

这种研究一个重要的考虑是基因表达可以被其他因素影响,如食物、健康状况、个人习惯等,减少这些因素的影响必须完成大量处理样品与对照样品的比较。

一个新的领域基因毒理学正在发展起来,研究基因差异与毒物易感性的关系[28,29]。

在人类对疾病易感性个体变化的认识上基因毒理学将产生巨大推动作用。

另外,芯片科学家正在着手构建美国国家公众数据库作为基因表达的响应数据库,同时致力于来源于不同平台的数据共享,最终实现实验室之间、不同平台之间与国家数据库间数据的交叉分析与共享。

将来,化学物质对人类和环境的影响评价将主要依靠来源于芯片杂交的结果[14]。

5　结　语
基因芯片技术为人类基因组学、人类疾病、药物和毒性物质的研究提供了充分的发展空间。

目前,国外已经有10多家从事DNA芯片研究的公司,它们的芯片技术各具特色,应用目的也不尽相同。

基因芯片技术发展到今天不过短短几年时间,虽然还存在这样或那样的问题,但基于它对生命信息进行大规模平行处理的能力,利用基因芯片可快速、高效、并行地获得空前规模的生命信息,基因芯片将成为今后生命科学研究和医学诊断中革命性的方法。

基因芯片最有可能将人类大约100000个基因集成到1cm2的载体上,通过这样的芯片可以精确地完成毒性物质对人类基因表达变化影响的分析,对毒性物质进行分类与分级,确定反应机理。

其在毒理学分析领域已呈现出广阔的应用前景,随着研究的不断深入和技术的更加完善,基因芯片一定会在毒理学研究领域发挥非凡的作用。

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