一种经济、快速的凝胶DNA回收方法

一种经济、快速的凝胶DNA回收方法
黄海;冯发莉;刘杨;冉贵萍
【摘要】目的:用明胶海绵吸收法回收DNA片段,并验证该方法能否有效、快速的从电泳后琼脂糖凝胶中回收DNA片段.方法:将明胶海绵剪成楔形,在紫外灯照射下插入含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶中,待海绵完全膨胀后取出,离心收集DNA 溶液;并用该法回收的DNA片段进行PCR扩增,检验其回收的DNA质量.结果:明胶海绵吸收法回收DNA样品的得率介于63%～98%,所回收的DNA进行PCR扩增能够获得相应的目的条带.结论:明胶海绵吸收法是一种快速、有效的DNA回收方法.
【期刊名称】《贵阳医学院学报》
【年(卷),期】2010(035)003
【总页数】3页(P272-274)
【关键词】电泳,琼脂凝胶;明胶海绵,吸收性;DNA
【作者】黄海;冯发莉;刘杨;冉贵萍
【作者单位】贵阳医学院,医学检验系临床生化教研室,贵州,贵阳,550004;贵阳医学院,医学检验系临床生化教研室,贵州,贵阳,550004;贵阳医学院,医学检验系临床生化教研室,贵州,贵阳,550004;贵阳医学院,医学检验系临床生化教研室,贵州,贵
阳,550004
【正文语种】中文
【中图分类】R34-33
在分子生物学实验中,从电泳后琼脂糖凝胶中回收、纯化目的DNA是最常用的的技术之一。

目前回收DNA主要是通过切胶回收,再行加热溶解纯化,并在此基础上发展出许多新方法,如冻融离心法[1]、凝胶浸泡法[2]、改良硅藻土法[3]、电泳洗脱法、石英棉纯化法[4]等,但这些方法有操作相对繁琐、成本较贵或回收耗时长等不足。

海绵吸收法是利用海绵的强吸收性,将其制作成楔形条,在紫外灯照射下直接插入目的DNA片段区域,因琼脂糖凝胶主要是水溶液,目的DNA条带可从琼脂糖凝胶中很快被吸入海绵。

1.1 材料
DNA模板采用克隆转化子的质粒DNA。

3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司,Taq DNA聚合酶、dNTP、DL 2 000 DNA marker购于TaKaRa公司,明胶海绵为Nasal Packing with string(I VALON, USA)产品,医用海绵。

1.2 方法
1.2.1 PCR扩增目的DNA片段25μl PCR反应体系中含有:模板DNA16.6μl,PCR buffer2.5μl, 2.5 mmol/LdNTP2.0μl,25μmol/L镁离子1.5μl, 20μmol/L正反引物各1.0μl,Taq酶1 U。

94℃预变性5 min后,95℃变性1 min,54℃退火1 min, 72延伸1 min循环35次,72℃延伸10 min。

1.2.2 琼脂糖凝胶电泳在100 ml 0.5×TBE缓冲液中加入1 g琼脂糖,加热熔解后,待溶液冷却至50℃以下时加入溴化乙锭,制成1%琼脂糖凝胶,取10μl DNA溶液上样,恒压100 V,电泳30 min,在凝胶成像仪上观察。

1.2.3 DNA的纯化 (1)用试剂盒纯化回收:3 S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒,按试剂盒中操作方法进行回收。

(2)明胶海绵直接吸收法:准备1.5 ml的EPP管、DNA过滤柱、把明胶海绵剪成上底为0.1 cm,下底为0.3 cm的楔形,然后将0.1 cm的一边插入目的片段中,至海绵完全膨胀后,取出海绵可在紫外光照射
下见到发出荧光的区域,放入过滤柱中,并将过滤柱套入1.5 ml EPP管中,10 000 r/min离心5 min,收集离心出的液体,即为分离纯化的DNA片段。

(3)医用海绵直接吸收法:准备1.5 ml的EPP管、DNA过滤柱、把医用海绵剪成楔形,然后将海绵插入目的片段中,至海绵完全膨胀后,取出海绵可在紫外光照射下见到目的片段,放入过滤柱中,并将过滤柱套入1.5 ml EPP管中,高速离心10 000 r/min,5 min,收集离心出的液体,即为分离纯化的DNA片段。

1.2.4 DNA的定量测定将所得回收样品作20倍稀释,用紫外分光光度计测定其
A260和A260/A280值,计算出DNA的浓度与纯度。

1.2.5 回收DNA的质量检测将回收的DNA样
品进行电泳和PCR扩增,观察有无目的条带。

1.3 统计学处理
应用医药数理统计软件SPSS 10.0进行分析,对三种回收方法进行比较。

2.1 不同材料对DNA回收的影响
采用不同的强吸收性材质,相同的操作步骤,对DNA片段进行回收。

实验结果表明,明胶海绵吸收后进行离心5 min即可,医用海绵吸收后需离心10 min。

明胶海绵的回收量为(7.57±1.91)μl、得率为(81.04±9.67)%;医用海绵的平均回收量则为(6.60±2.27)μl、得率为(57.20±15.07)%。

明胶海绵与医用海绵在回收量上无显著性差异,而在得率上有显著性差异,因此明胶海绵比医用海绵更适合吸收DNA。

2.2 回收DNA的质量检测
通过对不同材料所回收的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增后电泳进行检测。

从图1和图2显示,明胶海绵所回收的目的片段是完整的,能用PCR模板进行扩增;医用海绵所回收的目的片段不完整,存在丢失或降解。

2.3 三种回收方法的比较
用紫外可见分光光度计测A260/A280的比值,分析三种方法回收的DNA纯度;利
用A260计算出各种方法回收DNA的浓度。

用医药数理统计SPSS 11软件进行
方差分析,3S柱法与明胶海绵法在纯度上比较有差异,明胶海绵法回收纯度不及3S
柱法;通过回收得率和回收浓度比较,3S柱法与明胶海绵有显著性差异,提示明胶海
绵法回收得率好于3S柱法。

见表1。

明胶海绵是动物的皮、骨、腱及韧带中含有的胶原,经部分水解后得到的一种制品,
是一种无脂肪的高蛋白。

本实验主要利用明胶海绵具有很强的吸收特性,能够插入
琼脂糖凝胶中,吸收水溶液的同时一并将其中的DNA目的片段吸入。

所以在插入
海绵之前,必须把琼脂糖表面的水分擦干后再进行后续的操作。

同时需注意,必须待
海绵完全吸收膨胀后方可取出,最大限度获取目的DNA组分。

明胶海绵直接从琼脂糖凝胶中吸收DNA片段的同时,也吸收其他有机化合物、无
机盐离子及寡核苷酸引物等杂质,会对DNA的纯度造成了一定的影响。

针对这种
情况,制备的DNA采用PCR、分子克隆等后续实验检验,结果提示并无影响,能满足这些实验的要求,说明回收的DNA片段完整。

明胶海绵回收DNA的浓度大于3S
柱回收浓度,拥有更高得率的DNA回收样品利于后续实验的开展。

若需要回收更
高纯度要求的DNA片段,也可将这一回收溶液进行过柱纯化,以达到试验目的。

DNA片段的回收是分子克隆操作中的一项重要技术,亦有多种从凝胶中回收DNA
的方法[5],目前多采用的试剂盒回收法,所需费用较贵、时间较长,不能达到快速获得DNA纯化样品的要求。

本研究介绍的明胶海绵,原理简单、材料应用广泛易于获得、操作简便,节省实验时间,是一种经济、快捷的方法,该法不需要反复切胶回收,还可避免回收样品之间的交叉污染。

另外,对于进一步提高本方法的回收样品的纯度和得
率将是今后对该法继续改进的重点。

【相关文献】
[1]张亮,赵晓瑜,康现江,等.一种有效回收小分子DNA片段的方法[J].生物技术通报,2007(1):99-104.
[2]王春,陈琳玲,许灿新,等.简便快速的PCR产物回收方法[J].南华大学学报(医学版),2005(1):109-111.
[3]余宏傲,张岚岚,徐昌杰.一种有效纯化低拷贝质粒DNA的改良硅藻土法[J].细胞生物学杂志,2005 (6):679-683.
[4]张靖,应天翼,高川,等.一种新的小分子DNA纯化方法——石英棉纯化法[J].生物工程学
报,2006(3): 504-507.
[5]Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratorymanual[M].2nd,New York:CSH lab press, 1989:6-22.。