大鼠肾脏在体持续灌注模型的建立

第７卷　第３期２０１６年５月器官移植
ＯｒｇａｎＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＶｏｌ ７　Ｎｏ ３
Ｍａｙ ２０１６
·实验研究·
ＤＯＩ：１０ ３９６９／ｊ ｉｓｓｎ １６７４ ７４４５ ２０１６ ０３ ００４
基金项目：兰州大学第二医院引进人才科研专项基金（ｙｎｙｊｒｃｋｙｚｘ２０１５ ３ ０４）作者单位：７３００３０　兰州大学泌尿外科研究所兰州大学第二医院泌尿外科甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心甘肃省泌尿系统疾病研究重点实验室
通讯作者：杨立，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｚｅ２５０＠１６３ ｃｏｍ
大鼠肾脏在体持续灌注模型的建立
张?　王诚　杨俊　罗游　熊虎　付生军　马宝良　杨立
【摘要】　目的　建立大鼠肾脏在体持续灌注模型，为移植肾持续灌注保存的基础研究提供简便可靠的动物模型。

方法　雌性大鼠３０只，根据灌注入口不同随机分为３组：右肾动脉入口组（无需显微缝合）、腹主动脉入口组（需要在显微镜下行腹主动脉穿刺口的缝合）、左肾动脉入口双肾对照组（需要显微缝合左肾动脉开口，在不影响全身循环的情况下实现自身左右肾脏不同保存方法的对照）各１０只，均以卵巢静脉作为灌注液的流出道。

分别计算３组的灌注成功率与肾脏持续灌注２ｈ再灌注成功率。

结果　右肾动脉入口组灌注成功率为８０％，再灌注成功率１００％；腹主动脉入口组灌注成功率为１００％，再灌注成功率为８０％；左肾动脉入口双肾对照组灌注成功率为８
０％，再灌注成功率为５０％。

结论　３种简便大鼠肾脏在体持续灌注模型均建立成功，对于显微外科初学者，无需显微缝合的右肾动脉入口方法最为简便可靠，次要选择腹主动脉入口组；具有扎实显微外科基础的术者，左肾动脉入口双肾对照组可实现右侧肾脏静态低温保存与左侧肾脏持续灌注保存的自身对照，不失为较好的选择。

【关键词】　肾移植；动物模型；在体持续灌注；静态低温保存
【中图分类号】Ｒ６１７，Ｒ ３３２　【文献标志码】Ａ　【文章编号】１６７４ ７４４５（２０１６）０３ ０００４ ０５
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｒａｔｍｏｄｅｌｓｗｉｔｈｉｎｓｉｔｕｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｐｅｒｆｕｓｉｏｎｏｆｋｉｄｎｅｙ　ＺｈａｎｇＳｕ，ＷａｎｇＣｈｅｎｇ，ＹａｎｇＪｕｎ，Ｌｕｏ
Ｙｏｕ
，ＸｉｏｎｇＨｕ，ＦｕＳｈｅｎｇｊｕｎ，ＭａＢａｏｌｉａｎｇ，ＹａｎｇＬｉ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＵｒｏｌｏｇｙｏｆＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＵｒｏｌｏｇｙ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＧａｎｓｕＮｅｐｈｒｏ ＵｒｏｌｏｇｉｃａｌＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＵｒｏｌｏｇｉｃａｌＤｉｓｅａｓｅｏｆＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００３０，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ
：ＹａｎｇＬｉ，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｚｅ２５０＠１６３ ｃｏｍ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅａｎａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｒａｔｍｏｄｅｌｓｗｉｔｈｉｎｓｉｔｕｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｒｅｎａｌｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｆｏｒｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｒｅｎａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎａｃｃｅｓｓ，３０ｆｅｍａｌｅｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓ Ｉｎｔｈｅｒｉｇｈｔｒｅｎａｌａｒｔｅｒｙａｃｃｅｓｓｇｒｏｕｐ（ｎ＝１０），ｗｏｕｎｄｓｕｔｕｒｅｕｎｄｅｒｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｗａｓｎｏｔｒｅｑｕｉｒｅｄ Ｉｎｔｈｅａｂｄｏｍｉｎａｌａｏｒｔａａｃｃｅｓｓｇｒｏｕｐ（ｎ＝１０），ｔｈｅｗｏｕｎｄｏｆａｂｄｏｍｉｎａｌａｏｒｔａｐｕｎｃｔｕｒｅｗａｓｓｕｔｕｒｅｄｕｎｄｅｒｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ｎ＝１０），ｔｈｅｏｐｅｎｉｎｇｏｆｔｈｅｌｅｆｔｒｅｎａｌａｒｔｅｒｙｗａｓｓｕｔｕｒｅｄｕｎｄｅｒｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ａｎｄｂｉｌａｔｅｒａｌｋｉｄｎｅｙｓｗｅｒｅｒｅｓｔｏｒｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｗｉｔｈｏｕｔａｆｆｅｃｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｉｃｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｖａｒｉａｎｖｅｉｎｗａｓｕｔｉｌｉｚｅｄａｓｔｈｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｏｕｔｐｕｔ Ｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｒａｔｅｓｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｋｉｄｎｅｙｐｅｒｆｕｓｉｏｎａｎｄ２ｈｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｗｅｒｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｃｏｍｐａｒｅｄａｍｏｎｇｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓ Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｉｎｔｈｅｒｉｇｈｔｒｅｎａｌａｒｔｅｒｙａｃｃｅｓｓｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｒａｔｅｏｆｐｅｒｆｕｓｉｏｎｗａｓ８０％ａｎｄ１００％ｆｏｒ２ｈｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｔｈｅａｂｄｏｍｉｎａｌａｏｒｔａａｃｃｅｓｓｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｓｕｃｃｅｓｓｒａｔｅａｃｈｉｅｖｅｄ１００％ａｎｄ８０％ｆｏｒ２ｈｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｒａｔｅｏｆｐｅｒｆｕｓｉｏｎｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄａｓ８０％ａｎｄ５０％ｆｏｒ２ｈｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｔｈｒｅｅｔｙｐｅｓｏｆｒａｔｍｏｄｅｌｓｗｉｔｈｉｎｓｉｔｕｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｋｉｄｎｅｙｐｅｒｆｕｓｉｏｎａｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ Ｆｏｒｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙｂｅｇｉｎｎｅｒｓ，ｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｏｆｒｉｇｈｔｒｅｎａｌａｒｔｅｒｙａｃｃｅｓｓｉｓｍｏｓｔｓｉｍｐｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙａｂｄｏｍｉｎａｌａｏｒｔａａｃｃｅｓｓａｐｐｒｏａｃｈ Ｆｏｒｔｈｅｓｕｒｇｅｏｎｓｗｉｔｈｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙｓｋｉｌｌｓ，ｓｔａｔｉｃｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｉｇｈｔｋｉｄｎｅｙａｎｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｐｅｒｆｕｓｉｏｎｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌｅｆｔｋｉｄｎｅｙａｒｅｈｉｇｈｌｙｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　Ｒｅｎａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；Ａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌ；Ｉｎｓｉｔｕｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｐｅｒｆｕｓｉｏｎ；Ｓｔａｔｉｃｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
第３期　张?等 大鼠肾脏在体持续灌注模型的建立
移植肾的有效保存是提高肾移植人、肾存活率的重要环节之一。

２０世纪６０年代有学者曾提出持续灌注保存，但由于当时灌注仪器操作复杂，且威斯康星大学保存液（ＵＷ液）的发明，静态低温保存成为临床器官保存的主要方法［１］。

随着供肾日益短缺，加之我国２０１５年全面禁止司法途径来源的器官，公民逝世后器官捐献供肾和边缘供肾的利用不断增多［２ ３］。

此类供肾移植术后并发症较多，对保存技术也提出更高的要求，持续灌注保存的研究亦重新兴起［４］。

建立简便可靠的动物模型是开展基础研究的必要条件，国外大动物模型多采用猪肾、狗肾离体灌注后行自体移植［５ ９］，我国Ｚｈｏｎｇ等［６］以兔腹主动脉穿刺为流入道，腔静脉穿刺为流出道，术后缝合血管开口，实现无需移植的兔肾持续在体灌注后再灌注模型。

本研究旨在建立简便的大鼠肾脏在体持续灌注模型，为后续实验奠定基础。

１　材料与方法
１ １　实验动物和分组
本实验采用成年雌性Ｗｉｓｔａｒ大鼠３０只，体质量为２２０～２４０ｇ，由甘肃中医学院医学实验中心提供。

３０只大鼠随机分为右肾动脉入口组、腹主动脉入口组、左肾动脉入口双肾对照组，每组１０只。

１ ２　手术器械与试剂
手术器械包括显微外科手术器械、冷光手术灯、医用无损伤缝合线等。

试剂包括戊巴比妥钠、肝素钠、乳酸林格液等。

１ ３　手术方法
１ ３ １　右肾动脉入口组　腹腔注射戊巴比妥钠（３０ｍｇ／ｋｇ）麻醉，并皮下注射肝素钠（１０００Ｕ／ｋｇ），以防血栓形成。

行腹部正中切口，常规钝性分离双侧肾动、静脉，并在两侧肾动脉丝线打结，不拉紧备用；钝性分离肠系膜前动脉上端和左肾动脉下端腹主动脉，并留置１ ５ｃｍ的丝线以便提起夹闭；钝性分离左侧肾上腺静脉，结扎并离断；钝性分离卵巢静脉（图１Ａ），靠近卵巢端带线结扎。

无损伤血管夹依次夹闭肠系膜前动脉上端腹主动脉（记录时间为肾脏热缺血的起始时间）、左肾动脉下端腹主动脉和左侧肾静脉。

丝线结扎右肾静脉并离断，右肾动脉剪口但不离断，用自制的钝头头皮针沿开口进入肾动脉，待轻微的落空感后随即出现阻力，证明针头已进入腹主动脉，然后肠管推向右侧暴露左侧肾动、静脉，可看到腹主动脉的针头，针头倾斜向下可到达左肾动脉开口处，棉签向后下轻压左肾给予肾动脉张力，针头即可进入左肾动脉２～３ｍｍ，丝线结扎两侧肾动脉以固定，随后开放腹主动脉上下端血管夹，可看见肠管恢复血供。

随后离断卵巢静脉作为灌注液的流出道，待肾脏达到预定热缺血时间后，左侧腹部开１ｃｍ左右小口，将肾脏以及卵巢静脉拖出体外放于自制冰盒，使用０℃林格液进行灌注，可看到肾脏变白，肾脏残血及灌注液自卵巢静脉缓慢流出（图１Ｂ），后接连续式流体或脉冲式流体进行持续灌注２ｈ。

灌注结束后，去针，结扎右肾动脉及卵巢静脉流出道，取出右肾后关腹。

详见图２Ａ。

１ ３ ２　腹主动脉入口组　麻醉、备皮及开腹依前述，钝性分离左肾动脉下端（留置丝线打结，不拉紧备用）、两肾动脉之间的腹主动脉，左肾动、静脉及卵巢静脉。

无损伤血管夹夹闭左肾动、静脉作为热缺血的开始时间，待达到预定热缺血时间，夹闭左肾动脉下端和两侧肾动脉之间的腹主动脉，放开左肾动脉夹，头皮针穿刺腹主动脉作为灌注流入道，同样离断卵巢静脉作为流出道，持续灌注结束后切除右肾。

相对于右肾动脉入口组模型，其主要区别在于该组模型需要在显微镜下行腹主动脉穿刺口的缝合（需１～２针）。

详见图２Ｂ。

１ ３ ３　左肾动脉入口双肾对照组　麻醉、备皮及开腹依前述，对于各处血管的游离在依照Ａ组的基础上外加游离左右肾静脉上下端的腔静脉及肠系膜前动脉。

可预先夹闭双侧肾动、静脉模拟热缺血，达到预定时间后，夹闭肠系膜前动脉及其上段腹主动脉、左肾动脉下端腹主动脉及双侧肾静脉上下端腔静脉，放开双肾动、静脉夹，靠近卵巢离断左侧卵巢静脉；左侧肾动脉根部留置丝线打结不拉紧，在距根部１ｍｍ处剪口但不离断，进针，拉紧丝线缓慢灌入０℃林格液，灌注液从卵巢静脉出口流出；右侧肾脏变白后去针并夹闭右侧肾动、静脉，右侧腹部开口拖出体外模拟静态低温保存；随后暂时活结结扎左肾动脉根部，夹闭左肾静脉，开放腔静脉、腹主动脉及肠系膜前动脉血管夹，可见肠管血供恢复。

沿左肾动脉进针，丝线结扎固定，随后进行持续灌注，方法同右肾动脉入口组。

详见图２Ｃ、２Ｄ。

１ ４　围手术期处理
术前常规禁食１２ｈ，饮水不限；术后保温，并
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器官移植第７
卷
注：Ａ图为正常卵巢静脉解剖图，箭头所示１为肾静脉，２为卵巢静脉；Ｂ图为持续灌注时变白的肾脏与卵巢静脉，箭头所示２为卵巢静脉
图１　大鼠肾脏持续灌注前和灌注时的对比图
Ｆｉｇｕｒｅ１　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｉｃｔｕｒｅｓｏｆｒａｔ ｓｋｉｄｎｅｙｂｅｆｏｒｅａｎｄｄｕｒｉｎｇｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｐｅｒｆｕｓｉｏ
ｎ
注：Ａ图为右肾动脉入口组，Ｂ图为腹主动脉入口组，Ｃ、Ｄ图为左肾动脉入口双肾对照组
图２　３种不同肾脏持续灌注模型的手术方式示意图
Ｆｉｇｕｒｅ２　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｏｐｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｉｎｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｄｅｌｓｏｆｋｉｄｎｅｙｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｐｅｒｆｕｓｉｏｎ
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第３期　张?等 大鼠肾脏在体持续灌注模型的建立
给予青霉素１０×１０４Ｕ，每日１次，连续３日。

１ ５　观察内容
灌注成功指进针时不穿破右肾动脉、腹主动脉以及不撕断左肾动脉；再灌注成功指肾脏持续灌注２ｈ后肾动脉再通成功，若动脉缝合不佳视为失败。

计算３组的灌注及再灌注成功率，并记录失败原因。

２　结　果
灌注成功率：右肾动脉入口组为８０％（穿破右肾动脉和腹主动脉各１只）；腹主动脉入口组为１００％、左肾动脉入口双肾对照组为８０％（撕断左肾动脉２只）。

再灌注成功率：右肾动脉入口组为１００％，腹主动脉入口组为８０％（腹主动脉缝合失败２只），左肾动脉入口双肾对照组为５０％（左肾动脉缝合失败４只）。

３　讨　论
国内外已有多项研究证实，通过机械灌注进行肾移植肾保存能提高受者的人、肾存活率，降低相关并发症发生率，而其中如何减少移植肾缺血 再灌注损伤的机制仍有待研究［１０ １３］。

目前，持续灌注潜在机制研究所采用的动物模型主要有离体灌注模型和在体灌注模型［５ ６］。

离体灌注模型以离体大动物模型为主，其优点在于可以进行长时间的持续灌注保存，且大动物器官更能模仿人体器官，但需要进行自体移植才能够研究肾脏再灌注损伤，手术操作麻烦且不够经济，不利于基础研究的广泛开展。

在体灌注模型虽无法进行长时间灌注，但其无需自体移植便可模拟器官保存与缺血 再灌注损伤的优点更利于基础研究的开展。

相关动物模型分别对不同灌注液、灌注参数、不同复温方式、缺血 再灌注损伤、远期纤维化等方面进行过探讨［７，１４ １７］。

本研究成功建立的３种简便的大鼠在体肾脏持续灌注模型，模拟临床移植肾不同的保存方式，为开展不同保存方式的供肾再灌注损伤相关基础研究提供了简便、经济的小动物模型。

本研究３个模型的共同创新点之一在于以卵巢静脉作为灌注液的流出道，从而省去以腔静脉或者肾静脉穿刺为流出道后需要缝合血管这一步骤。

实验初期，我们曾尝试选择雄鼠的睾丸静脉剪口作为流出道，但发现雄鼠的生殖静脉较细，且静脉瓣膜的发生率较高；而雌鼠的卵巢静脉明显较粗大，且静脉瓣膜发生率较低，约１０％左右。

右肾动脉入口组模型的创新点在于以右肾动脉为入口，省去了以穿刺腹主动脉或肾动脉为灌注入口模型的后期缝合过程，且整个灌注过程中不影响肾动脉水平以下的肢体循环，整个过程无需显微缝合就可以实现单侧肾脏在体持续灌注后再灌注，避免了血管显微吻合时缝合不确切导致的出血，该组模型容易复制，成功率高，易于今后对缺血 再灌注损伤及远期预后的研究。

腹主动脉入口组模型以腹主动脉穿刺为入口，类似于国内Ｚｈｏｎｇ等［６］的兔肾在体持续灌注模型，唯一不同点在于我们选择了卵巢静脉作为流出道省去了静脉缝合。

虽然该模型的穿刺方法较右肾动脉入口组简便，但灌注结束后仍需要缝合腹主动脉穿刺口，且对下肢循环会造成一定影响。

左肾动脉入口双肾对照组模型以左肾动脉为入口在行右侧肾脏灌注之后，行静态低温保存，随后行左侧肾脏持续灌注，待灌注结束后缝合左肾动脉入口，从而在不影响全身循环的情况下实现自身左右肾脏不同保存方法的对照，减少了不同大鼠之间的个体差异，此为该模型的创新点。

但该模型难点在于需要显微缝合左肾动脉开口，对于显微外科初学者难度较高，这也是本研究该模型成功率较低的主要原因。

术中需要注意：（１）在右肾动脉剪口时不能全部离断，以右肾作为牵引力，动脉后壁作为支撑可快速进针；（２）在灌注针穿过腹主动脉时一定要轻柔，此时针体倾斜向下，并且使左侧肾动脉向下倾斜，灌注针方可顺利进入左肾动脉；（３）持续灌注时，可发现左侧输尿管的伴行静脉是汇入左侧肾静脉的，所以应该提前进行无损伤夹闭输尿管，以免术中慢性失血。

综上所述，我们成功建立了３种简便的大鼠肾脏在体持续灌注模型，对于显微外科初学者，无需显微缝合的右肾动脉入口方法最为简便可靠，次要选择腹主动脉入口组；具有扎实显微外科基础的术者，左肾动脉入口双肾对照组可实现右侧肾脏静态低温保存与左侧肾脏持续灌注后再灌注的自身对照，不失为较好的选择。

本研究建立的小动物模型简便经济，成功率高，有利于移植肾持续灌注保存基础研究的广泛开展。

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（收稿日期：２０１６－０２－０５）
（本文编辑：邬加佳　朱佩玲）
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