柔嫩艾美耳球虫广西南宁株的分离及鉴定

柔嫩艾美耳球虫广西南宁株的分离及鉴定
陈桂先;韦园园;陈汉忠;周坚成;王柏生;白波;吴桂贤;韦荣莲
【摘要】利用从南宁市郊养鸡场球虫病鸡粪便中收集的球虫混合种卵囊感染小鸡,再应用单卵囊分离感染技术,从感染鸡盲肠中收集的卵囊分离纯化获得1株纯种球虫,经鸡体传代增殖,对该虫株的卵囊大小和卵形指数、潜在期、排卵高峰期、最短孢子化时间、寄生部位、致病性等指标进行观察和测定.结果测得该虫株卵囊的平均大小为(25.743±1.94126)μm×(21.4±1.85985)μm,平均卵型指数为
1.2067±0.07;潜在期为140 h;其排卵囊峰期在第6～9天,最高峰在第7天;最短孢子化时间为19 h;寄生部位在盲肠;对两周龄的艾维茵鸡,当使用5×104的孢子化卵囊感染剂量时死亡率为7.5%.根据这些测定和观察到的指标综合鉴定该分离株球虫为柔嫩艾美耳球虫,并命名为柔嫩艾美耳球虫广西南宁株(Eimeria,tenella-GXNN),该研究结果为进一步研究本地区鸡球虫病的药物治疗和免疫预防等奠定了基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2010(037)009
【总页数】5页(P168-172)
【关键词】鸡;球虫;分离;鉴定
【作者】陈桂先;韦园园;陈汉忠;周坚成;王柏生;白波;吴桂贤;韦荣莲
【作者单位】广西大学动物科技学院,南宁,530005;广西农业职业技术学院,南宁,530007;广西大学动物科技学院,南宁,530005;广西大学动物科技学院,南
宁,530005;广西大学动物科技学院,南宁,530005;广西大学动物科技学院,南
宁,530005;广西大学动物科技学院,南宁,530005;广西大学动物科技学院,南
宁,530005;广西大学动物科技学院,南宁,530005
【正文语种】中文
【中图分类】S852.72
鸡球虫病是由艾美耳属球虫寄生在鸡肠道引起的一种常见和危害严重的寄生虫病,全球每年因球虫病造成的损失达80亿美元,中国每年仅用于治疗鸡球虫病的支出就达 25亿元人民币(古少鹏等,2008)。

引起鸡球虫病的艾美耳属球虫种类多,公认的有7种,这些球虫往往呈混合感染,其中致病性较强的是柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)。

研究结果表明,由于地理环境的不同,同种球虫的不同地理株往往在一些生物特性上会存在差异(Adrian等,2002;陈兆国等,2001;Bhogal等,1992;陶建平等,2005;赵权等,2003),而球虫的这些特性对球虫病的治疗和免疫预防具有重要的意义。

本研究试图应用单卵囊分离技术,从本地发病的鸡中分离纯化柔嫩艾美耳球虫虫株,为进一步研究其生物学特性和开展鸡球虫病治疗和免疫预防提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 鸡球虫卵囊的收集从广西南宁市郊区有盲肠球虫病的鸡场采集病鸡粪便,按常规方法收集球虫卵囊,将收集到的混合卵囊置于
2.5%重铬酸钾溶液平皿中(每天搅动1～2次),于23～29℃恒温培养箱中培养至孢子化,直至球虫卵囊孢子化达85%以上,置4℃冰箱保存备用。

采用离心沉淀法将上述收集培养好并保存于4℃冰箱的球虫孢子化混合卵囊反复离心、沉淀,洗净重铬酸钾,用麦克马斯特计数板进行计数,然后感染5只在无球虫环境下饲养至3日龄的艾维茵鸡,每只感染10000个孢子化卵囊,于感染后第8天剖杀,取盲肠,在无菌接种箱中用常规方法进行盲肠卵囊的收集,
并于2.5%的重铬酸钾溶液中30℃恒温培养至孢子化(培养期间每天摇动平皿3～4次),4℃冰箱保存备用。

1.2 试验动物与饲养管理艾维茵鸡苗购自广西某有限责任公司。

所有的试验鸡均于消毒好的纸盒运回,并分开饲养于自制的经严格消毒的鸡笼内,试验前用饱和盐水漂浮法检查小鸡粪便,均为阴性。

试验小鸡饲料按照小鸡营养需求自行配制,不添加任何抗球虫药的粉状饲料,并且所有饲料均于饲喂前进行高压灭菌消毒。

试验小鸡自由饮水,自由采食。

1.3 试验用其他器材药品琼脂粉,北京某生物技术责任有限公司,生产批号20011012;电泳制胶槽、载玻片、手术刀片、标本针、离心管和胶头吸管等所有实验室用具在使用前都经过严格的高温消毒。

1.4 球虫单卵囊的分离与增殖
1.4.1 琼脂块的制备称取0.126 g琼脂粉,加入7 mL的蒸馏水,加热、溶解,稍微冷却后立即倒入20 mL容量的电泳制胶槽小格内,凝固后便形成0.3 cm厚的琼脂块,取下浸没于盛有蒸馏水的平皿中备用。

1.4.2 卵囊悬液的稀释将收集的卵囊离心后加入饱和食盐水,混匀后立即取中层液置于显微镜下计数,计数完毕后加入适量的蒸馏水进行卵囊悬液的稀释,用胶头吸管吸取卵囊悬液滴于载玻片上,100×显微镜下观察,当每一滴悬液中含有8～10个孢子化卵囊时为较佳稀释度。

1.4.3 单卵囊的分离与感染用手术刀片将琼脂块切割成长×宽×高=1 cm×0.5 cm×0.3 cm的小块置于载玻片上,滴上一滴卵囊悬液,稍微等待,以便让卵囊较稳定地吸附于琼脂块上,然后先在低倍镜(100×)下观察,当视野中出现卵囊后,即转为高倍镜(450×)观察。

从试验目的出发,所分离的卵囊大小(长度×宽度)都主要选择在(19.5～26.0)μ m×(16.5～2
2.8)μ m 的范围之内,且孢子化情况良好。

选择好单个卵囊后,切下该琼脂块,移至载玻片干净的一角,重新检查一次(包括琼脂块的边缘及
与玻片接触的地方),确认该琼脂块只有一个孢子化卵囊后,用标本针挑取该琼脂块经口接种给1日龄的无球虫小鸡,并滴入2～3滴的蒸馏水,促其咽下。

1.4.4 单卵囊接种鸡的饲养与卵囊收取接种单卵囊后的小鸡,逐只分开饲养于自制的经严格消毒的鸡笼内,任其自由采食、自由饮水,24 h光照。

在接种后24 h开始,每24 h分别收集粪便检查有无卵囊排出,一旦在接种后0～120 h之间发现子代卵囊,立即剖杀相应的鸡予以淘汰,一旦在120 h以后检查到子代卵囊,则于接种后168～192 h内剖杀相应的鸡,去盲肠内容物,加入
2.5%的重铬酸钾溶液,置于23～29℃恒温培养箱中吹气孵化36～48 h,直至球虫卵囊孢子化达85%以上,置4℃冰箱保存备用。

大于192 h没有查到子代卵囊,则认为单卵囊感染失败,试验停止。

1.4.5 继代增殖将查出卵囊的雏鸡粪样分别培养至卵囊孢子化后,离心水洗3次除去重铬酸钾,然后加少许生理盐水吹打均匀,再喂给14日龄无球虫雏鸡,收集感染后6～8 d粪样培养,再感染雏鸡。

同样方法,连续增殖,直至收集到大量足够的纯种卵囊。

1.5 卵囊大小和卵形指数测定将收集到的单卵囊增殖的母代卵囊置于
2.5%的重铬酸钾溶液的平皿中(每天搅动1～2次),于23～29℃恒温培养箱中样至孢子化,直至球虫卵囊孢子化达85%以上,在显微镜下(450×)观察原代纯种卵囊的形状,用测微器测量100个卵囊的大小。

1.6 分离虫株最短潜在期及其排卵高峰期的测定
将孢子化的纯种卵囊经口感染给10只7日龄的无球虫小鸡,接种剂量400个/只,从感染后第120 h开始,每隔1 h收集一次粪便,用饱和盐水漂浮法及离心技术进行粪便卵囊的检查,记录最早检出卵囊的时间。

从感染后第5天开始,每天收集粪便,进行O.P.G(每克粪便卵囊数)的测定,了解其排卵高峰期。

1.7 分离虫株寄生部位及最短孢子化时间测定将孢子化的纯种卵囊经口感染10只1日龄无球虫小鸡,剂量15000个/只,感染后第7天,收集试验鸡1 h内排出的新鲜
粪便,并立即进行卵囊的收集,于2.5%的重铬酸钾溶液中30℃恒温培养(所用平皿规格为10 cm×10 cm,液面高度为0.4 cm),从培养后第14小时开始,每隔1 h镜检一次卵囊的孢子化情况,记录出现第一个孢子化卵囊的时间。

将孢子化的纯种卵囊经口感染10只1日龄无球虫小鸡,剂量15000个/只,于感染后1～6 d,每天剖杀一只,观察其病变特征,刮取各段小肠和盲肠黏膜,涂片镜检其在肠道中的寄生部位。

1.8 分离虫株致病性测定将饲养至两周龄的艾维茵随机分组,每组15只。

第1组为空白组、其余的5组感染孢子化的纯种卵囊,剂量分别为0.1×104、0.5 ×104、1×104、5×104、10×104。

记录接种感染后7 d内各组临床症状,特别是血便的排放时间和数量的变化,第7天全部试验鸡剖杀并进行肠道病变记分,病变记分按Johnson等(1950)所描述的方法进行肠道病变记分。

根据临床表现和虫株寄生部位病变对已经获得的分离球虫虫株的致病性进行初步评价。

2 结果
2.1 单卵囊分离感染试验结果这次单卵囊的分离共感染了8只小鸡,其中3只小鸡在感染后1周内检出卵囊,感染成功率为37.5%。

这是一次比较成功的单卵囊分离感染试验,主要在以下几个方面进行了调整:①本次试验倒制琼脂板时把用平皿倒制琼脂板改用电泳制胶槽,克服了倒板时,琼脂板不易倒均匀的缺点;②在琼脂浓度配制的控制上,经过反复试验采用了1.7%浓度,从而避免倒制琼脂板时琼脂液过稠凝结过快,又能保持琼脂板有足够的韧性;③在倒的过程中温度控制上,掌握在琼脂液稍微冷却时(40℃左右)就及时倒入,保证琼脂液有良好的流动性从而获得了均匀厚度的琼脂板。

通过上述这些措施进一步提高了单卵囊分离的效果。

另外,分离单卵囊时在卵囊液浓度的选择方面,经过反复测试,选择了一滴卵囊液平均含有8～10个卵囊,使用这个卵囊浓度时可使滴到琼脂板上的卵囊比较容易均匀,通常在平均能保证在长×宽=1 cm×0.5 cm琼脂板上的卵囊数为1～3个,而且当卵囊数为2 h,并且相隔较远时,可以很方便的在显微镜下操作切割琼脂块获取2个单卵囊,有效的提高了分
离效率。

2.2 分离球虫虫株特性鉴定结果从单卵囊分离感染成功的小鸡粪便中收集到纯种球虫虫株后,选择一株经增殖后获得了大量纯种卵囊,然后从卵囊大小和卵形指数、潜在期、排卵高峰期、最短孢子化时间、寄生部位、致病性等几个方面对该虫株进行了观察和测定。

2.2.1 卵囊大小和卵型指数测定结果对该株母代(增殖后的第一代)的100个卵囊进行了卵囊大小(长×宽)测量值计数,通过SAS统计软件处理得到该株卵囊的平均卵型指数为1.2067±0.07,其卵囊平均大小为(25.743±1.94126)μ
m×(21.4±1.85985)μ m 。

2.2.2 最小潜在期及其排卵高峰期的测定结果从120 h开始每1 h,检查粪便一次,经过20 h的观察,在140 h的时候,用饱和食盐水漂浮法可以初次观察到视野中有少量的未孢子化的卵囊。

此时的卵囊其原生质团仍充满卵囊内部。

从试验小鸡感染后的第5-15天收集粪便,检查计数其中的卵囊,结果其排卵囊峰期在第6～9天,最高峰在第7天,见图1。

图1 分离虫株排卵囊峰期
2.2.3 最短孢子化时间测定结果卵囊培养后开始在光镜下观察孢子化过程时,观察到了卵囊孢子化的4个阶段:孢子质浓缩,孢子质分裂阶段,孢子囊形成阶段,子孢子分化阶段,到第19小时卵囊孢子化完成,其最短孢子化时间为19 h。

2.2.4 寄生部位测定及病变观察用分离的球虫虫株孢子化卵囊感染小鸡后,剖检结果发现,球虫卵囊和病变只出现在盲肠及附近(图2),盲肠肿大,盲肠内充满血液,肠黏膜出血,镜检盲肠内容物可以看到大量的球虫卵囊。

图2 球虫虫株寄生部位及引起的病变注:箭头所指部位为球虫虫株的寄生部位与病变。

2.2.5 致病性测定用不同剂量的球虫感染后各组出现症状、剖检病变记分和死亡情
况见表1。

感染后第5、6天开始有明显临床症状出现,主要表现为食欲下降、缩颈、扎堆、拉稀粪、拉血便,其中第5、6组最为严重,第6组出现血便是最早的,第4天就出现了;第4、5组是第5天才出现的,而第1、2组是在第6天才出现;剖检病变
记分从表1也可以看出,随着感染剂量的增加,病变程度也增加;第5、6组感染剂量
最高,分别出现2只和3只鸡的死亡。

从试验结果来看这株球虫的毒力较强,对2周龄的小鸡有明显的致病性。

3 讨论
鸡常见的球虫有7种,它们的形态、生活史等都很相似,最基本的差别在于各种球虫的寄生部位、潜在期、孢子化时间、致病性、卵囊大小等(索勋等,1998)。

在对鸡
球虫生物学和鸡球虫病的研究方面,如球虫的分类、虫株的鉴别、遗传变异、球虫
致病性、球虫的活苗、基因工程苗、球虫耐药性等方面的研究都需要纯种虫株来进行,以获得更为可靠和准确的数据(安健等,2004)。

本研究应用单卵囊分离技术,用单卵囊感染了8只小鸡,其中3只小鸡的粪便中收集到卵囊,将其中1只小鸡收集到的球虫卵囊进行了增殖,获得了大量的纯种后代,然后对这株球虫的卵囊大小和卵形指数、潜在期、排卵高峰期、最短孢子化时间、寄生部位、致病性等指标进行观察和测定。

结果测得该虫株卵囊的平均大小为(25.743±1.94126)μ m ×(21.4
±1.85985)μ m,平均卵型指数为1.2067±0.07;潜在期为140 h;其排卵囊峰期在第6～9天,最高峰在第7天;最短孢子化时间为19 h;寄生部位在盲肠;对两周龄的艾维茵鸡,当使用5×104的孢子化卵囊感染剂量时死亡率为7.5%。

通过将这些测定和
观察到的指标与文献(Levine,1961;索勋等,1998;汪明,2006)描述过的各种鸡艾美耳球虫的特征进行了对比,综合分析将该分离株球虫鉴定为柔嫩艾美耳球虫,并命名为
柔嫩艾美耳球虫广西南宁株(Eimeria.tenella-GXNN)。

表1 分离球虫虫株致病性测定结果组别第1组第2组第3组第4组第5组第
6组组鸡数 15 15 15 15 15 15感染后第5、6天出现明显临床症状鸡 0 3 6 11
15 15平均病变记分0 2.07±0.59 2.20±0.68 2.27±0.59 2.53±0.83 2.87±0.92
死亡数 0 0 0 0 2 3
研究结果表明,由于地理环境的不同,同种球虫的不同地理株往往在一些生物特性上
会存在差异,表现在致病性、耐药性和免疫原性等方面有一定的变异性(Adrian
等,2002;陈兆国等,2001;Bhogal等,1992;陶建平等,2005;赵权等,2003),如张伟信
等(2006)用5个不同地理株的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella),即:广州株、保定株、长
春株、北京株、沈阳株,对12日龄雏鸡分别进行免疫和攻虫。

结果发现,不同地理
株球虫的免疫保护率有明显差异,广州株、保定株、长春株、北京株、沈阳株的保护率分别为80.2%、73.2%、68.4%、63.8%、51.0%。

赵权等(2003)对来自山东、吉林、黑龙江、北京4个不同地区的鸡柔嫩艾美耳球虫的致病性进行了研究,结果
表明,这几株鸡柔嫩艾美耳球虫的致病性有明显差异,其中山东株的致病性最强,黑龙江株和吉林株的致病性次之,北京株最弱,而且统计学分析显示它们之间差异显著。

张香斋等(2008)、张艳英等(2009)、李驰等(2008)分别利用了秦皇岛株柔嫩艾美
耳球虫、唐山株柔嫩艾美耳球虫和沈阳株柔嫩艾美耳球虫进行了抗药性研究,结果
表明,秦皇岛株柔嫩艾美耳球虫对马杜霉素只有轻度抗药性,而唐山株柔嫩艾美耳球
虫和沈阳株柔嫩艾美耳球虫对马杜霉素已经产生完全的抗药性。

上述这些研究结果都说明不同地理环境的同种球虫,在某些特性上确实存在差异,而且这种差异有时候
是非常显著的,因此分离鉴定本地球虫虫株,对研究了解其生物特性和进行防治研究
都具有重要的意义。

本研究应用单卵囊分离技术,从本地发病的鸡中分离鉴定出了
柔嫩艾美耳球虫虫株,这为进一步研究其生物学特性和开展鸡球虫病治疗和免疫预
防奠定了基础。

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