酶法甘油解制备甘油二酯的研究
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２０１２年第３７卷第５期
中国油脂
３ｌ
构造脂质
酶法甘油解制备甘油二酯的研究
王卫飞１，宁正祥１，徐扬１，王永华１，杨博２
（１．华南理５－大学轻工与食品学院，广州５１０６４０；２．华南理工大学生物科学与工程学院，广州５ｉｏ００６）
摘要：以精炼菜籽油为底物，通过酶法甘油解制备甘油二酯，比较了３种常用固定化脂肪酶甘油解 制备甘油二酯的能力。结果表明：Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ具有较好的甘油耐受性，采用甘油预吸附的方 式进行甘油解反应，可明显减少反应中酶活损失，显著提高酶的重复使用寿命。在菜耔油与甘油摩 尔比１：ｌ，酶添加量为油质量的５％，硅胶与甘油质量比１：ｌ，反应温度６０℃的优化条件下，甘油解
２。３扫酶量对Ｌｉｐｏｚｙｍｅｏ ＲＭ ＩＭ催化甘油解反应 的影响
衡，体系中甘油二酯含量达到５５％，再延长反应时间， 产物中甘油二酯含量变化很小。因此，在Ｌｉｐｏｚｙｍｅｏ ＲＭ瑚催化的甘油解反应中选择反应时间为８
２．５ Ｌｉｐｏｚｙｍｅｏ ＲＭ ｈ。
ＩＭ催化甘油解反应的操作稳
定性
采用稳定性更高并且可以重复使用的固定化 酶，通过多次重复使用，提高单位酶的处理能力．降 低反应过程的成本。本研究考察了固定化酶“．
ＦＪ一２００型高速均质机，ＴＨＺ—Ｃ恒温振荡器， 高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ公司）。
１．３酶催化甘油解反应
将１０ ｇ菜籽油和一定量的甘油（游离或预吸附
甘油）置于５０ ｍＬ具塞三角瓶中，于高速均质机中
誉
＼
充分混合后，置于恒温振荡器中（２００ ｒ／ｍｉｎ），预热 到一定温度，添加一定量的固定化酶开始反应，每隔 一段时间取样，分析反应混合物的组成。
甘油二酯（ＤＡＧ）是油脂代谢的中间产物，具有 安全、营养、人体相容性高等诸多优点，是一种多功 能添加剂，可广泛应用于食品、医药、化工（化妆品） 等行业…。甘油二酯的生产常利用脂肪酸的酯化 反应或甘油解反应来进行，但是单纯的酯化反应存 在脂肪酸原料制备的问题，在成本和反式酸控制方 面存在不足‘２。Ｊ。研究发现，采用特定的脂肪酶催 化脂肪或油进行适度水解，在适宜的反应条件下，水’
ａｒｃｔｉｃａ，吸附于多孑Ｌ吸附树脂）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ癌ＲＭ ＩＭ（来
源于Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ，吸附于大孔阴离子交换树 脂）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＴＬ ＩＭ（来源于Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏ一
达到ｌ：１时，酶颗粒基本不结团。反应产物中甘油二 酯含量达到５Ｉ％，但当摩尔比达到０．５：１时，酶颗 粒出现结团，产物中甘油二酯含量迅速下降。由实
５３
中国抽脂
８％。这是由于较高温度促进了底物之间的互
从图４可以看出，反应８ ｈ时，反应体系已基本平
溶，促进甘油解程度的增大，而且有利于Ｉ，２一甘油 二酯向１，３一甘油二酯转化，可以提高产物ｌ，３一甘 油二酯的含量。但当温度达到７００ｃ时。并不利于酶 活力的保持。因此，考虑酶活性及底物的状态， ６０℃是该种酶较合适的反应温度。
验结果可知，固定化酶Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ具有较高
￥１．１３，吸附于硅胶），均由Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎ・ ｍａｒｋ）公司馈赠；菜籽油，市售（南海油脂有限公司）； 甘油、硅胶Ｇ和其他试剂，均为分析纯。
１．２仪器、设备
的甘油耐受性，催化效率也较高，因此在以后的甘油 解反应的研究中选取Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ作为催化用 酶，在Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ催化的甘油解反应中，菜籽 油与甘油的摩尔比选取１：１。
ａ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｌｉｐｏｚｙｍｅ商ＲＭ ＩＭ ｈａｄ
ｇｏｏｄ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ．Ｕｓｅｆｕｌ ｌｉｆｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｍａｒｋ－
ｃｏｎｔｅห้องสมุดไป่ตู้ｔ ｔｏ
ａｂｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｕｓｉｎｇ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｒｅａｄｓｏｒｂｅｄ ｂｙ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ．Ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ
ｐｏｚｙｍｅｏ ＴＬ
ＩＭ催化的反应中，当底物摩尔比达到
１：１时，酶颗粒有较大的结团，反应产物中甘油二酯
ａｎｔ—
固定化脂肪酶Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５（来源于Ｃａｎｄｉｄａ
含量也迅速下降，当底物摩尔比达到０．５：１时，酶颗 粒已经结团，此时反应产物中甘油二酯含量更低。
在Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ催化的反应中。当底物摩尔比
应的影响
离５ ｍｉｎ后，取上层油样进行甘油二酯含量分析，具
ｘｕ等【８１研究表明，在酶促酯交换过程中，反应 温度的升高使酯交换程度和其反应速度提高的同 时，还使酰基位移反应的速度和程度都随之增加。 本研究考察了反应温度为４０、５０、６０、７０℃时对甘油 二酯和甘油三酯含量的影响，底物摩尔比为１：１，Ｌｉ．
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０００６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ
lipozymermim催化甘油解反应的操作稳定性随重复反应批次的增加而呈直线下降趋势在重复使用22次时反应产物中甘油二酯含量已经降到第1批次的一半由此可以推算出在此反应条件下lipozymermim的酶活力半衰期为22次这与采用游离甘油的甘油解反应相比酶的操作稳定性得到很大的提高半衰期由lo次提高到22次可以有效地降低反应中酶的使用成本
２．４反应时问对Ｌｉｐｏｚｙｍｅｏ ＲＭ ＩＭ催化甘油解反 应的影响
从图５可以看出，在同等的反应条件下，酶反复 使用次数越多，其催化效率下降越明显。在一定的反 应条件下，使用１次时，甘油二酯含量达到５５．２％，而 重复使用ＩＯ次时，其甘油二酯含量已经降到第ｌ批 次的一半，由此可以推算出在此反应条件下，固定化
ｐｏｚ３＇ｍｅｏ ＲＭ
加酶量的变化只对反应达到平衡的时间有影 响，而对反应达到平衡的状态没有关系。酶量增加． 甘油解的速度加快。本研究考察了加酶量为２％、 ５％、８％、１０％时对甘油二酯含量的影响，底物摩尔 比为Ｉ：１，反应温度为６０℃，反应１０ ｈ后停止。取样
ＩＭ催化多批次甘油解反应的操作稳定
性，每批次的反应条件为底物摩尔比１：１，加酶量为 油质量的５％，反应温度６０℃，反应时间８ ｈ。每次 反应完后，抽滤回收固定化酶，加入新底物开始下一 批反应，共进行１５批，实验结果如图５所示。
由图１可以看出，当底物摩尔比大于２：１时，随 着甘油量的增加，３种酶催化的反应产物中甘油二 酯含量也随着增加，但当底物摩尔比小于２：１时，３ 种酶的表现差别很大。在Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５催化的反应
从图２可以看出，甘油二酯含量在６０℃以前随 着温度的升高而增加，在６０℃时达到最大值
万方数据
２０１２年第３７卷第５期
ｐｏｚｙｒｎｅ＠ＲＭ ＩＭ加量为油质量的５％，反应１０ ｈ后停
反应结束后，反应混合物减压抽滤分离出产物， 得到的固定化酶和硅胶混合物经叔丁醇充分洗涤再 次减压抽滤，再经筛分即可得到较纯的固定化酶，以 备重复使用。 ２结果与讨论
２．１
止，取样测定甘油二酯、甘油三酯含量，结果见图２。
底物摩尔比对甘油解反应的影响 本研究考察了菜籽油与甘油摩尔比为３：１、
水
＼
艰
＼
２：ｌ、ｌ：ｌ、０．５：ｌ时，Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ 和Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＴＬ ＩＭ催化甘油解反应过程中甘油二 酯的生成情况，加酶量为油质量的５％，反应温度
５０℃，反应１０ ｈ后停止，取样测定甘油二酯含量，结 果如图１所示。
删 如
ｏ 《 Ｅ－
咖 缸
ｏ 《 凸
反应温度／℃ 图２反应温度对Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ催化甘油解 反应的影响
解度达到一定范围时水解产物中包含大量甘油二酯，
而甘油单酯（ＭＡＧ）的含量很低。４１。甘油解反应通过 甘油和甘油三酯（ＴＡＧ）的酯交换反应直接产生甘油 二酯，生产过程简单，副产物少，是合成甘油二酯的有 效途径”“Ｊ。油脂的甘油解反应是甘油与油脂在催 化齐Ⅱ存在的情况下发生的醇解反应，所用的催化剂可 以是化学催化剂或者生物酶催化剂。由于化学催化 反应常需要在高温下操作，而且存在能耗高、副产物 多、环境污染等问题，而酶催化合成能够克服以上缺 点，反应条件温和，能耗低，对环境友好，产品纯度高，
２０１２ Ｖ０１．３７ Ｎｏ．５
固定化脂肪酶催化甘油解反应，考察了各种影响因 素对产物中甘油二酯含量的影响，以探索高效、经 济、环保的生产甘油二酯的工艺。
ｌ材料与方法 １．１原料、试剂
中，当底物摩尔比达到１：１时，酶颗粒有轻微结团， 当底物摩尔比达到０．５：１时，酶颗粒出现较大的结 团，反应产物中甘油二酯含量也迅速下降。在Ｌｉ—
反应８ ｈ后，产物中的甘油二酯含量达到５７．５％。通过硅胶预吸附甘油可以使Ｌｉｐｏｚｙｍｅ固ＲＭ
ＩＭ
酶的多批次操作稳定性得到很大提高，半衰期迭到２２次，有应用于工业生产的潜力。 关键词：甘油二酯；菜籽油；脂肪酶；甘油解
中图分类号：ＴＳ２２５．６；ＴＳ２０２．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００３—７９６９（２０１２）０５—００３１一０４
ａｆｔｅｒ ａｇｅ
ｌｕｒｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ
ｗａｓ
５７．５％
８ ｈ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ
ｏｎ
ｇｌｙｃｅｒｏｌ １：ｌ，ｅｎｚｙｍｅ ｄｏｓ—
５％（ｂａｓｅｄ
ｔｈｅ ｍａｓｓ ｏｆ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ），ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ
６０
测定甘油二酯含量姑果如图３所示。
７０
１
５０
■４０
女５０ ＼４０
鲁３０
苫２０
１０ ０ ２
４
寰３０
２
６ ８
ｒ０ Ｊ２
２０
。１０
０
２
４
６
８
１０
１２
１４
１６
加酶量／％ 图３加酶■对Ｕｐｏｚ＇扣ａｔｅ ＲＭ ＩＭ催化甘油解反应的影响 围５ 反应批改
Ｌｌｐｏｚｙｍｅ÷ＲＭＩｂｌ催化甘油解反应的撮作稳定性
从图３可以看出，当加酶量从油质量的２％上 升到５％时，甘油二酯含量有较大的上升。而加酶量 从５％上升到１０％时，甘油二酯含量上升的幅度较 小。这可能是２％的加酶量时在１０ ｈ还不能使反应 达到平衡，而５％的加酶量时反应基本达到平衡．再 增大加酶量平衡移动缓慢。加酶量为油质量的５％ 对甘油解反应较为合适，在尽可能降低生产成本的 同时，也保证了一定的反应速度。
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｂｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｇｌｙｃｅｒｏｌｙｓｉｓ
ＷＡＮＧ Ｗｅｉｆｅｉｌ，ＮＩＮＧ Ｚｈｅｎｇｘｉａｎｇ。，ＸＵ ＷＡＮＧ Ｙｏｎｇｈｕａｌ．ＹＡＮＧ
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ
Ｂ０２
Ｙａｎ９１，
ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
是现代食品和化学工业的发展方向。
收稿日期：２０１１—０９—１９；修回日期：２０１２一０３—０６
作者筒介：王卫飞（１９８２），男，在读博士，主要研究方向为油
脂化学（Ｅ・ｍａｉｌ）ｗｆｓｃｕｔ＠１６３．ｃｏｍ。
本研究以菜籽油、甘油为原料，采用无溶剂体系
万方数据
３２
ＣＨＩＮＡ ０ＩＬＳ ＡＮＤ ＦＡＴＳ
１．４预吸附甘油的制备
曲】 抽
ｏ 《
口
硅胶先于１００℃烘干后，将甘油和硅胶按一定 质量比混合，搅拌混匀，即得到硅胶预吸附的甘油。
１．５反应产物的分析
底物摩尔比
图１底物摩尔比对甘油解反应的影响
所取的样品于离心机中，以５ 体分析方法见文献［７］。
１．６固定化酶的回收
０００
ｒ／ｒａｉｎ离心分
２．２反应温度对Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ催化甘油解反
ｔｏ
ｇｌｙｃｅｒｏｌ １：１，ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａ－
ａ
６０℃．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ２２ ｔｉｍｅｓ ｒｅｐｅａｔｅｄｌｙ ｉｎ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ．ｗｈｉｃｈ ｈａｄ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｉｎ－
ｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ：ｄｉａｅｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ；ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ；ｌｉｐａｓｅ；ｇｌｙｃｅｒｏｌｙｓｉｓ
酶Ｌｉｐｏｚｙｒａｅｏ Ｐ，Ｍ ＩＭ的酶活力半衰期为１０次。
ｓｔｒａｔｅ．Ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｇｌｙｅｅｒｏｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｆｉｎｅｄ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ ａＳ，ｓｕｂ・
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｄｉａｅｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
中国油脂
３ｌ
构造脂质
酶法甘油解制备甘油二酯的研究
王卫飞１，宁正祥１，徐扬１，王永华１，杨博２
（１．华南理５－大学轻工与食品学院，广州５１０６４０；２．华南理工大学生物科学与工程学院，广州５ｉｏ００６）
摘要：以精炼菜籽油为底物，通过酶法甘油解制备甘油二酯，比较了３种常用固定化脂肪酶甘油解 制备甘油二酯的能力。结果表明：Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ具有较好的甘油耐受性，采用甘油预吸附的方 式进行甘油解反应，可明显减少反应中酶活损失，显著提高酶的重复使用寿命。在菜耔油与甘油摩 尔比１：ｌ，酶添加量为油质量的５％，硅胶与甘油质量比１：ｌ，反应温度６０℃的优化条件下，甘油解
２。３扫酶量对Ｌｉｐｏｚｙｍｅｏ ＲＭ ＩＭ催化甘油解反应 的影响
衡，体系中甘油二酯含量达到５５％，再延长反应时间， 产物中甘油二酯含量变化很小。因此，在Ｌｉｐｏｚｙｍｅｏ ＲＭ瑚催化的甘油解反应中选择反应时间为８
２．５ Ｌｉｐｏｚｙｍｅｏ ＲＭ ｈ。
ＩＭ催化甘油解反应的操作稳
定性
采用稳定性更高并且可以重复使用的固定化 酶，通过多次重复使用，提高单位酶的处理能力．降 低反应过程的成本。本研究考察了固定化酶“．
ＦＪ一２００型高速均质机，ＴＨＺ—Ｃ恒温振荡器， 高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ公司）。
１．３酶催化甘油解反应
将１０ ｇ菜籽油和一定量的甘油（游离或预吸附
甘油）置于５０ ｍＬ具塞三角瓶中，于高速均质机中
誉
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充分混合后，置于恒温振荡器中（２００ ｒ／ｍｉｎ），预热 到一定温度，添加一定量的固定化酶开始反应，每隔 一段时间取样，分析反应混合物的组成。
甘油二酯（ＤＡＧ）是油脂代谢的中间产物，具有 安全、营养、人体相容性高等诸多优点，是一种多功 能添加剂，可广泛应用于食品、医药、化工（化妆品） 等行业…。甘油二酯的生产常利用脂肪酸的酯化 反应或甘油解反应来进行，但是单纯的酯化反应存 在脂肪酸原料制备的问题，在成本和反式酸控制方 面存在不足‘２。Ｊ。研究发现，采用特定的脂肪酶催 化脂肪或油进行适度水解，在适宜的反应条件下，水’
ａｒｃｔｉｃａ，吸附于多孑Ｌ吸附树脂）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ癌ＲＭ ＩＭ（来
源于Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ，吸附于大孔阴离子交换树 脂）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＴＬ ＩＭ（来源于Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏ一
达到ｌ：１时，酶颗粒基本不结团。反应产物中甘油二 酯含量达到５Ｉ％，但当摩尔比达到０．５：１时，酶颗 粒出现结团，产物中甘油二酯含量迅速下降。由实
５３
中国抽脂
８％。这是由于较高温度促进了底物之间的互
从图４可以看出，反应８ ｈ时，反应体系已基本平
溶，促进甘油解程度的增大，而且有利于Ｉ，２一甘油 二酯向１，３一甘油二酯转化，可以提高产物ｌ，３一甘 油二酯的含量。但当温度达到７００ｃ时。并不利于酶 活力的保持。因此，考虑酶活性及底物的状态， ６０℃是该种酶较合适的反应温度。
验结果可知，固定化酶Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ具有较高
￥１．１３，吸附于硅胶），均由Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎ・ ｍａｒｋ）公司馈赠；菜籽油，市售（南海油脂有限公司）； 甘油、硅胶Ｇ和其他试剂，均为分析纯。
１．２仪器、设备
的甘油耐受性，催化效率也较高，因此在以后的甘油 解反应的研究中选取Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ作为催化用 酶，在Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ催化的甘油解反应中，菜籽 油与甘油的摩尔比选取１：１。
ａ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｌｉｐｏｚｙｍｅ商ＲＭ ＩＭ ｈａｄ
ｇｏｏｄ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ．Ｕｓｅｆｕｌ ｌｉｆｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｍａｒｋ－
ｃｏｎｔｅห้องสมุดไป่ตู้ｔ ｔｏ
ａｂｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｕｓｉｎｇ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｒｅａｄｓｏｒｂｅｄ ｂｙ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ．Ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ
ｐｏｚｙｍｅｏ ＴＬ
ＩＭ催化的反应中，当底物摩尔比达到
１：１时，酶颗粒有较大的结团，反应产物中甘油二酯
ａｎｔ—
固定化脂肪酶Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５（来源于Ｃａｎｄｉｄａ
含量也迅速下降，当底物摩尔比达到０．５：１时，酶颗 粒已经结团，此时反应产物中甘油二酯含量更低。
在Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ催化的反应中。当底物摩尔比
应的影响
离５ ｍｉｎ后，取上层油样进行甘油二酯含量分析，具
ｘｕ等【８１研究表明，在酶促酯交换过程中，反应 温度的升高使酯交换程度和其反应速度提高的同 时，还使酰基位移反应的速度和程度都随之增加。 本研究考察了反应温度为４０、５０、６０、７０℃时对甘油 二酯和甘油三酯含量的影响，底物摩尔比为１：１，Ｌｉ．
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０００６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ
lipozymermim催化甘油解反应的操作稳定性随重复反应批次的增加而呈直线下降趋势在重复使用22次时反应产物中甘油二酯含量已经降到第1批次的一半由此可以推算出在此反应条件下lipozymermim的酶活力半衰期为22次这与采用游离甘油的甘油解反应相比酶的操作稳定性得到很大的提高半衰期由lo次提高到22次可以有效地降低反应中酶的使用成本
２．４反应时问对Ｌｉｐｏｚｙｍｅｏ ＲＭ ＩＭ催化甘油解反 应的影响
从图５可以看出，在同等的反应条件下，酶反复 使用次数越多，其催化效率下降越明显。在一定的反 应条件下，使用１次时，甘油二酯含量达到５５．２％，而 重复使用ＩＯ次时，其甘油二酯含量已经降到第ｌ批 次的一半，由此可以推算出在此反应条件下，固定化
ｐｏｚ３＇ｍｅｏ ＲＭ
加酶量的变化只对反应达到平衡的时间有影 响，而对反应达到平衡的状态没有关系。酶量增加． 甘油解的速度加快。本研究考察了加酶量为２％、 ５％、８％、１０％时对甘油二酯含量的影响，底物摩尔 比为Ｉ：１，反应温度为６０℃，反应１０ ｈ后停止。取样
ＩＭ催化多批次甘油解反应的操作稳定
性，每批次的反应条件为底物摩尔比１：１，加酶量为 油质量的５％，反应温度６０℃，反应时间８ ｈ。每次 反应完后，抽滤回收固定化酶，加入新底物开始下一 批反应，共进行１５批，实验结果如图５所示。
由图１可以看出，当底物摩尔比大于２：１时，随 着甘油量的增加，３种酶催化的反应产物中甘油二 酯含量也随着增加，但当底物摩尔比小于２：１时，３ 种酶的表现差别很大。在Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５催化的反应
从图２可以看出，甘油二酯含量在６０℃以前随 着温度的升高而增加，在６０℃时达到最大值
万方数据
２０１２年第３７卷第５期
ｐｏｚｙｒｎｅ＠ＲＭ ＩＭ加量为油质量的５％，反应１０ ｈ后停
反应结束后，反应混合物减压抽滤分离出产物， 得到的固定化酶和硅胶混合物经叔丁醇充分洗涤再 次减压抽滤，再经筛分即可得到较纯的固定化酶，以 备重复使用。 ２结果与讨论
２．１
止，取样测定甘油二酯、甘油三酯含量，结果见图２。
底物摩尔比对甘油解反应的影响 本研究考察了菜籽油与甘油摩尔比为３：１、
水
＼
艰
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２：ｌ、ｌ：ｌ、０．５：ｌ时，Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ 和Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＴＬ ＩＭ催化甘油解反应过程中甘油二 酯的生成情况，加酶量为油质量的５％，反应温度
５０℃，反应１０ ｈ后停止，取样测定甘油二酯含量，结 果如图１所示。
删 如
ｏ 《 Ｅ－
咖 缸
ｏ 《 凸
反应温度／℃ 图２反应温度对Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ催化甘油解 反应的影响
解度达到一定范围时水解产物中包含大量甘油二酯，
而甘油单酯（ＭＡＧ）的含量很低。４１。甘油解反应通过 甘油和甘油三酯（ＴＡＧ）的酯交换反应直接产生甘油 二酯，生产过程简单，副产物少，是合成甘油二酯的有 效途径”“Ｊ。油脂的甘油解反应是甘油与油脂在催 化齐Ⅱ存在的情况下发生的醇解反应，所用的催化剂可 以是化学催化剂或者生物酶催化剂。由于化学催化 反应常需要在高温下操作，而且存在能耗高、副产物 多、环境污染等问题，而酶催化合成能够克服以上缺 点，反应条件温和，能耗低，对环境友好，产品纯度高，
２０１２ Ｖ０１．３７ Ｎｏ．５
固定化脂肪酶催化甘油解反应，考察了各种影响因 素对产物中甘油二酯含量的影响，以探索高效、经 济、环保的生产甘油二酯的工艺。
ｌ材料与方法 １．１原料、试剂
中，当底物摩尔比达到１：１时，酶颗粒有轻微结团， 当底物摩尔比达到０．５：１时，酶颗粒出现较大的结 团，反应产物中甘油二酯含量也迅速下降。在Ｌｉ—
反应８ ｈ后，产物中的甘油二酯含量达到５７．５％。通过硅胶预吸附甘油可以使Ｌｉｐｏｚｙｍｅ固ＲＭ
ＩＭ
酶的多批次操作稳定性得到很大提高，半衰期迭到２２次，有应用于工业生产的潜力。 关键词：甘油二酯；菜籽油；脂肪酶；甘油解
中图分类号：ＴＳ２２５．６；ＴＳ２０２．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００３—７９６９（２０１２）０５—００３１一０４
ａｆｔｅｒ ａｇｅ
ｌｕｒｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ
ｗａｓ
５７．５％
８ ｈ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ
ｏｎ
ｇｌｙｃｅｒｏｌ １：ｌ，ｅｎｚｙｍｅ ｄｏｓ—
５％（ｂａｓｅｄ
ｔｈｅ ｍａｓｓ ｏｆ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ），ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ
６０
测定甘油二酯含量姑果如图３所示。
７０
１
５０
■４０
女５０ ＼４０
鲁３０
苫２０
１０ ０ ２
４
寰３０
２
６ ８
ｒ０ Ｊ２
２０
。１０
０
２
４
６
８
１０
１２
１４
１６
加酶量／％ 图３加酶■对Ｕｐｏｚ＇扣ａｔｅ ＲＭ ＩＭ催化甘油解反应的影响 围５ 反应批改
Ｌｌｐｏｚｙｍｅ÷ＲＭＩｂｌ催化甘油解反应的撮作稳定性
从图３可以看出，当加酶量从油质量的２％上 升到５％时，甘油二酯含量有较大的上升。而加酶量 从５％上升到１０％时，甘油二酯含量上升的幅度较 小。这可能是２％的加酶量时在１０ ｈ还不能使反应 达到平衡，而５％的加酶量时反应基本达到平衡．再 增大加酶量平衡移动缓慢。加酶量为油质量的５％ 对甘油解反应较为合适，在尽可能降低生产成本的 同时，也保证了一定的反应速度。
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｂｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｇｌｙｃｅｒｏｌｙｓｉｓ
ＷＡＮＧ Ｗｅｉｆｅｉｌ，ＮＩＮＧ Ｚｈｅｎｇｘｉａｎｇ。，ＸＵ ＷＡＮＧ Ｙｏｎｇｈｕａｌ．ＹＡＮＧ
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ
Ｂ０２
Ｙａｎ９１，
ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
是现代食品和化学工业的发展方向。
收稿日期：２０１１—０９—１９；修回日期：２０１２一０３—０６
作者筒介：王卫飞（１９８２），男，在读博士，主要研究方向为油
脂化学（Ｅ・ｍａｉｌ）ｗｆｓｃｕｔ＠１６３．ｃｏｍ。
本研究以菜籽油、甘油为原料，采用无溶剂体系
万方数据
３２
ＣＨＩＮＡ ０ＩＬＳ ＡＮＤ ＦＡＴＳ
１．４预吸附甘油的制备
曲】 抽
ｏ 《
口
硅胶先于１００℃烘干后，将甘油和硅胶按一定 质量比混合，搅拌混匀，即得到硅胶预吸附的甘油。
１．５反应产物的分析
底物摩尔比
图１底物摩尔比对甘油解反应的影响
所取的样品于离心机中，以５ 体分析方法见文献［７］。
１．６固定化酶的回收
０００
ｒ／ｒａｉｎ离心分
２．２反应温度对Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠ＲＭ ＩＭ催化甘油解反
ｔｏ
ｇｌｙｃｅｒｏｌ １：１，ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａ－
ａ
６０℃．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ２２ ｔｉｍｅｓ ｒｅｐｅａｔｅｄｌｙ ｉｎ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ．ｗｈｉｃｈ ｈａｄ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｉｎ－
ｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ：ｄｉａｅｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ；ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ；ｌｉｐａｓｅ；ｇｌｙｃｅｒｏｌｙｓｉｓ
酶Ｌｉｐｏｚｙｒａｅｏ Ｐ，Ｍ ＩＭ的酶活力半衰期为１０次。
ｓｔｒａｔｅ．Ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｇｌｙｅｅｒｏｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｆｉｎｅｄ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ ａＳ，ｓｕｂ・
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｄｉａｅｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ