重组融合蛋白TumstatinTNFα分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

摘要 目的 构建重组融合蛋白Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ－７１１ＮＦ—ｄ的分泌型 真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ—ＫＩ）中 的稳定表达。方法 以人胚。肾２９３细胞为材料，提取总 ＲＮＡ，用ＲＴ—ＰＣＲ方法合成人ｔｕｎｉｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ，将该ｃＤＮＡ克 隆到ｐＧＥＭ—Ｔ载体获得重组质粒ｐＧＥＭ—Ｔ／ｔｕｍｓｔａｔｉｎ。利用 ＰＣＲ从ｐＧＥＭ－Ｔ／ｔｕｍｓｔａｔｉｎ和ＰＢＶ２２０·ＴＮＦ·ｄ载体中分别扩 增出ｓｉｇ—ｔｕｍｓｔａｔｉｎ．１ｉｎｋｅｒ和ｌｉｎｋｅｒ—ＴＮＦ片段，将其克隆得到 ｓｉｇ．ｔｕｍｓｔａｔｉｎ－ｌｉｎｋｅｒ．ＴＮＦ片段，ｓｉｇ－ｔｕｍｓｔａｔｉｎ—ｌｉｎｋｅｒ—ＴＮＦ片段经 酶切后，插入经同样酶切ｐｌＲＥＳｎｅ０３质粒，利用克隆ＰＣＲ、限 制性内切酶消化以及序列测定对获得的ｓｉｇ－ｔｕｍｓｔａｔｉｎ—ｌｉｎｋｅｒ－ ＴＮＦ基因片段及重组载体进行验证。将重组ｓｉｇ－ｔｕｍｓｔａｔｉｎ－ ｌｉｎｋｅｒ—ＴＮＦ真核表达载体转染到ＣＨＯ—Ｋ１对其表达状况进行 检测。结果 所获得的ｓｉｇ—ｔｕｍｓｔａｔｉｎ·ｌｉｎｋｅｒ—ＴＮＦ片段（１．３２ ｋｂ）序列与报道的序列完全一致。酶切鉴定的结果表明含肿 瘤抑素基因的重组ｐｌＲＥＳｎｅ０３／ｓｉｇ—ｔｕｍｓｔａｔｉｎ—ｌｉｎｋｅｒ－ＴＮＦ表达 载体构建成功。转染重组ｐｌＲＥＳｎｅ０３／ｓｉｇ－ｔｕｍｓｔａｔｉｎ—ｌｉｎｋｅｒ—ＴＮＦ 的ＣＨＯ．Ｋ１表达了肿瘤抑素融合蛋白ｔｕｍｓｔａｔｉｎ—ｌｉｎｋｅｒ－ＴＮＦ。 从生长曲线结果来看，转染ｐｌＲＥＳｎｅ０３／ｓｉｇ－ｔｕｍｓｔａｔｉｎ－ｌｉｎｋｅｒ— ＴＮＦ真核表达载体和转染ｐｌＲＥＳｎｅ０３的ＣＨＯ．Ｋ１比未转染 的ＣＨＯ—Ｋ１细胞的生长速度要慢。结论 成功地构建了重 组人肿瘤抑素融合蛋白的真核表达载体，并获得能稳定表达 人肿瘤抑素融合蛋白的ＣＨＯ．Ｋ１。 主题词肿瘤坏死因子ｄ；重组融合蛋白质类；遗传载体；真 核细胞 自由词肿瘤抑素；中国仓鼠卵巢细胞 中图分类号Ｒ ７３；Ｒ ３４１；Ｒ ３９２．３３；Ｒ ３９４．２ 文献标识码Ａ文章编号１０００—１４９２（２００８）０４—０３５７—０５
Байду номын сангаас
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安徽医科大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｕｉ ２００８ Ａｕｇ；４３（４）
收试剂盒、细胞总ＲＮＡ抽提试剂盒购自华舜生物工 程公司；ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒、ＰＣＲ试剂盒、各种限制酶、 ＤＮＡ ｍａｒｋ及连接酶购自ＴａＫａＲａ公司；Ｔｒｉｚｏｌ和Ｓｕ— ｐｅｒｓｃｒｉｐｔ １１反转录酶、Ｇ４１ ８和脂质体转染试剂ｌｉｐｏ— ｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；胎牛血清购自四 季青公司；引物由上海Ｓａｎｇｏｎ公司合成。 １．３ 重组融合蛋白ｔｕｍｓｔａｔｉｎ－ｌｉｎｋｅｒ—ＴＮＦ表达载 体的构建及其鉴定 １．３．１ 引物设计根据ＧｅｎＢａｎｋ中的人ｔｕｍｓｔａｔｉｎ 编码序列，设计两条引物，在上游引物的５ ７端引入 ＢａｍＨ Ｉ酶切位点，在下游引物的５’端引入Ｈｉｎｄ １ＩＩ 酶切位点。引物ｐ１：５’一ｇｃｃｇｇａｔｃｃｃｃａｇｇｔｔｔｇａａａｇ— ｇａａａａｃｇｔ一３’；ｐ２：５ ７一ｃｇｇａａｇｃｔｔｔｃａ昏对ｃｔｔ【ｔｃｔＩｃａｔ一３’；ｐ３：
张林杰，男，博士，教授，硕士生导师，责任作者，Ｅ．ｍａｉｌ： ｚｌｊ３３＠ａｈｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ； 罗以勤，男，博士，副主任检验师，责任作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｕｏｙ． ｉｑｉｎ２００３＠１６３．ｃｏｒｎ
和转移具有血管依赖性，应用抗血管生成方法治疗 肿瘤已引起了广泛的关注与研究¨以１。肿瘤抑素 （ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）是最新发现的人基底膜来源胶原Ⅳ型肿 瘤血管生成抑制因子，它抑制血管内皮细胞增殖并 引起内皮细胞特异性凋亡【３１。ｔｕｍｓｔａｔｉｎ以非ＲＧＤ 序列结合于整合素ｄ。ｐ，受体并影响其活性，抑制肿 瘤血管内皮细胞的生长，使原发和转移瘤处于休眠 状态，从而抑制肿瘤生长，被认为是最有前途的肿瘤 生长抑制剂之一。大量的动物试验表明肿瘤坏死因 子（ＴＮＦ）具有强大的抗肿瘤活性”１，它可触发肿瘤 微环境中肿瘤细胞和正常细胞造成相关血管的破坏 和损伤、激活炎症和免疫反应以及引起肿瘤细胞的 凋亡和坏死”ｏ。但临床效果不理想，原因是毒副作 用太大∽Ｊ。在介导肿瘤血管损伤方面，ＴＮＦ对内皮 细胞有直接的细胞毒作用＂５和造成内皮细胞凝血 活性改变（抗凝转变为促凝）。在本研究中，我们选 择运用ｔｕｍｓｔａｔｉｎ的血管靶向策略以增加ＴＮＦ对肿 瘤血管内皮细胞的选择性。将人ｔｕｍｓｔａｔｉｎ和ＴＮＦ一０【 （以下简写为ＴＮＦ）融合，并在融合蛋白前增加了信 号肽（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ，ｓｉｇ），在ｔｕｍｓｔａｔｉｎ和ＴＮＦ之间增 加了柔性连接臂（１ｉｎｋｅｒ）基因片段，构建了重组人 ｔｕｍｓｔａｔｍ。融合蛋白的表达载体，希望产生一种双功 能蛋白，能特异地杀伤肿瘤组织血管内皮细胞和肿 瘤细胞。利用体外实验方法观察了重组ｓｉｇ．ｔｕｍｓｔａ． ｔｉｎ—ｌｉｎｋｅｒ—ＴＮＦ在中国仓鼠卵巢细胞－Ｋ１（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ—Ｋ１，ＣＨＯ—Ｋ１）细胞系中的稳定表达。
５ ７一ｇｃｔｇｃｃｇｃｔｃｃｔｇｃｔｇ殍ｇｃｔｃｃｔｇｇｃｇｇｃ ｇｇｃｇｃｃｃｇｃａｇｃｃａｇｃｃｃａ ｇｇｔｔｔｇａａａｇｇａａａａｃ一３‘；０４：５‘－ａｔｔｇｃｔａｇｃａｔｇａｇｃｇｃｃｃｇｇａｃｃｇｃｃ
ｃｃｃａｇｇｃｃｇｃａｇ昏ｇｃｔｃｃｔｇｃｔｇｃｃｇｃｔｃｃｔｇｃＩｇｇｔｇ－３’；ｐ５：５’一ｇａｔ－
安徽医科大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｕｉ ２００８ Ａｕｇ；４３（４） ◇基础医学研究◇
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重组融合蛋白Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ－ＴＮＦ一仪分泌型真核表达载体的构建 及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
赵亮１一，姚丽娟２，孔建新２，濮跃晨２，孙安源２，罗以勤２，张林杰１
肿瘤细胞聚集团从宿主基质中建立自身的血液 供应系统，即为血管生成，已长成的瘤体从宿主中获 取新的血管成分亦属同样的过程。实体肿瘤的生长
２００８—０５—３０接收 基金项目：国家自然科学基金项目（编号：３０６７２４３７） 作者单位：１安徽医科大学免疫学教研室，合肥２３００３２
２安徽医科大学附属省立医院检验科，合肥２３０００１ 作者简介：赵亮，男，主管检验师，硕士研究生；
１材料与方法
１．１菌株、细胞与质粒大肠杆菌ＤＨ５０ｔ，ＰＢＶ２２０一 ＴＮＦ质粒载体、人胚’肾２９３细胞均为本室保存； ＣＨＯ．Ｋ１细胞由中国科学技术大学生命科学院魏海 明教授惠赠；ｐＧＥＭ—Ｔ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；质粒 ｐｌＲＥＳｎｅ０３购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司；人胚肾细胞株２９３细 胞以含１０％新生小牛血清的１６４０培养；ＣＨＯ—Ｋ１细 胞以含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养；蛋白电泳仪 （Ｐｈａｍａｒｅｉａ Ｈｏｅｆｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ）。 １．２主要试剂 小量质粒抽提试剂盒、ＤＮＡ胶回
ｐＧＥＭ．Ｔ／ｓｉｇ—ｔｕｍｓｔａｔｉｎ—ｌｉｎｋｅｒ片段和ｌｉｎｋｅｒ－ＴＮＦ片段 为模板ＳＯＥｉｎｇ法扩增得到ｓｉｇ－ｔｕｍｓｔａｔｉｎ—ｌｉｎｋｅｒ．ＴＮＦ 融合基因产物。用琼脂糖凝胶电泳检测。 １．３．６ 重组ｐｌＲＥＳｎｅ０３／ｓｉｇ．ｔｕｍｓｔａｔｉｎ．１ｉｎｋｅｒ—ＴＮＦ质 粒的构建 用ｓｉｇ—ｔｕｍｓｔａｔｉｎ．１ｉｎｋｅｒ．ＴＮＦ融合基因产 物经Ｎｈｅ Ｉ＋ＢａｍＨ Ｉ酶切，同样酶切ｐｌＲＥＳｎｅ０３ 质粒。凝胶回收试剂盒回收ＤＮＡ片段，利用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶将ｓｉｇ．ｔｕｍｓｔａｔｉｎ—ｌｉｎｋｅｒ．ＴＮＦ片段与 ｐｌＲＥＳｎｅ０３质粒载体连接。连接产物转化Ｅ ｃｏｌｉ ＤＨ５ｅｔ，并涂布于培养平板。随机挑选若干个菌落， 用ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ聚合酶及ｓｉｇ—ｔｕｍｓｔａｔｉｎ－ｌｉｎ－ ｋｅｒ—ＴＮＦ引物进行ＰＣＲ扩增。选取几个经克隆ＰＣＲ 和Ｎｈｅ Ｉ＋ＢａｍＨ Ｉ双酶切检测阳性的菌落，小量 制备质粒，进行ＤＮＡ测序。 １．３．７ ｐｌＲＥＳｎｅ０３／ｓｉｇ．ＴＮＦ质粒的构建用ｐ９和 ｐ１０引物以ｐＧＥＭ—Ｔ／ｓｉｇ．ｔｕｍｓｔａｔｉｎ．１ｉｎｋｅｒ为模板扩增 与ＴＮＦ带重叠区的ｓｉｇ片段，用ｐｌ １和ｐ８引物以 ＰＢＶ２２０－ＴＮＦ为模板扩增与ｓｉｇ带重叠区的ＴＮＦ片 段，用ｐ９和ｐ８为引物以ｐ９、ｐ１０扩增片段和ｐ１１、 ｐ８扩增片段为模板ＳＯＥｉｎｇ法扩增得到ｓｉｇ－ＴＮＦ，ｓｉｇ－ ＴＮＦ经Ｎｈｅ Ｉ＋ＢａｍＨ Ｉ酶切，同样酶切ｐＩＲＥＳｎｅ０３ 质粒。凝胶回收试剂盒回收ＤＮＡ片段，利用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶将ｓｉｇ－ＴＮＦ片段与ｐｌＲＥＳｎｅ０３质粒载体 连接。连接产物转化Ｅ ｃｏｌｉ ＤＨ５０ｔ，并涂布于培养平 板。随机挑选若干个菌落，用Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶及 ｓｉｇ．ＴＮＦ引物进行ＰＣＲ扩增。选取几个经克隆ＰＣＲ 和Ｎｈｅ ｌ＋ＢａｍＨ Ｉ双酶切检测阳性的菌落，小量 制备质粒。 １．４ 重组ｐｌＲＥＳｎｅ０３／ｓｉｇ－ｔｕｍｓｔａｔｉｎ－ｌｉｎｋｅｒ·ＴＮＦ基 因的转染复苏液氮中保存的ＣＨＯ．Ｋ１取出后，用 含１００ ｍｌ／Ｌ胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基于３７ｑＣ、５％ ｃ０２孵箱培养；将细胞稀释至１０６／Ｌ，每孔５００“ｌ加 入有培养基的２４孔板，将每孔中的Ｇ４１８浓度稀释 至０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ ｍｇ／Ｌ等８个 级别。各浓度３复孔，隔２ ｄ换液，培养１０—１４ ｄ， 以最低细胞全部死亡浓度为基准，筛选时比该浓度 再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。ＣＨＯ的 Ｇ４１８最佳药敏浓度浓度为６００ ｍｇ／Ｌ。当细胞生长 融合度达７０％～８０％时，按脂质体转染试剂盒操作 进行转染。分别转染ｐｌＲＥＳｎｅ０３／ｓｉｇ—ｔｕｍｓｔａｔｉｎ．１ｉｎ— ｋｅｒ－ＴＮＦ、ｐｌＲＥＳｎｅ０３／ｓｉｇ．ＴＮＦ和ｐｌＲＥＳｎｅ０３空质粒。 转染后的细胞继续进行培养，转染２４ ｈ后，稀释细 胞（１：１０）后施加筛选压力，改用含Ｇ４１８的培养基 培养，每３天换液１次，２周后分别挑选出阳性细胞
sdspage结束后按biorad产品说明凝胶靠近阴极一侧nc膜靠近阳极一侧转移缓冲液25mmolltris192mmollglycine20甲醇100v恒压1h将蛋白从凝胶电转移至nc膜上电转移结束后取出nc膜用洗涤液含002mollph74tbs04tween20室温洗3次浸入封闭液含2bsa的tbst中371h洗涤液tbst室温洗3次加入抗一tnfot单克隆抗体为一抗37孵育1htbst室温洗3次辣根过氧化物酶标记的抗isg为二抗37c孵育1htbst室温洗3次再用tbs洗3次nc膜浸入显色液中室温避光显色5rain蒸馏水冲洗终止反应
ｇｇａｔｃｃａｃｃａｇａｔｃｃａｃｃｔｇａｇｃｃａｃｃ ａｃｃ昏昏ｃｔｔｔｔｃｔｔｃａｔｇｃａｃ一３ ７； ｐ６：５’－ａｇａｔｃｃａｃｃｔｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｔｇｔｃｔｔｔｔｃｔｔｃａｔｇｃａｃ一３’；ｐ７： ５ ７－ｇ昏ｇｇｃｔｃａｇ昏ｇｇａｔｃｔｇ殍射ｃａｇａｔｃａｔｃｔｔｃｔｃｇ一３’；ｐ８：５’一ｇａｔｇ—
ｇａｔｃｃｔｃａｃａｇｇｇｃａａｔｇａｔｃｃｃ ａａａｇｔａｇ－３’；ｐ９：５’一ａｔｔｇｃｔａｇｅａｔ—
ｇａｇｃｇｃｃｃｇｇａｃｃｇｃｃｃｃｃ一３ ７；Ｐ１０：５ ７－ｔｃｇａｇａａｇａｔｇａｔｃｔｇａｃ
ｇｃｔｇｇｅｔｇｅｇｇｇｅｇｅｅｇｅ－３ ７：ｐｌ １：５’一ｇｅｇｇｅｇｅｅｅｇｅａｇｅｃａｇｅｇｔ— ｃａｇａｔｃａｔｃｔｔｃｔｃｇ一３’。
１．３．２ ＲＴ—ＰＣＲ克隆人ｔｕｍｓｔａｔｉｎ全长编码基因 将人胚肾细胞株２９３细胞培养至对数期后，计数、离 心收集细胞提取总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物合成 ｅＤＮＡ第一链，取２斗ｌ逆转录产物为模板，用引物 Ｐ１和引物ｐ２进行常规ＰＣＲ扩增ｔｕｍｓｔａｔｉｎ基因。 １．３．３ ｐＧＥＭ—Ｔ／ｔｕｍｓｔａｔｉｎ构建ｔｕｍｓｔａｔｉｎ基因克 隆到ｐＧＥＭ．Ｔ载体，酶切、连接、转化和筛选参照文 献［８］的方法进行。阳性质粒命名为ｐＧＥＭ—Ｔ／ｒｕｍ— ｓｔａｔｉｎ。连接产物转化大肠杆菌ＤＩ－ＩＳ ０【，ＤＮＡ序列分 析委托上海生物工程公司进行。 １．３．４ ＰＣＲ扩增ｓｉｇ－ｔｕｍｓｔａｔｉｎ．１ｉｎｋｅｒ基因片段用 ｐ３和ｐ５引物以ｐＧＥＭ—Ｔ／ｔｕｍｓｔａｔｉｎ为模板进行ＰＣＲ 扩增，再以此扩增产物为模板用Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶ｐ４ 和Ｉ）６为引物扩增，扩增产物即为携带Ｎｈｅ Ｉ＋ ＢａｍＨ Ｉ酶切位点的ｓｉｇ．ｔｕｍｓｔａｔｉｎ—ｌｉｎｋｅｒ。基因克隆 到ｐＰＧＥＭ—Ｔ载体，得到ｐＧＥＭ．Ｔ／ｓｉｇ—ｔｕｍｓｔａｔｉｎ—ｌｉｎｋｅｒ 质粒。 １．３．５重叠区扩增拼接法（ＳＯＥｉｎｇ）扩增ｓｉｇ—ｔｕｒｎ— ｓｔａｔｉｎ－ｌｉｎｋｅｒ．ＴＮＦ 用ｐ７和ｐ８引物以ＰＢＶ２２０—１ＮＦ 为模板扩增带接头的ｌｉｎｋｅｒ．ＴＮＦ片段。再用高保真 的ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ聚合酶ｐ４和ｐ８引物以