茶碱对暴露于烟草烟雾提取物下小鼠C2C12细胞的保护作用

茶碱对暴露于烟草烟雾提取物下小鼠C2C12细胞的保护作用肖影;何志义;黄冬妹;麻芝英;周玉梅;利金凤
【摘要】目的:探讨茶碱对暴露于烟草烟雾提取物(CSE)下小鼠成肌细胞(C2C12细胞)的保护作用.方法:CSE和茶碱分组干预小鼠C2C12细胞,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组细胞培养上清液内白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量;实时定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞核因子-κB(NF-κB)mRNA和组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2) mRNA的表达.结果:CSE组C2C12细胞IL-8和TNF-α较空白对照组释放增加,HDAC2 mRNA相对表达量减少,NF-κB mRNA相对表达量增多(P＜0.05);茶碱+CSE组的IL-8和TNF-α释放量较空白对照组升高,较CSE组下降(P＜0.05),HDAC2 mRNA表达量较空白对照组和CSE组升高(P＜0.05),NF-κB mRNA表达量较空白对照组升高,较CSE组下降(P＜0.05).结论:茶碱的预先干预可以减轻CSE暴露下C2C12细胞内HDAC2的水平的下调,进而抑制NF-κB的活性,从而降低C2C12细胞产生的炎症介质水平,推测茶碱对暴露于CSE下的
C2C12细胞具有保护作用.
【期刊名称】《广西医科大学学报》
【年(卷),期】2015(032)005
【总页数】3页(P711-713)
【关键词】茶碱;小鼠成肌细胞;组蛋白去乙酰化酶2;核因子-κB
【作者】肖影;何志义;黄冬妹;麻芝英;周玉梅;利金凤
【作者单位】广西医科大学第一附属医院呼吸内科南宁530021;广西医科大学第一附属医院呼吸内科南宁530021;广西医科大学第一附属医院呼吸内科南宁
530021;广西医科大学第一附属医院呼吸内科南宁530021;广西医科大学第一附
属医院呼吸内科南宁530021;广西医科大学第一附属医院呼吸内科南宁530021【正文语种】中文
【中图分类】R33
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是在全球范围内导致人类死亡的主要疾病之一。

目前认为，COPD患者无论是稳定期还是急
性加重期均存在全身系统性的炎症反应。

而骨骼肌是主要的肺外受累器官，病理表现为肌纤维的萎缩与凋亡，研究发现，核因子-κB(nuclear f actor-κB,NF-κB)和组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase2,HDAC2)参与调控[1]。

临床上用于治疗COPD的茶碱同时也具有免疫调节和抗炎的作用。

本研究观察到茶碱预先干预后，暴露于烟草烟雾提取物(cigarette smoke extract，CES)下的小鼠成肌细胞
(C2C12细胞)内HDAC2的下调减轻，NF-κB的表达下降，C2C12细胞产生的炎症介质水平下降，提示茶碱对暴露于CSE下的C2C12细胞具有一定的保护作用，从而推测茶碱可以减轻COPD患者的骨骼肌炎症反应，为茶碱临床应用提供新的
思路与实验基础。

1.1 材料：小鼠C2C12细胞株(中科院上海细胞库)；标准胎牛血清,高糖DMEM
培养基,马血清(Gibco)；万宝路牌香烟(一氧化碳含量15 mg，焦油量15 mg，烟碱量1.2 mg)；茶碱和MTT(Sigma公司)；TRIzol试剂(Invitrogen)，逆转录试剂盒及荧光mix(TaKaKa)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉华美公司)。

1.2 方法
1.2.1 CSE的制作:采用简易冷凝装置，依靠20 mL注射器驱动装置将5支去滤
嘴燃烧的香烟连续抽吸，使烟雾缓慢进入20 mL PBS缓冲液中，不断充分振荡使
其溶解制成悬液。

上述抽吸完40支烟后收集液体，使用紫外分光光度计在320
nm波长测得CSE吸光度(A)值，并进一步换算出CSE浓度。

-20 ℃冰箱保存，细
胞干预实验待用。

1.2.2 C2C12细胞培养：用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱内培养细胞，每2～3 d传代1次。

传代后细胞继续在含10%马血清
的高糖DMEM培养基中培养。

选取6～7分化成熟的细胞进行后续实验。

1.2.3 四甲基偶氮唑蓝(methyl thriazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞增殖:以
每孔约3 000个细胞数接种于96孔板，CSE组分别予终浓度为0.1%、0.2%、
0.4%的CSE干预，茶碱组分别予终浓度为10-3 mol/L、10-4 mol/L、10-5
mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L的茶碱干预，每个浓度设置5个复孔，并设置
正常细胞为空白对照组。

根据MTT 试剂说明书进行相关实验，分别于24 h、48
h、72 h检测C2C12细胞生长情况。

1.2.4 实验分组：取分化成熟的C2C12细胞，以每孔约1×104个细胞/mL接种
到24孔板，分为空白对照组、CSE组、茶碱干预组(包括茶碱24 h+CSE组、茶
碱48 h+CSE组、茶碱72 h+CSE组3个亚组)。

根据MTT实验结果，选用CSE
终浓度为0.2%(作用细胞24 h)，茶碱终浓度为10-5 mol/L(分别作用细胞24 h、48 h、72 h)干预细胞。

干预后收集细胞培养上清液和细胞。

实验重复3次。

1.2.5 ELISA测定各组细胞培养上清液白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的含量：小心吸取各组细胞培养液上清，于4 ℃ 1 000 r/min 离心5 min去除细胞碎片后，按照IL-8和TNF-α相应
的ELISA试剂盒说明书立即进行上清液内细胞因子的检测。

所得的实验结果(A值)用Curve Expert 1.4软件换算成IL-8 和TNF-α的浓度后进行统计学分析。

1.2.6 实时定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞HDAC2和NF-κB的mRNA的相
对表达量：24孔板中培养的细胞按上述试验方法分组处理并收集细胞培养上清液后，直接在24孔板中加入Trizol，分别提取上述各组的总RNA，用
NANODDROP2000 测定总RNA 的浓度及纯度，并逆转录为cDNA。

使用实时
荧光定量PCR 仪进行PCR 扩增。

NF-κB基因上游引物为5’-GATGCTGATGAAGACTTGGGG-3’，下游引物为5’-TGTGGAGTGAGACATGGACACAC-3’，扩增片段长度132 bp;HDAC2 基因上
游引物为5’-AGCCCATGGCGTACAGTCAA-3’，下游引物为5’-GGGATGACCCTGGCCATAATAA-3’，扩增片段长度95 bp; GAPDH 上游引物
为5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’，下游引物为5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’，扩增片段150 bp。

20 μL反应体系，反应条件:95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。

采
用2-△△Ct法计算各组HDAC2 mRNA的相对表达量。

1.2.7 统计学方法:采用SPSS16.0进行统计分析，数据用均数±标准差±s)表示，并检验数据的正态性和方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，方
差齐时组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)，方差不齐时采用Dunnett
T3法。

P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 药物对细胞增殖的影响：通过MTT 法测定CSE作用细胞24 h，终浓度为
0.1%和0.2%的CSE对C2C12细胞生长无明显影响(P>0.05)，终浓度为0.4%的CSE使C2C12细胞生长活性明显受抑制(P<0.05)。

CSE作用细胞48 h，终浓度
为0.1%的CSE对C2C12细胞生长无明显影响(P>0.05)，终浓度为0.2%和0.4%的CSE使C2C12细胞生长活性明显受抑制(P<0.05)。

CSE作用细胞72 h，终浓
度为0.1%、0.2%和0.4%的CSE均明显抑制C2C12细胞生长(P<0.05)，见表1。

茶碱终浓度在10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L与空白对照组比较，C2C12
细胞数量差异无统计学意义(P>0.05)，10-3mol/L、10-4mol/L与空白对照组相
比C2C12细胞数量差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

根据MTT结果，在不
影响C2C12细胞生长活性的前提下，本实验选取CSE终浓度为0.2%作用细胞24
h，茶碱终浓度为10-5mol/L作用细胞进行干预。

2.2 茶碱对CSE介导下C2C12细胞的影响
2.2.1 各组细胞NF-κB mRNA的表达：CSE组NF-κB mRNA相对表达量高于
空白对照组(P<0.05);茶碱干预的3个亚组的NF-κB的mRNA相对表达量均高于
空白对照组(均P<0.05)，但均低于CSE组(均P<0.05)，见表2。

2.2.2 各组细胞HDAC2 mRNA的表达：CSE组HDAC2 mRNA相对表达量低
于空白对照组(P<0.05);茶碱24 h+CSE组的HDAC2 mRNA相对表达量与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，茶碱48 h+CSE组和茶碱72 h+CSE组
的HDAC2 mRNA相对表达量均高于空白对照组(均P<0.05)，但茶碱干预的3个亚组均高于CSE组(均P<0.05)，见表2。

2.2.3 各组细胞释放IL-8水平：CSE组释放IL-8水平高于空白对照组(P<0.05);
茶碱24 h+CSE组释放IL-8水平与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，茶碱48 h+CSE组和茶碱72 h+CSE组释放IL-8水平均高于空白对照组(均
P<0.05)，但茶碱干预的3个亚组均低于CSE组(均P<0.05)，见表3。

2.2.4 各组细胞释放TNF-α水平：CSE组释放TNF-α水平高于空白对照组
(P<0.05);茶碱24 h+CSE组和茶碱48 h+CSE组释放TNF-α水平均高于空白对
照组(均P<0.05)，茶碱72 h+CSE组释放TNF-α水平与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；茶碱24 h+CSE组释放TNF-α水平与CSE组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，茶碱48 h+CSE组和茶碱72 h+CSE组释放TNF-α水平均低于CSE组(均P<0.05)，见表3。

目前COPD患者全身性炎症反应的主要受累器官是骨骼肌，肢体肌肉功能障碍在COPD患者中普遍存在,病理表现为骨骼肌的萎缩[2]。

以往发现NF-κB途径在骨
骼肌萎缩的机制中有着重要作用，NF-κB转录活性增加可引起骨骼肌萎缩[3]。

而HDACs催化组蛋白去乙酰化，是调控炎症基因转录的重要环节。

有文献指出，
CSE暴露引起的氧化应激反应过程中，C2C12细胞可能因为出现HDAC2表达下
调而导致NF-κB转录活性增强，进而炎症介质的释放增加[4]。

基于上述研究结果，本研究用CSE和茶碱干预C2C12细胞，结果发现预先使用茶碱对C2C12细胞进
行干预再将其暴露于CSE，较空白对照组的细胞内HDAC2 mRNA表达下降，
NF-κB mRNA表达增多，C2C12细胞产生的炎症因子IL-8和TNF-α增多，但较单纯暴露于CSE的细胞内HDAC2 mRNA表达增多，NF-κB mRNA表达下降，
细胞产生的炎症因子IL-8和TNF-α减少，因此我们推测虽然茶碱不能完全抑制CSE暴露所致氧化应激引起的C2C12细胞炎症反应，但上述炎症反应得到了一定程度的减轻,这对氧化应激下的C2C12 细胞具有一定的保护作用，本研究结果未提示这一作用与茶碱的作用时间有明确关系。

临床上治疗COPD时联合用药常能取
得更好的疗效，在中国茶碱是常用药物，本研究发现茶碱能减轻氧化应激下
C2C12细胞的炎症反应，从而推测临床上茶碱可以减轻COPD患者的全身炎症反应及伴发的肢体肌肉功能障碍，这为茶碱临床应用提供新的思路，但需要进一步的临床研究才能明确其临床疗效。

广西医科大学学报2015 Oct;32(5)
【相关文献】
[1] 黄冬妹,何志义,麻芝英,等.香烟烟雾对C2C12小鼠成肌细胞HDAC2及炎症介质的影响[J].中国
病理生理杂志,2015,31(1):8-11.
[2] Maltais,F,Decramer M,Casaburi R,et al.An official American Thoracic Society/European Respiratory Society statement:update on limb muscle dysfunction in chronic obstructive pulmonary disease[J].Am J Respir Crit Care Med,2014,189(9):e15-e62.
[3] Hunter RB,Stevenson E,Koncarevic A,et al.Activation of an alternative NF-kappaB pathway in skeletal muscle during disuse atrophy[J].Faseb J,2002,16(6):529-538.
[4] 麻芝英,钟小宁,何志义,等.香烟烟雾提取物下调小鼠C2C12成肌细胞组蛋白去乙酰化酶2表达并增强炎性细胞因子释放[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,31(3):312-315,320.。