第1讲--细胞培养的设施与技术基础(1)

自动双重纯水蒸馏器，纯水仪
超净工作台
CO2培养箱
显微操作仪、倒置显微镜
冰箱 离心设备：离心机、离心管、移液管/吸管/移液器
培养器皿：培养瓶、培养皿、培养板
细胞计数器/仪、计数板 摇床 液氮罐 压力蒸汽消毒器 水纯化装置 电热干燥箱 滤器，酸缸
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超净工作台
工作原理
利用鼓风机驱动空气 滤过高效滤器除去空 气中的尘埃颗粒而净 化。净化空气徐徐通 过工作台面，使工作 台内构成无菌环境。
按一定设计方案，在细胞、亚细胞或组织水平上 进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官及 个体，创造优良品种和产品的生物工程。
细胞生物学、生物工程是其基础
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绪论与课程介绍 P1-4
细胞工程的研究内容**
细胞与组织培养(Cell/Tissue culture)(P1)
细胞融合或细胞杂交(Cell fusion/hybridization)： 在自然或人工诱导条件下，两个或两个以上细胞 形成一个细胞的过程 运用：单克隆抗体技术
营养成分
氨基酸 单糖 维生素 无机盐
促生长因子及激素
适宜的pH: 7.2-7.4
渗透压：260-320mOsm/kg
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4.1 天然培养基
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液 （如鸡胚和牛胚浸液）。
✓ 优点：营养成分丰富，培养效果好 ✓ 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些
实验产物的提取和实验结果的分析。易发
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大容量细胞培养箱
细胞转瓶机
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倒置显微镜
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纯水装置
自动双重纯水蒸馏器
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纯水仪
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过滤装置--过滤除菌
各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌消毒处理。 微孔滤膜滤器是目前应用最精选广可编泛辑pp的t 过滤装置
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冰箱与液氮罐
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第二节 细胞培养的条件
补充材料及参阅P42-51
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培养细胞的体外生存条件
恒定的细胞 生长温度
无菌无毒的细 胞培养环境
合适的气体 环境
优质血清
合适的细胞 培养基
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1. 恒定的温度:37 ℃
人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温 度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡
完成国家自然科学基金主任基金1项
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教学安排
理论：36学时，1,2,3,4,6,8,10,12,13周 实验：18学时， 5,7,9,11周 理论课老师：张伶(柳满然)，陈婷梅，
柳满然 实验课老师：陈婷梅，柳满然
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绪论与课程介绍 P1-4
细胞工程 (Cell engineering)***
冰箱
液氮容器
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压力蒸汽消毒器
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压力蒸汽消毒器
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移液器
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培养皿、培养瓶和培养板
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常用一次性聚苯乙烯材料精选制可品编辑或pp中t 性硬度玻璃皿 = 2.5个6cm培养皿 1个6cm培养皿 = 2个3cm培养皿 1个3cm培养皿 = 1个6孔板 1个6孔板 = 2-2.5个12孔板 = 4-6个24孔板
胚胎工程(Embryonic engineering)： 以生殖细胞和胚胎细胞为对象，进行的细胞工程操作 运用：畜牧业
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绪论与课程介绍 P1-4
细胞工程的范畴
干细胞与组织工程(Tissue engineering)： 将干细胞与材料科学相结合，将自体或异体干细胞经体外 扩增后，种植在预先构建好的聚合物支架上，在适宜条件 干细胞沿聚合物支架迁移、铺展、生长、分化，最终发育 为具有特定形态和功能的工程组织。
酸性培养液呈橙黄色
碱性培养液呈深红色
细胞耐酸性比耐碱性大一些
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3. 气体
ＣＯ２有调节pH值的作用。 开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧
化碳混合气体环境中。 氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖
的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
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4. 营养—培养基
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第一节 细胞培养的设施和仪器设备
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细胞培养的设施和仪器设备
实验室设计与要求： ➢ 严格的无菌环境 ➢ 无微生物污染 ➢ 不受其它有害因素的影响
细胞培养室的设计原则：
无菌操作室最好单独设置，设在室内较少走动的内侧
常规操作和封闭培养于一室
培养、储存位于中间
清洗、消毒在另一侧
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动物细胞工程的成果
1997年多莉羊
2001年人耳鼠
口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型 肝炎疫苗、α及β干扰素、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、生长激素、 免疫球蛋白以及单克隆抗体等。
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第一章 细胞工程的设施与技术基础
细胞培养的设施和仪器设备 细胞培养的条件 无菌操作基础---清洗与消毒
4℃过夜，过滤除菌
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4.3 无血清培养基
➢ 无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中 补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋 白 、贴壁和扩展因子等
➢ 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成 分组成
➢ 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了
垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系
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超净工作台
超净工作台：也称净化工作台 （形成气流屏障）。
常见类型（P9） 侧流式（垂直式，吸气型） 外流式（水平层流式，面向操作者流动，吹气型）
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侧流式超净 工作台
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实验室布局
无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作 间三部分组成。
生支原体污染。
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4.2 合成培养基
➢ 1951年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合 成培养基(MEM)
➢ 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量， 用人工方法模拟合成的
➢ 目前已设计出许多种培养基，如DMEM、MEM、 IMDM、 RPMI-1640、 M199、Ham12、McCoys 5A 等
➢ 二类：引起严重疾病，较易直接或间接人与人、动物与人、 动物与动物间传播的微生物
➢ 三类：可引起人与动物疾病，但不构成严重威胁，传播风险有限，实验室 感染很少引起严重疾病，且能有效治疗和预防的微生物
➢ 四类：一般不会引起人与动物疾病的微生物
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实验室的生物安全
实验室生物安全等级
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4.2 合成培养基
➢ 合成培养基优缺点： • 优点：标准化生产，组分和含量相对固定，
成本低 • 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细
胞生长需要
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培养基的配制举例
RPMI-1640培养粉 1袋
碳酸氢钠
2.0 g
青、链霉素
各100单位／毫升
加三蒸水至 1000ml，调节pH值至7.2
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实验室的生物安全(补充)
生物安全的责任和义务 ➢ 保证培养物不受污染，更要保证培养物不对人和环境造成
污染和危害
➢ 从事致病性微生物实验的科研、教学、生产单位，实验室 必须有防止致病性微生物扩散的制度和人体防卫措施
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实验室的生物安全
病原微生物的分类
据病原微生物的传染性、感染后对个体或人群的危害程度分为4类： ➢ 一类：引起非常严重疾病的微生物
培养细胞对低温的耐受力较对高温强
人体细胞在39-40℃ 1小时，即能受到一定损伤，但仍有 可能恢复
当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡
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2. pH：7.2-7.4
当pH低于6.0或高于7.6时的生长会受到 影响，甚至死亡。
酚红在培养基中被用来作为pH值的指示 剂:
细胞核移植(Nuclear transplantation)：利用显微操作
技术，将胞质与胞核分离，再将不同来源的胞质与胞核
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重组，形成一个新的杂精合选可细编辑胞ppt
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绪论与课程介绍 P1-4
细胞工程的范畴
染色体工程(Chromosome engineering)： 将单个染色体、染色体组转入或移出目的细胞，使目的 细胞的染色体组发生变化
2009---重庆医科大学，博士生导师
主要研究领域： （1）肿瘤微环境与肿瘤发生、转移 （2）肿瘤EMT转化、转移、血管形成 （3）miRNA与肿瘤早期诊断
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任课老师---柳满然简介
目前在研课题8项：国家自然科学基金3项 教育部博士点基金1项 教育部出国留学基金1项 重庆市科委科学基金1项 校重点项目1项 优秀归国人员启动基金1项
保证细胞渗透压
培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需 要的各种营养成分：
✓ 12种必需氨基酸
✓ 多种非必需氨基酸
✓ 碳水化合物(主要是六碳糖)
✓ 维生素
✓ 无机盐类
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动物细胞培养基的发展过程
天然培养基阶段 合成培养基阶段 无血清培养阶段
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动物细胞培养基的基本要求
操作间放置：超净工作台及二氧化碳培养箱、 离心机、倒置显微镜等。
缓冲间放置：电冰箱、冷藏器及消毒好的无 菌物品等。
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CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37℃ ，5％CO2 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ✓ ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微
据对病原微生物的生物安全防护水平，按国家《实验室生物安全认可准则》， 将实验室分为4级(细则略)
➢ BSL-1：不得从事高致病病原微生物实验 ➢ BSL-2：不得从事高致病病原微生物实验 ➢ BSL-3：可从事高致病病原微生物实验，须经国家认可 ➢ BSL-4：可从事高致病病原微生物实验，须经国家认可
细胞工程原理
临床检验诊断学教育部重点实验室 柳满然
E-mail: mliu-hncq@ Tel: 6848-5184 1
任课老师---柳满然简介
1988、1991、2002分别于湖南师大、山东大学、 北京大学医学部获得学士、硕士、博士学位
2003-2008留学美国、助理研究员
在无血清培养基中成功地生长和增殖
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4.3 无血清培养基
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现代生物工程
发酵工程 酶工程 基因工程 细胞工程 组织工程 蛋白质工程 代谢工程
细胞工程是现代生物工程技术中最具有现 代性和生命力的组成部分，细胞工程课程 在生物工程与生物技术人才培养中具有重 要的作用。该课程是生物工程、生物技术 专业的核心课程之一。
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动物工程实验室的设置及六项工作室
无菌操作室 培养室
常于一室，即常称的细胞培养室
制备室：通常是单独的，对无菌的要求不如上述严格，培 养基等的制备
清洗室：器皿等清洗
消毒灭菌室
储藏室：液氮罐、冰箱、培养基、消毒后培养器皿
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常用仪器与设备（P9）
转基因生物与生物反应器(P2)：
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绪论与课程介绍 P1-4
细胞工程发展的4个基本阶段 P3-4
细胞与组织培养 细胞融合 细胞核移植 转基因生物
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“细胞生物学”与“细胞工程”的区 别？
细胞生物学 是研究细胞的生命活动规律及其机制的基础性学科 研究内容： 在分子、细胞和个体水平上研究细胞的结构、功能、表型 及其调控机制； 着重细胞活动的精细分子调节机制及复杂的调控网络研究
松，以保证通气。
✓ ②保持培养箱内空气干净。定期消毒
（90℃，14hrs)。
✓ ③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以
保持箱内湿度，避免培养液蒸发。
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二氧化碳培养箱
控制中心(包括键盘、显示器、指示器等)
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二 氧 化 碳 培 养 箱 的 结 构
细胞生物学：一级学科 细胞工程：二级学科
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细胞工程(Cell engineering)
主要以细胞为对象，以获得特定的细胞、组织产品 或新型物种的一门综合性生物技术。
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细胞工程特点
前沿性：现代生物技术的热点 综合性：多学科交叉 应用性：工程类课程，重在产品与技术 争议性：新技术给伦理道德带来的冲击