酵母系统表达人表皮生长因子研究进展

中国生物工程杂志 China Biotechnology,2021 ,41 (1) ：72-79
DOI ：10. 13523/j. cb. 2009043
酵母系统表达人表皮生长因子研究进展*
*收稿日期:2020-09-27
修回日期=2020-10-27
*国家优秀青年科学基金(21922806)、江苏省“六大人才高峰”计
戈ij(2OI8-SWYY-O47)资助项目
**通讯作者，电子信箱:xiaojunji@ njtech. edu. cn
石鹏程纪晓俊
**(南京工业大学生物与制药工程学院南京211806)
摘要人源表皮生长因子是一种从人体内分离出的蛋白质，具有刺激细胞生长的作用，临床用途 广泛。

但由于天然来源有限，化学合成成本高，利用基因工程技术生产人表皮生长因子具有很好 的前景。

酵母系统作为一种典型的真核表达系统，在生产异源蛋白时能进行翻译后修饰，如糖基 化、形成二硫键等，并能有效地将重组蛋白分泌到细胞外，有益于下游分离提取，在生产重组人表
皮生长因子的研究中备受青睐。

综述了利用酵母系统表达人表皮生长因子的研究进展，包括各种酵 母表达系统在其中的应用，并分别比较其优势和劣势，在此基础上对未来的研究重点进行展望。

关键词人表皮生长因子酿酒酵母巴斯德毕赤酵母解脂耶氏酵母表达策略
中图分类号Q819
近年来，随着生命科学和生物技术的不断进步，生 物制药行业迅速发展。

基于现代生命科学，利用基因
工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等手段，获得的 生物来源的治疗性药物可用于预防、诊断和治疗疾病。

这些治疗性药物包括疫苗、抗体、细胞因子、重组蛋白 等，其在治疗过程中表现出药理活性高、毒副作用小、 靶向性强等优点使其受到到越来越多的关注。

表皮生
长因子(epidermal growth factor, EGF )就是其中一个典
型代表。

EGF 最初由美国Vanderbilt 大学Cohen 等」
在分离小鼠颌下腺神经生长因子时发现。

1975年，
Gregory 等⑵成功从人类尿液中提取出人表皮生长因子 (human epidermal growtli factor, hEGF )，因其具有抑制
胃酸的作用，早期也称其抑胃素。

hEGF 是一种6.2kDa
的多肽，包含53个氨基酸残基⑴，6个半胱氨酸(Cys) 残基之间形成3个稳定二硫键*，整条肽链呈三内环
形结构(图1)并具有生理活性。

在生物体内，EGF 通
过与表皮生长因子受体(epidermal growth factor
receptor, EGFR)特异性结合，激发EGFR 自身酪氨酸激
酶活性，开启一系列下游信号通路，将有丝分裂信号从
细胞外传递到细胞内。

EGF 在刺激细胞生长、增殖和
分化中起重要作用，能促进表皮伤口、烧伤和角膜损伤
的愈合X ,还可以促进神经组织和鼓膜的再生⑴：,对 肝损伤和眼损伤具有修复作用。

hEGF 已经在临床上用于治疗各种急性和慢性伤
口 ，还被化妆品行业用于改善肤质,应用前景十 分广泛，市场需求量大。

但天然来源的hEGF 十分有
限，而且分离步骤繁琐，远不能满足市场需求。

目前， 主要利用各种微生物表达系统来获取高产量、高活性 的hEGF 。

hEGF 已在包括大肠杆菌(Escherichia coli)、 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis )、酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae )和杆状病毒(baculovirus )等多
种宿主系统中表达［，5'l8!o 但在大肠杆菌中hEGF 的产
量不能达到工业生产所需求的水平，多肽趋于形成包
涵体，并被蛋白酶分解，从而生成错误折叠的hEGF 分
子。

对从包涵体释放出的hEGF 进一步加工，会额外增 加生产成本。

与原核系统相比，真核系统产生的hEGF 表现出更高的生理活性，其中酵母表达系统更是展现
出良好的应用前景。

1
酵母系统表达hEGF 的优势
酵母易于基因工程操作、生长快速，能进行翻译后
修饰和有效的分泌蛋白，成为生产重组hEGF 的理想宿 主。

酵母发酵过程可以实现高细胞密度、高蛋白产量，
使得生产过程更加经济，而且不产生热源、病原体或病
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图1人表皮生长因子的一级结构
Fig.1Primary structure of human
epidermal growth factor
毒，保证了合成产物的安全⑴)。

在生产重组医用蛋白时,蛋白的糖基化修饰类型可能会影响其清除率和免疫原性，而酵母的糖基化类似于哺乳动物糖基化的高甘露糖型。

1.1用于表达hEGF的酿酒酵母
酿酒酵母作为第一个完全基因组测序的真核生物，是一种公认安全(GRAS)的工业微生物，因对高渗透压、低pH和多种抑制条件的抵抗能力较强，使其发酵工艺发展非常成熟。

随着生理学、遗传学和基因操作工具的不断发展，人们能够通过对酿酒酵母进行工程改造生产许多化合物［2，'22］o另外,30%与人类遗传和退行性疾病有关的蛋白在酿酒酵母中有直系同源物⑺如，这为利用酿酒酵母生产重要治疗性蛋白奠定了基础。

迄今为止，由美国食品药品监督管理局批准上市的微生物真核细胞重组药物(人血清蛋白、人转铁蛋白、胰岛素前体、胰高血糖素等)主要由酿酒酵母生产［25'271o但是,作为应用最为广泛的酵母表达系统，酿酒酵母在表达重组蛋白时仍然存在一些局限性，例如质粒不稳定、蛋白产量低、高糖基化、内质网错误折叠以及蛋白运输效率低下。

为了解决上述问题，针对酵母系统表达重组蛋白的一个重要研究方向就是替代酵母表达系统的开发。

例如，针对hEGF的表达，目前采用的真核宿主除了酿酒酵母外，还包括非常规酵母：甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、产油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)o
1.2用于表达hEGF的非常规酵母
非常规酵母巴斯德毕赤酵母能以甲醇作为唯一碳源［如，在组成型强启动子醇氧化酶1启动子(PA0X1)的控制下生产重组蛋白⑺)。

目前巴斯德毕赤酵母系统已成为最流行的生产重组蛋白的酵母系统，其内源蛋白的分泌水平较低，且能将重组蛋白分泌到相对纯净的细胞外培养基中。

在糖基化方面，与酿酒酵母中长达50~200个残基的甘露糖主链相比，巴斯德毕赤酵母添加到异源蛋白中的甘露糖链为8~14个残基,这不会导致重组表达的医用蛋白过度高糖基化，并且不含有潜在的具有免疫原性的末端«-1,3-连接的甘露糖。

因此,开发具有人源糖基化的巴斯德毕赤酵母菌株，并将其应用于重组蛋白的生产，为在酵母表达系统中实现均质糖基化提供了一种策略⑴却。

同为甲基营养型的多形汉逊酵母也具备高蛋白分泌能力和相对酿酒酵母较低的糖基化活性“辽,其最佳生长温度可达50T,适用于热稳定蛋白生产和哺乳动物蛋白合成U9'37］o此外，该酵母的过氧化物酶体膜过剩，可利用合适的信号肽引导产生异源膜蛋白将其储存在过氧化物酶体膜内"昭。

虽然上述甲基营养学酵母系统在表达异源蛋白领域有诸多优点，但是其在表达过程中使用的甲醇属于剧毒易燃物，在大规模生产中存在安全隐患，限制了该表达系统在食品业和制药业的应用。

解脂耶氏酵母是一种产油酵母，具有较高的蛋白水解活性,天然分泌大量胞外蛋白酶,其工业用途最初是生产单细胞蛋白作为饲料供应。

作为一种非常规酵母，解脂耶氏酵母被美国FDA(Food and Drug Administration)认定为公认安全(generally recognized as safe,GRAS)微生物，适用于食品和药品的生产。

将解脂耶氏酵母作为重组蛋白的生产宿主是基于法国国家农业科学研究院(INRA)和美国辉瑞(PAnzer)公司建立的转化方法的基础上开始的139401o作为蛋白表达的宿主系统，解脂耶氏酵母的优势包括：能实现高分子量蛋白的高分泌水平、对所表达的蛋白进行低糖基化修饰、能通过共翻译易位途径分泌外源蛋白且能实现高密度发酵。

与甲基营养型酵母表达系统相比，解脂耶氏酵母在使用过程中不需要甲醇，发酵过程更加便利。

和巴斯德毕赤酵母相似，对解脂耶氏酵母的糖基化修饰系统进行基因工程改造，同样能有效地降低重组蛋白的糖基化水平。

De Pourcq等刖重新构建解脂耶氏酵母的N-糖基化途径,将解脂耶氏酵母生产的异源蛋白，由原先的异质聚糖修饰更改为均质的人型末端甘露糖基化。

该团队的另一个工作是解脂耶氏酵母产生均质的Man,GlcNAc2残基⑷［，即所有哺乳动物N-聚糖结构共有的核心，获得的工程解脂耶氏酵母表达系统，能够
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生产携带与治疗应用兼容的人源化N-连接寡糖的重组蛋白。

不同酵母表达系统各有优势，在没有开发出能最优地生产所有重组蛋白的系统之前,hEGF的酵母表达研究始于宿主菌株的选择,继而确定最适的载体、选择标记、启动子和分泌信号等影响因素，从而设计出最佳的宿主■•载体组合。

2酵母系统表达hEGF的策略
2.1hEGF在酿酒酵母中的表达
hEGF在酵母中的表达最早是由Urdea等问于1983年在酿酒酵母中完成的，他们将人工合成的hEGF 基因与酿酒酵母GAPDH启动子、ADH-1终止子连接，重组质粒表达后能使酿酒酵母生产具有活性的hEGF,虽然最终表达水平偏低，但这一实验证明了使用酵母系统表达hEGF的可行性。

为了使hEGF在酿酒酵母中的表达更加高效，Brake等〔⑷在此基础上，在合成的"EGF基因上游插入了酿酒酵母来源的a因子前导肽，并改变序列中的残基以提高分泌量，构建的融合表达质粒在酿酒酵母中表达后，能将超过90%成熟的hEGF 分泌到培养基中,a因子的使用对蛋白在酿酒酵母中的生产具有重要意义,能显著提高重组蛋白的生产效率。

George-Nascimento等期对使用该策略得到的hEGF进行分离后发现，产物包含有四种具有促有丝分裂活性的hEGF,区别表现在尾端蛋白的差异上，第53位的精氨酸和第52位的亮氨酸容易丢失，这种丢失不会影响蛋白活性，但增加了蛋白在纯化过程中的难度。

黄秉仁等“］基于此现象在合成表达hEGF时只合成编码前51个氨基酸的基因，利用a因子的启动子和前导肽基因连接人工合成的hEGF基因，将所构建的表达质粒转化酿酒酵母宿主诱导表达，也成功表达出具有完好生物活性的hEGF,产量达到了4mg/L o
信号肽的使用对hEGF在酿酒酵母中的表达很重要，尽管a分泌信号肽对酿酒酵母分泌异源蛋白的指导效果堪称优异，Clements等⑷〕仍希望在这方面寻求突破，他们测试了不同的信号序列对酿酒酵母分泌hEGF的指导能力（表1），并对信号序列进行设计和优化,使产量提升了5倍。

具有真核分泌信号肽序列三个基本特征（一个基本的N末端区域，一个中央疏水区域和一个极性更大的C末端区域）的共有序列不足以有效指导hEGF的分泌，需要添加终止KEX2蛋白酶切割位点的合成序列，且不同的序列对分泌效率影响较大。

Clements的实验中Asn连接的糖基化位点存在与否对分泌没有影响，该结果与Caplan等的结果相悖。

Caplan 指出Asn连接的糖基化对于a因子的分泌很重要, Clements认为这一矛盾的现象与异源蛋白的表达水平有关,高水平表达可能掩盖了糖基化对分泌的影响。

表1合成信号序列的分泌效率
Table1The secretion efficiency of synthetic
signal sequences［47J
信号序列hEGF产量（mg/L）
a-factor prepro 3.17
共有序列0.59
共有序列（转化酶突变）0.52共有序列+6aa（KEX2蛋白酶切割位点）0.57
转化酶突变+6aa（KEX2蛋白酶切割位点）0.54
共有序列+19aa（无Asn连接糖基化位点） 3.39
共有序列+19aa（有Asn连接糖基化位点） 3.53
当前,人们对hEGF需求的增长导致研究重点集中在提高其表达水平上。

Coppella等阙最早对hEGF在酿酒酵母中的表达动力学进行了研究，发现hEGF在酿酒酵母中的生产对培养基的依赖程度很高，并通过选择合适的培养基提升了蛋白产量，同时改善了hEGF在细胞生长过程中降解的情况，最终使hEGF在酿酒酵母中的产量相比原方法提高了7倍。

Valdes等通过对生理变量、培养基和生物反应器操作模式等方面的研究,更加全面提高hEGF发酵过程的生产强度，将hEGF在高细胞密度发酵下的生产率提高到4.82mg/（L•h）,最终的发酵规模放大到300L。

hEGF在酿酒酵母中的表达与生产已经取得可观的成果，但酿酒酵母系统的分泌信号肽单一，以及对蛋白翻译后修饰的过度糖基化仍然制约着使用其进行医用蛋白的生产。

因此，不断寻找合适的替代宿主是生产重组人表皮生长因子早期的主要研究方向。

2.2hEGF在巴斯德毕赤酵母中的表达
随着a因子启动子在表达hEGF的酿酒酵母体系中使用逐渐成熟，黄秉仁等［恥首次报道使用甲基营养型酵母-巴斯德毕赤酵母表达人工合成的hEGF基因。

在醇氧化酶启动子（PAOX1）作用下，由a因子前导肽引导蛋白分泌，能够获得氨基酸顺序正确、生物活性良好的hEGF,最终产量达100mg/L,为在非酿酒酵母中重组表达hEGF展示了良好的前景。

研究者对使用该方法生产的hEGF是否符合国家I类新药人表皮生长因
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子原料药标准作出了初步判断:切，毕赤酵母生产的重组hEGF纯化后的蛋白纯度可达98%,无热源、内毒素和甲基营养型酵母染色体DNA污染，有正确的分子量、等电点、氨基末端氨基酸序列、肽图、紫外光谱以及生物活性，符合新生物制品审批、动物实验和临床试验要求，为重组hEGF的应用提供了保证。

除使用合成的hEGF编码基因外，也可从肾脏和肝脏活检标本中分离出hEGF基因®1,但从活检分离出来需要通过复杂的临床技术进行操作。

Khan等〔刃证实了人类肝癌细胞系（Huh-7）是一种易于分离的hEGF 来源，分离出来的mRNA与野生型hEGF有100%序列同源性，并能在巴斯德毕赤酵母中表现出良好的表达效果。

Khan等网基于此首次表征了毕赤酵母生产的重组hEGF的糖基化和非糖基化分子特征、分布、生物活性和相对百分比,发现约84%的胞外蛋白被糖基化，虽然糖基化和非糖基化部分均具有生物活性，但非糖基化的hEGF的生物活性高于糖基化的hEGF。

Eissazadeh等⑧对毕赤酵母系统表达hEGF的培养条件进行了优化。

将hEGF的编码基因克隆到配备特异性信号肽和甲醇诱导型启动子（PAOX1）的PPIC9K载体后在毕赤酵母GS115中表达，能将产出的hEGF分泌到细胞外。

在生产过程中，培养基、pH、温度和甲醇浓度都会对hEGF产量造成显著影响，其中甲醇浓度的影响尤为明显，高甲醇浓度能提高hEGF的表达水平，但同时会对酵母细胞产生毒性。

随着重组hEGF在毕赤酵母中的表达研究逐渐成熟，利用酵母表达系统表达重组hEGF的应用也在逐步开展。

熊振宇等将毕赤酵母X33表达的hEGF进行纯化后，利用微模板浇铸法制得以透明质酸钠为基质的hEGF可溶性微针贴片，能够穿透猪皮达到给药目的，并在大鼠模型中作用良好。

2.3hEGF在其它酵母中的表达
对比众多应用于重组hEGF表达的宿主，毕赤酵母的表现是目前最令人满意的。

在研究过程中，多形汉逊酵母和解脂耶氏酵母也被作为宿主系统表达hEGF （表2）。

多形汉逊酵母是除巴斯德毕赤酵母外另一种常用的异源蛋白表达的甲基营养型酵母。

Heo等皿）报道了hEGF在多形汉逊酵母中的分泌表达和纯化，并通过敲除编码竣肽酶ysca的KEX1基因，抑制hEGF的C-端丢失。

研究发现,采用多形汉逊酵母生产hEGF时，细胞生长和蛋白产量表现出强烈的pH依赖性:"，这是因为由宿主细胞分泌的蛋白酶在酸性环境中活性更高，可作用于hEGF的降解，同时低pH 值也能使hEGF的溶点达到等电点（pl=4.6）。

通过对hEGF在发酵过程中降解动力学的研究，能为产量的提高提供有效的指导。

解脂耶氏酵母能分泌某些其他酵母不能表达的蛋白质，如人凝血因子XHIa1601o来自解脂耶氏酵母的碱性胞外蛋白酶（AEP）基因XPR2的分泌信号肽已经成功用于指导牛促胰凝乳蛋白酶、猪干扰素和乙型肝炎病毒表面抗原这类复杂的哺乳动物蛋白的分泌和生产〔砂。

Hamsa等通过该酵母生产具有生理活性的hEGF,但使用的AEP缺陷型菌株仍然会产生碱性蛋白酶之外的其他胞外蛋白酶，导致产物收率较低。

研究者进一步基于此低表达水平开发了一种新的灵敏生物测定法来测定低产量的hEGF的生物学活性。

hEGF在解脂耶氏酵母系统中表达的第一次尝试受限于胞外蛋白酶的降解作用。

随着解脂耶氏酵母基因工程技术的逐渐成熟，已开发的Pold系菌株已成为目前外源蛋白生产中最常用的表达宿主之一W在Pold的基础上衍生的Polf.Polg.Polh菌株进一步敲除了自身来源的蛋白酶，避免了其对表达的外源蛋白的降解作用。

同时，该菌系能够利用廉价的蔗糖和糖蜜作为碳源，适合工业化大规模生产。

因此利用解脂耶氏酵母系统表达hEGF在工业上具有很高的可行性。

3展望
随着人表皮生长因子在医疗、化妆品行业的应用，其有限的天然来源已经不能满足需求，从而利用基因工程技术对其进行重组表达的研究受到了越来越多的关注。

迄今为止，利用酵母表达系统生产hEGF已经得到研究者们和市场的普遍认可。

当前，对提高重组hEGF产量的方法主要集中在寻找合适的酵母细胞、基因在转录和翻译水平上的调控以及对发酵过程的优化。

生产重组蛋白需要在各酵母表达系统之间进行详尽的比较，因为目前还没有一个理想的宿主细胞能够适用于所有蛋白的表达。

一方面，分析每种酵母表达系统的固有优势和局限性以及hEGF应用需求之间的关系非常重要；另一方面，对基因组、转录组、蛋白质组和分泌组数据的使用，能进一步促进酵母表达系统在hEGF生产中的应用。

目前，有关hEGF表达的研究主要集中在酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母中，但由于酿
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表2人表皮生长因子在酵母系统中的表达
Table2Expression of human epidermal growth factor in yeast
宿主系统方法载体效果hEGF产量
(mg/mL)
参考
Saccharomyces构建了一个包含酵母gapdh启pYEGF-2在胞内表达出有活性的EGF30.0UMea⑷】cerevisiae动子、合成hEGF基因和酵母
ADH-1终止子的质粒
在hEGF基因的上游插入了酿pYaEGF-23能将超过90%成熟的hEGF分 4.0Brake〔44
酒酵母来源的a因子前序泌到培养基中
设计不同的前导序列pSW6提高了酿酒酵母中hEGF的分泌 3.2Clements⑷
研究了hEGF的表达动力学pYaEGF-25筛选合适的培养基13.0Coppella49
对生理变量，培养基和生物反应
器操作模式进行了综合研究
-提高hEGF发酵过程的生产率259.2Valdes[50]
Pichia pastoris人工合成表皮生长因子在甲基
营养型酵母中的表达Pucl9-KaEGF51及
pAO815-EGF51
分泌完好生物活性和正确物理
性质的hEGF
100
黄秉仁"U
优化毕赤酵母表达hEGF时的pPIC9K分析培养基、甲醇浓度、pH和温 2.27Eissazadeh^56
培养条件度对生产的影响
在毕赤酵母X33中表达hEGF
并纯化
pPICZa A成功诱导蛋白分泌并纯化 5.8高云鹏
Hansenula在多形汉逊酵母中表达hEGF PMOX-EGF敲除KEX1基因能减少hEGF的 2.5
Heo®〕polymorpha基因C端水解
构建动力学模型,研究细胞生长PMOX在分批补料培养的诱导期中切80.0Moon㈤】
和hECF生产的pH依赖性换pll值可提高产量
Yarrowia hEGF基因与碱性胞外蛋白酶的pXEGFl细胞分泌酸性蛋白酶使产量0.1Hamsa'62 lipolytica前导肽和pro I融合表达降低
酒酵母表达异源蛋白时的高度糖基化和毕赤酵母需要甲醇诱导表达，如何构建高活性、安全的hEGF表达系统是亟待解决的问题。

解脂耶氏酵母作为具有GRAS 地位的安全菌株，糖基化水平低,可采用营养缺陷标记的筛选方式，能避免抗生素使用的潜在风险，非常适用于治疗性重组蛋白的生产。

因此构建表达hEGF的重组解脂氏酵母，不仅有利于确保重组hEGF的安全有效，提高hEGF的产量，同时也将不断推动解脂耶氏酵母表达系统在生物制药领域的应用。

参考文献
[1]Cohen S.Purification of a nerve-growth promoting protein from the
mouse salivary gland and its neuro-cytotoxic antiserum.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1960,46(3):302-311.
[2]Gregory H.Isolation and structure of urogastrone and its
relationship to epidermal growth factor.Nature,1975,257 (5524):325-327.
[3]Bell G I,Fong N M,Stempien M M,et al.Human epidermal
growth factor precursor:cDNA sequence,expression in vitro and
gene organization.Nucleic Acids Research,1986,14(21)；
8427-8446.
[4]曾喋，邵晓霞，夏其昌.人表皮生长因子肽谱及一级结构的
质谱法分析.生物化学与生物物理学报(英文),1999,31
(1):31-36.
Zeng R,Shao X X,Xia Q C.Peptide mapping and primary structure analysis of hEGF by mass spectrometry.Acta Biochimica et Biophysica Sinica,1999,31(1)：31-36.
[5]Arturson G.Epidermal growth factor in the healing of comeal
wounds,epidermal wounds and partial-thickness scalds:a controlled animal study.Scandinavian Journal of Plastic and Reconstructive Surgery and Hand Surgery,1984,18(1)：33-37.
[6]Jahovic N,Guzel E,Arbak S,et al.The healing-promoting effect
of saliva on skin burn is mediated by epidermal growth factor (EGF):role of the neutrophils.Bums,2004,30(6)：531-538.
[7]Peng H,Wen T C,Tanaka J,et al.Epidermal growth factor
protects neuronal cells in vivo and in vitro against transient forebrain ischemia-and free radical-induced injuries.Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism,1998,18(4):349-360. [8]Chauvin K,Bratton C,Parkins C.Healing large tympanic
2021,41(1)石鹏程等:酵母系统表达人表皮生长因子研究进展77
membrane perforations using hyaluronic acid,basic fibroblast growth factor,and epidermal growth factor.Otolaryngology-Head and Neck Surgery,1999,121(1)：4347.
[9]Inoue M,Katakami C.The effect of hyaluronic acid on comeal
epithelial cell proliferation.Investigative Ophthalmology&Visual Science,1993,34(7):2313-2315.
[10]Berlanga J,Caballero M E,Ramirez D,et al.Epidermal growth
factor protects against carbon tetrachloride-induced hepatic injury.
Clinical Science,1998,94(3):219-223.
[11]Jones D E,Tranpatterson R,Cui D,et al.Epidermal growth
factor secreted from the salivary gland is necessary for liver regeneration.American Journal of Physiology-gastrointestinal and Liver Physiology,1995,268(5):G872-G878.
[12]Wong W K R,Ng K L,Lam C C,et al.Review article:reasons
for underrating the potential of human epidermal growth factor in medical applications.Journal of Analytical&Pharmaceutical Research,2017,4(2)：00101.
[13]Schouest J M,Luu T K,Moy R L.Improved texture and
appearance of human facial skin after daily topical application of barley produced,synthetic,human-like epidermal growth factor (EGF)serum.Journal of Drugs in Dermatology,2012,11(5): 613-620.
[14J Aldag C,Teixeira D N,Leventhal P S.Skin rejuvenation using cosmetic products containing growth factors,cytokines,and matrikines:a review of the literature.Clinical,Cosmetic and Investigational Dermatology,2016,9：411-419.
[15]Ptitsyn L R,Altman I B.Extracellular production of recombinant
human epidermal growth factor(hEGF)in Escherichia coli cells.
Bioorganicheskaia Khimiia,1999,25(12):923-929.
[16]Lam K,Chow K C,Wong W K.Construction of an efficient
Bacillus subtilis system for extracellular production of heterologous proteins.Journal of Biotechnology,1998,63(3)：167-177. [17]Topczewska J M,Bolewska K.Cloning and expression of the
hEGF gene in Saccharomyces cerevisiae.Acta Biochimica Polonica,1993,40(1)：4-7.
[18]Yu W,Chen J,Zhao X L,et al.Expression of polyhedrin-hEGF
fusion protein in cultured cells and larvae of Bombyx mori.
African Journal of Biotechnology,2006,5(11):1034-1040. [19]Gellissen G,Kunze G,Gaillardin C,et al.New yeast expression
platforms based on methylotrophic Hansenula polymorpha and Pichia pastoris and on dimorphic Arxula adeninivorans and Yarrowia lipolytica-A comparison.Fems Yeast Research,2005, 5(11)：1079-1096.
[20]Goffeau A,Barrell B,Bussey H,et al.Life with6000genes.
Science,1996,274(5287):546-567.
[21]Shen M W,Fang F,Sandmeyer S,et al.Development and
characterization of a vector set with regulated promoters for
systematic metabolic engineering in Saccharomyces cerevisiae.
Yeast,2012,29(12):495-503.
[22]Siddiqui M S,Thodey K,Trenchard I,et al.Advancing
secondary metabolite biosynthesis in yeast with synthetic biology tools.FEMS Yeast Research,2012,12(2):144-170.
[23]Galao R P,Scheller N,Alvesrodrigues I,et al.Saccharomyces
cerevisiae:a versatile eukaryotic system in virology.Microbial Cell Factories,2007,6(1)：32-32.
[24]Petranovic D,Nielsen J.Can yeast systems biology contribute to
the understanding of human disease.Trends in Biotechnology, 2008,26(11)：584-590.
[25]Celik E,Calik P.Production of recombinant proteins by yeast
cells.Biotechnology Advances,2012,30(5)：1108-1118. [26]Huang C,Lowe A J,Batt C A.Recombinant
immunotherapeutics:current state and perspectives regarding the feasibility and market.Applied Microbiology and Biotechnology, 2010,87(2):401410.
[27]Kim H,Yoo S J,Kang H A.Yeast synthetic biology for the
production of recombinant therapeutic proteins.FEMS Yeast Research,2014,15(1)：1-16.
[28]Ogata K,Nishikawa H,Ohsugi M.A yeast capable of utilizing
methanol.Agricultural and Biological Chemistry,1969,33(10): 1519-1520.
[29]Cregg J M,Barringer K J,Hessler A Y,et al.Pichia pastoris as
a host system for transformations.Molecular and Cellular Biology,
1985,5(12):3376-3385.
[30]Grinna L S,Tschopp J F.Size distribution and general structural
features of N-linked oligosaccharides from the methylotrophic yeast,Pichia pastoris.Yeast,1989,5(2)：107-115.
[31]Choi B,Bobrowicz P,Davidson R C,et e of combinatorial
genetic libraries to humanize N-linked glycosylation in the yeast Pichia pastoris.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(9):5022-5027. [32]Hamilton S R,Bobrowicz P,Bobrowicz B,et al.Production of
complex human glycoproteins in yeast.Science,2003,301
(5637):1244-1246.
[33]Vervecken W,Kaigorodov V,Callewaert N,et al.In vivo
synthesis of mammalian-like,hybrid-type N-glycans in Pichia pastoris.Applied and Environmental Microbiology,2004,70
(5)：2639-2646.
[34]Van Dijk R,Faber K N,Kiel J A,et al.The methylotrophic
yeast Hansenula polymorpha:a versatile cell factory.Enzyme and Microbial Technology,2000,26(9-10):793-800.
[35]Gellissen G,Hollenberg C P.Application of yeasts in gene
expression studies:a comparison of Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha and Kluyveromyces lactis:a review.Gene, 1997,190(1)：87-97.
78中国生物工程杂志China Biotechnology Vol.41No.12021
[36]Gellissen G.Heterologous protein production in methylotrophic
yeasts.Applied Microbiology and Biotechnology,2000,54(6): 741-750.
[37]Veenhuis M,Kram A M,Kunau W H,et al.Excessive
membrane development following exposure of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha to oleic acid-containing media.
Yeast,1990,6(6):511-519.
[38]Baerends R J,Faber K N,Kram A M,et al.A stretch of
positively charged amino acids at the N terminus of Hansenula polymorpha Pex3p is involved in incorporation of the protein into the peroxisomal membrane.Journal of Biological Chemistry, 2000,275(14)：9986-9995.
[39]Pfizer Inc.Process for transformation of Yarrowia lipolytica:
US4880741.1989-11-14[2020-9-24].http：//njtech,patsev.
com/s earch/p atentDetail.
[40]Institute National de la Recherche Agronomique.Transformation
vector for yeast Yarrowia lipolytica,transformation process and transformed yeast：EP0166659A2.1986-1-2[2020-9-24].
http：///search/patentDetail.
[41]De Pourcq K,Vervecken W,Dewerte I,et al.Engineering the
yeast Yarrowia lipolytica for the production of therapeutic proteins homogeneously glycosylated with Man8GlcNAc2and Man5GlcNAc2-Microbial Cell Factories,2012 ,11(1)：53-65.
[42]De Pourcq K,Tiels P,Van Hecke A,et al.Engineering
Yarrowia lipolytica to produce glycoproteins homogeneously modified with the universal Man3GlcNAc2N-glycan core.PLoS One,2012,7(6):e39976.
[43]Urdea M S,Merryweather J P,Mullenbach G T,et al.Chemical
synthesis of a gene for human epidermal growth factor urogastrone and its expression in yeast.Proceedings of the National Academy of Sciences,1983,80(24)：7461-7465.
[44]Brake A J,Merryweather J P,Coit D G,et al.Alpha-factor-
directed synthesis and secretion of mature foreign proteins in Saccharomyces cerevisiae.Proceedings of the National Academy of Sciences,1984,81(15)；4642^646.
[45]George-Nascimento C,Gyenes A,Halloran S M,et al.
Characterization of recombinant human epidermal growth factor produced in yeast.Biochemistry,1988,27(2):797-802. [46]黄秉仁，张岱，迟来顺，等•人表皮生长因子基因在酵母系统中
的表达.中国医学科学院学报,1989,(5):331-337.
Huang B R,Zhang D,Chi L S,et al.Human epidermal growth factor gene is expressed in Saccharomyces cerevosoae.Acta Academiae Medicinae Sinicae,1989(5):331-337.
[47]Clements J M,Catlin G,Price M J,et al.Secretion of human
epidermal growth factor from Saccharomyces cerevisiae using synthetic leader sequences.Gene,1991,106(2)：267-271. [48]Caplan S,Green R,Rocco J W,et al.Glycosylation and
structure of the yeast MF alpha1alpha-factor precursor is important for efficient transport through the secretory pathway.
Journal of Bacteriology,1991,173(2)：627-635.
[49]Coppella S J,Dhuijati P.A mathematical description of
recombinant yeast.Biotechnology and Bioengineering,1990,35
(4):356-374.
[50]Valdes J,Mantilla E,Marquez G,et al.Physiological study in
Saccharomyces cerevisiae for overproduction of a homogeneous human epidermal growth factor molecule.Biotecnologia Aplicada, 2009,26(2):166-167.
[51]黄秉仁，蔡良琬,廖洪涛，等•人工合成表皮生长因子基因在甲
基营养型酵母中的高效表达.中国生物化学与分子生物学报,1998(5)：46-51.
Huang B R,Cai L W,Liao H T,et al.High level expression of chemically synthesized human epidermal growth factor gene in the yeast Pichia pastoris.Chinese Journal of Biochemistry Molecular Biology,1998(5)：46-51.
[52]黄秉仁，蔡良婉，王欣，等.甲基营养型酵母系统表达的重组
人表皮生长因子的纯化及其性质.中国医学科学院学报，2001,23(2)：106-110.
Huang B R,Cai L W,Wang X,et al.Purification of recombinant hEGF expressed in yeast Pichia pastoris and the study on its characters.Acta Academiae Medicinae Sinicae,2001,23
(2)：106-110.
[53]Mullhaupt B,Feren A,Fodor E J,et al.Liver expression of
epidermal growth factor RNA.Rapid increases in immediate-early phase of liver regeneration.Journal of Biological Chemistry, 1994,269(31)：19667-19670.
[54]Khan M,Khan F,Ahmad N,et al.Expression line approach to
recombinant human epidermal growth factor into the yeast,Pichia pastoris from Huh-7cell line.Molecular Biology Reports,2014, 41(3):1445-1451.
[55]Khan M,Ahmed N,Khan M I,et al.Bioactivity studies of Huh-
7cells derived human epidermal growth factor expressed in Pichia pastoris.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2017,81
(6):1114-1119.
[56]Eissazadeh S,Moeini H,Dezfouli M G,et al.Production of
recombinant human epidermal growth factor in Pichia pastoris.
Brazilian Journal of Microbiology,2017,48(2):286-293. [57]熊振宇，李晓瑾，李志鹏.重组人表皮生长因子在毕赤酵母
中的表达与纯化及其复合可溶性微针的制备.生物技术通讯，2019(4)：516-522.
Xiong Z Y,Li X J,Li Z P.Expression and purification of recombinant human epidermal growth factor in Pichia pastoris and preparation of composite soluble microacupuncture.Letters in Biotechnology,2019(4)：516-522.
[58]Heo J,Won H S,Kang H A,et al.Purification of recombinant。