一种去除生物医用材料中细菌内毒素的离子缓冲液及应用[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510633315.4
(22)申请日 2015.09.29
A61L 27/22(2006.01)
A61L 27/24(2006.01)
A61L 27/56(2006.01)
A61L 31/04(2006.01)
(71)申请人浙江星月生物科技股份有限公司
地址311121 浙江省杭州市余杭区仓前街道
海曙路9号3幢2楼
(72)发明人马南 赵洪石 徐国伟 张玥
(74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公
司 33201
代理人黄美娟 王晓普
(54)发明名称
一种去除生物医用材料中细菌内毒素的离子
缓冲液及应用
(57)摘要
本发明公开了一种去除生物医用材料中细菌
内毒素的离子缓冲液，所述离子缓冲液中，以Na +、
K +中的一种或两种为阳离子，以Cl -、PO43-、HPO 42-、
H 2PO 4-中的两种以上为阴离子，所述离子缓冲液
的pH 值为7.0～7.5，阴离子的总浓度为0.1～
0.35mol/L。

本发明还提供离子缓冲液的配制方
法。

本发明提供的离子缓冲液可用于去除生物医
用材料中的细菌内毒素。

本发明离子缓冲液配制
方法简单、成本低，处理方法简单，去除细菌内毒
素效果显著，可以达到国内外指标标准，非常适用
于医用生物材料生产行业。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页CN 105251049 A 2016.01.20
C N 105251049
A
1.一种去除生物医用材料中细菌内毒素的离子缓冲液，其特征在于所述离子缓冲液
中，以Na+、K+中的一种或两种为阳离子，以Cl-、PO43-、HPO
42-、H
2
PO
4
-中的两种以上为阴离子，
所述离子缓冲液的pH值为7.0～7.5，阴离子的总浓度为0.1～0.35mol/L。

2.如权利要求1所述的离子缓冲液，其特征在于所述离子缓冲液按以下方法配制得到：分别配制缓冲液A液和B液，A液为可溶性磷酸盐A和氯化物A的混合液，B液为可溶性磷酸类化合物B和氯化物B的混合液；所述氯化物A或B各自独立为氯化钠或氯化钾；A 液或B液中，可溶性磷酸盐A或可溶性磷酸类化合物B的浓度各自独立为0.01M～0.05M，氯化物A或氯化物B的浓度各自独立为0.10M～0.25M；将B液和A液按照体积比为1:4～1:9混合均匀，调节pH值为7.0～7.5，滤膜过滤，制得所述离子缓冲液。

3.如权利要求2所述的离子缓冲液，其特征在于所述A液中，可溶性磷酸盐A为磷酸一氢钠、磷酸三钠、磷酸一氢钾或磷酸三钾中的一种或两种以上的混合。

4.如权利要求2所述的离子缓冲液，其特征在于所述B液中，可溶性磷酸类化合物B为磷酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或两种以上的混合。

5.如权利要求2所述的离子缓冲液，其特征在于所述B液、A液的体积比为1：5～8。

6.如权利要求2所述的离子缓冲液，其特征在于所述滤膜过滤用0.22微米滤膜进行过滤。

7.如权利要求1～6之一所述的离子缓冲液在去除生物医用材料中的细菌内毒素中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述生物医用材料为膜类生物医用材料、医用多孔海绵支架或医用网片类材料。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将含有细菌内毒素的生物医用材料放入离子缓冲液中进行浸泡，浸泡时间为2～5天,每天更换离子缓冲液2～6次，最后用注射用水洗涤生物医用材料2～3次，洗去残留的离子缓冲液，即获得除去细菌内毒素的生物医用材料，于干燥或湿状态下无菌密封保存。

一种去除生物医用材料中细菌内毒素的离子缓冲液及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种去除生物医用材料中细菌内毒素的溶液制备方法及其应用，属于医用生物材料领域。

背景技术
[0002] 细菌内毒素是一种脂多糖和微量蛋白的复合物，来自于格兰阴性菌细胞壁，是革兰氏阴性杆菌生长释放或死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖类物质，是热源的一种。

极微量的内毒素进入动物或人体内都会引起强烈的炎症反应，导致轻微发热，脓毒症，感染性休克，重者死亡的严重后果。

医用生物材料是一类具有特殊性能、特种功能的材料，用于人工器官、外科修复、理疗康复、诊断、治疗疾患等医疗、保健领域，而对人体组织、血液不致产生不良影响的材料。

[0003] 内毒素污染广泛存在，如胶原蛋白作为一种具有良好生物相容性及生物活性的生物高分子物质，其生产工艺和纯化工艺非常复杂，生产过程中容易存在内毒素污染。

FDA 已经采用USP内毒素标准品和限度用于医疗器械提取物，表示单位为EU/ml。

目前的标准(USP27)规定针对直接或者间接接触心血管系统和淋巴系统的产品，限度是0.5EU/ml或者20EU/每个器械。

对于接触脑脊液的器械，限度是0.06EU/mL或者2.15EU/每器械。

对于直接或者间接接触眼内环境的器械，一个更低的内毒素限度可能是合适的。

国家药典对注射品中细菌内毒素指标也有严格的规定：细菌内毒素小于1EU/ml。

美国专利(US 2012/0093686 A1)报导了一种选择高分子量蟹壳来源的壳聚糖基止血材料的方法，避免内毒引起的热原问题。

因此，为了保证生物制品及医疗器械的安全性，使内毒素降至其限度要求内至关重要。

[0004] 目前，在生物制药及医疗器械中，内毒素污染广泛存在，引起内毒素超标的主要原因有两个:1)原材料中本身含有的内毒素成分；2)生物材料处理过程中引入，尤其是处理生物来源的生物材料，因而导致动物实验失败或无法通过质量检验，浪费大量的时间、人力和财力。

常用的去除内毒素的方法有酸碱水解、活性炭吸附、超滤、离子交换色谱法、离子辐射等，但去除效果均不佳，而且主要针对溶液。

加热180℃，2h以上可以完全去除内毒素，但实施起来难度很大，一些不耐高温的生物制品和医疗器械不适用。

不耐高温的固体生物材料，如膜类生物医用材料，多孔海绵支架以及网片类材料还没有很好的去除内毒素的方法。

发明内容
[0005] 本发明针对用于组织修复生物医用材料的内毒素难于除去的问题，发明了一种离子缓冲液，并发明了该离子缓冲液在去除不同结构形态的生物医用材料中内毒素的使用方法，操作简单，实用性强。

[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 一种去除生物医用材料中细菌内毒素的离子缓冲液，所述离子缓冲液中，以Na+、K+
中的一种或两种为阳离子，以Cl-、PO43-、HPO
42-、H
2
PO
4
-中的两种以上为阴离子，所述离子缓
冲液的pH值为7.0～7.5，阴离子的总浓度为0.1～0.35mol/L，优选0.11～0.3mol/L。

[0008] 本发明提供的离子缓冲液可以去除不同结构形态的生物医用材料中的内毒素，例如脱细胞组织基质(例如脱细胞真皮基质，脱细胞羊膜基质，小肠黏膜下层细胞外基质)、胶原、透明质酸、壳聚糖、丝素液中任意一种或两种以上组合而制备的膜类生物医用材料、多孔海绵支架以及网片类材料。

[0009] 本发明还提供所述去除生物医用材料中细菌内毒素的离子缓冲液的配制方法，所述方法为：分别配制缓冲液A液和B液，A液为可溶性磷酸盐A和氯化物A的混合液，B液为可溶性磷酸类化合物B和氯化物B的混合液；所述氯化物A或B各自独立为氯化钠或氯化钾；A液或B液中，可溶性磷酸盐A或可溶性磷酸类化合物B的浓度各自独立为0.01M～0.05M，氯化物A或氯化物B的浓度各自独立为0.10M～0.25M；将B液和A液按照体积比为1:4～1:9混合均匀，调节pH值为7.0～7.5，滤膜过滤，制得所述离子缓冲液。

[0010] 调节pH值一般可用1M NaOH或1M HCl调节pH值。

[0011] 所述A液中，可溶性磷酸盐A优选为磷酸一氢钠、磷酸三钠、磷酸一氢钾或磷酸三钾中的一种或两种以上的混合，更优选为磷酸一氢钠、磷酸三钠、磷酸一氢钾中的一种或两种以上的混合；
[0012] 所述B液中，可溶性磷酸类化合物B优选为磷酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或两种以上的混合，更优选为磷酸或磷酸二氢钠。

[0013] 所述A液中可溶性磷酸盐A的浓度优选0.01～0.03M，氯化物A的浓度优选为0.1～0.15M。

[0014] 所述B液中可溶性磷酸类化合物B的浓度优选0.02～0.03M，氯化物B的浓度优选0.15～0.2M。

[0015] 所述B液、A液的体积比优选1：5～8。

[0016] 所述滤膜过滤一般用0.22微米滤膜进行过滤，用以除菌和杂质。

[0017] 本发明还提供所述去除生物医用材料中细菌内毒素的离子缓冲液在去除生物医用材料中的细菌内毒素中的应用。

[0018] 进一步，所述生物医用材料可以为膜类生物医用材料、医用多孔海绵支架或医用网片类材料。

[0019] 进一步，所述应用的方法为：将含有细菌内毒素的生物医用材料放入离子缓冲液中进行浸泡，浸泡时间为2～5天,每天更换离子缓冲液2～6次，最后用注射用水洗涤生物医用材料2～3次，洗去残留的离子缓冲液，即获得除去细菌内毒素的生物医用材料，于干燥或湿状态下无菌密封保存。

[0020] 所述浸泡时，离子缓冲液的体积一般为生物材料体积的50～500倍。

[0021] 注射用水洗涤时，注射用水的体积一般为生物材料体积的50～500倍。

[0022] 本发明的离子缓冲液可以有效的使膜类生物医用材料及网片类材料(厚度≤1mm)中的细菌内毒素限度降至不大于0.125EU/cm2；可以使多孔海绵支架材料(厚度1-3mm)中的细菌内毒素限度降至不大于0.01EU/mg，且方法操作简单，条件温和，实用性强。

离子缓冲液配制方法简单、成本低，处理方法简单，去除细菌内毒素效果显著，可以达到国内外标准规定，非常适用于医用生物材料生产行业。

具体实施方式
[0023] 以下通过实施例的具体实施方法，对本发明的上述内容作进一步的说明，但保护范围不限于此。

[0024] 实施例1
[0025] 1、试验材料：厚度为0.019cm的医用丝素蛋白网片。

[0026] 规格为11cm×6cm×0.019cm的丝素网片内毒素去除的具体方法如下：[0027] (1)磷酸盐缓冲液(AB液)配制：配制6L A液，其中含有磷酸一氢钠和氯化钠两种物质，浓度分别为0.01M和0.15M；配制2L B液，其中含有磷酸二氢钠和氯化钠两种物质，浓度分别为0.02M和0.15M；将B液和A液按1:5体积比混合均匀，调节AB液pH值至7.5。

[0028] (2)用0.22um滤膜抽滤除菌和杂质。

[0029] (3)将规格11cm×6cm×0.019cm丝素网片浸泡在390ml AB液中，恒温摇床，25℃，30rmp。

[0030] (4)每8个小时换液一次，浸泡三天后，用390ml注射用水洗涤2次，去除残留的AB液，干燥无菌密闭保存。

[0031] 2、检测分析
[0032] 内毒素含量检测方法：鲎试剂法，按照《中华人民共和国药典》2010年版三部附录ⅫE“细菌内毒素检查法(凝胶限度试验)”进行。

[0033] 3、实验结果
[0034] 采用本发明处理前的丝素网片内毒素含量为大于5EU/cm2；采用本发明方法处理一天后，内毒素限度降至不大于2EU/cm2；处理两天后，内毒素限度降至不大于0.5EU/cm2，处理三天后，内毒素限度降至不大于0.125EU/cm2。

[0035] 试验结果表明，本发明方法可以有效去除生物材料样品中的内毒素，去除效果佳。

[0036] 实施例2
[0037] 1、试验材料：厚度为2.5mm的胶原海绵(胶原浓度为15mg/ml)，此胶原海绵经过交联、冷冻干燥制备而成。

[0038] 规格为100mm×100mm×2.5mm的胶原海绵内毒素去除的具体方法如下：[0039] (1)磷酸盐缓冲液(AB液)配制：配制15L A液，其中含有磷酸一氢钾和氯化钠两种物质，浓度分别为0.02M和0.10M；配制3L B液，其中含有磷酸二氢钠和氯化钾两种物质，浓度分别为0.03M和0.15M；将B液和A液按1:6体积比混合均匀，调节AB液pH值至7.2。

[0040] (2)用0.22um滤膜过滤除菌和杂质。

[0041] (3)将规格100mm×100mm×2.5mm胶原海绵浸泡在1250ml AB液中，恒温摇床，25℃，30rmp。

[0042] (4)每6小时换液一次，浸泡三天后，用1250ml注射用水洗涤2次，去除残留的AB 液，冷冻干燥后无菌密闭保存。

[0043] 2、检测分析
[0044] 内毒素含量检测方法：鲎试剂法，按照《中华人民共和国药典》2010年版三部附录ⅫE“细菌内毒素检查法(凝胶限度试验)”进行。

[0045] 3、实验结果
[0046] 采用本发明处理前的胶原海绵支架内毒素含量为大于1.25EU/mg；采用本发明
方法处理一天后，内毒素限度降至不大于0.5EU/mg；处理两天后，内毒素限度降至不大于0.1EU/mg；处理三天后，内毒素限度降至不大于0.01EU/mg。

[0047] 试验结果表明，本发明方法可以有效去除生物材料样品中的内毒素，去除效果佳。

[0048] 实施例3
[0049] 1、试验材料：厚度为30μm～90μm的丝素蛋白膜。

[0050] 规格为6cm×8cm的丝素蛋白膜内毒素去除的具体方法如下：
[0051] (1)磷酸盐缓冲液(AB液)配制：配制1L A液，其中含有磷酸三钠、磷酸一氢钾和氯化钠三种物质，浓度分别为0.015M、0.015M和0.15M；配制0.5L B液，其中含有磷酸和氯化钾两种物质，浓度分别为0.02M和0.20M；将B液和A液按1:8体积比混合均匀，调节AB 液pH值至7.0。

[0052] (2)用0.22um滤膜抽滤除菌和杂质。

[0053] (3)将规格6cm×8cm丝素蛋白膜浸泡在144ml AB液中，恒温摇床，25℃，30rmp。

[0054] (4)每12小时换液一次，浸泡两天后，用144ml注射用水洗涤2次，去除残留的AB 液，湿状态下无菌密闭保存。

[0055] 2、检测分析
[0056] 内毒素含量检测方法：鲎试剂法，按照《中华人民共和国药典》2010年版三部附录ⅫE“细菌内毒素检查法(凝胶限度试验)”进行。

[0057] 3、实验结果
[0058] 采用本发明处理前的丝素蛋白膜内毒素含量为大于2EU/cm2；采用本发明方法处理一天后，内毒素限度降至不大于0.5EU/cm2；处理两天后，内毒素限度降至不大于0.125EU/cm2。

[0059] 试验结果表明，本发明方法可以有效去除生物材料样品中的内毒素，去除效果佳。

[0060] 综上，本发明提供的离子缓冲液可以有效去除生物材料中的内毒素，处理方法简单，易操作，成本低廉，采用本发明方法处理后的膜类生物医用材料及网片类材料(厚度≤1mm)生物材料中的细菌内毒素限度降至不大于0.125EU/cm2；多孔海绵支架材料(厚度1mm-3mm)中的细菌内毒素限度降至不大于0.01EU/mg。