黄芪愈伤组织和黄芪悬浮细胞的快速繁殖方法[发明专利]

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.12.18C N 103451146 A (21)申请号 201310410256.5
(22)申请日 2013.09.11
C12N 5/04(2006.01)
C12N 5/02(2006.01)
(71)申请人南京泽朗农业发展有限公司
地址211225 江苏省南京市溧水县白马镇工
业集中区食品园3号
(72)发明人苏刘花
(54)发明名称
黄芪愈伤组织和黄芪悬浮细胞的快速繁殖方
法
(57)摘要
本发明研究了一种黄芪愈伤组织和悬浮细胞
的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组
织的诱导、悬浮细胞培养、稀土调控悬浮细胞中酶
的活性及黄酮皂苷的含量等步骤，本发明方法所
制备的黄芪悬浮细胞中含有较高含量的黄芪皂
苷。

本发明方法利用稀土对黄芪悬浮细胞进行有
目的的调控，可以在短期内获得大量的制药原料，
并能有效降低生产成本。

(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书4页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页(10)申请公布号CN 103451146 A
*CN103451146A*
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1.一种黄芪愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞培养、稀土调控黄芪悬浮细胞中黄酮皂苷的含量，其主要步骤如下：
（1）按照植物组织培养常规消毒方法对野外采取的外植体材料进行消毒处理，获得无菌的外植体；
（2）将步骤（1）获得的无菌黄芪叶片，芽接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，诱导出来的愈伤组织接种入增值培养基中进行愈伤组织增值，增值培养4-5代，获得嫩绿松散的愈伤组织；
（3）将步骤（2）获得的嫩绿松散的愈伤组织接种到附加激素0.5-1.5 mg/L NAA 和1-3 mg/L IBA 的MS 培养基中进行震荡悬浮培养，培养2-3代获得黄芪悬浮细胞；
（4）将步骤（3）获得的黄芪悬浮细胞接种入MS+ 1mg/LNAA+2mg/LIBA+稀土1-3mg/L ，收集黄芪悬浮细胞称重，然后分两份，一份-70℃冰箱保存鲜样，一份60℃烘干保存干样。

2.按照权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述无菌的黄芪外植体叶片和芽按照下述方法得到：取黄芪叶片和芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分。

3.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：所述的培养条件为温度25℃，湿度50%～70%，光强度2000lx ；光期14 h 暗期10h 。

4.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（2）所述的黄芪愈伤组织按照按照下述方法得到：将获得的无菌黄芪叶片和芽切成1cm 2小块，接种入MS 培养基中进行愈伤组织诱导，每瓶接种4块，附加激素1mg/LNAA ，3mg/L2，4-D ，蔗糖30g/L ，琼脂6.5g/L ，pH=8，初代培养30天，连续继代4-5次，继代周期20天，获得嫩绿松散的愈伤组织。

5.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（3）所述的黄芪悬浮细胞按照按照下述方法得到：取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS 液体培养基100 mL 三角瓶中，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为120 r/min ，温度25℃，初次液体培养愈伤组织生长旺盛，摇匀培养液后稍置片刻，用颗粒适中的悬浮细胞团进行继代培养，换用200 mL 三角瓶装60 mL 液进行培养，再继而用500 mL 三角瓶装120 mL 液培养，以进行悬浮培养系的诱导。

6.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）所述稀土对黄芪悬浮细胞的调控按照下述方法实施：将1-3mg/l 稀土溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样测定黄芪皂苷的含量，精密称取干样品1g ， 60℃烘干，研磨后过80目筛，加入65%的乙醇和水1：1，溶液30ml 放入超声波中，60℃超声提取45min ，过滤弃残渣，使用65%的乙醇定容至100ml ，摇匀后，取1. 00 mL 提取液加入试管，再分别加入1. 00 mL 8%香草醛试剂，置于冰浴中缓缓加入10. 0mL 体积分数为72%的硫酸，摇匀，放入70℃水浴中，保温25 min ，取出置于室温冷却，摇匀，立即于波长542 nm 处测定吸光度，测定3次求平均值。

7.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）中所述的稀土是硝酸铈稀土。

8.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）中所述的黄芪皂苷提取方法为超声提取法。

权 利 要 求 书CN 103451146 A
黄芪愈伤组织和黄芪悬浮细胞的快速繁殖方法
技术领域
[0001] 本发明涉及组培条件下黄芪悬浮细胞的培养，尤其是稀土硝酸铈对悬浮细胞中黄芪皂苷的调控。

背景技术
[0002] 黄芪又名绵芪，绵黄芪，为豆科植物膜荚黄芪，为国家三级保护植物，渐危种，主要分布在中国北方地区，是一种较名贵的中药材，以根入药，药用历史悠久，具有补气固表，利尿脱毒，敛疮生肌，益气补中之功效。

目前，黄芪的用药量越来越大，但黄芪的天然资源贫乏，栽培过程中由于病虫害的影响，产量和品质有所下降，因此采用基因技术的方法，开发生产黄芪的药用成分，进行黄芪植物资源开发，减少占地的一种新方法。

[0003] 黄芪皂苷，英文名称;Astragaloside 分子式：C43H68O16分子量：840.99分子结构:
黄芪的有效药用成分为黄芪皂苷，文献报道，药材中黄芪皂苷类成分含量较低，利用比色法对黄芪根，茎，叶黄芪皂苷的含量进行了测定，研究发现黄芪根中总皂苷含量为0.2616%，茎叶总皂苷含量为0.2162%，如何提高培养物中有效成分的质量和含量，扩大培养规模，最终工业化生产这些物质，是这一研究领域的重点。

[0004] 稀土铈是排在元素周期表B族的元素，在元素周期表中排在第58位，是一类具有特殊性质的稀土元素，稀土元素在我国储量丰富，其中含量最高的是镧和铈，二者共占总量的78%，今年来国内外科学家关于这两种元素的研究日益增多，其作用也逐渐被发掘，其中铈的主要作用表现为，铈能改变酶的活性，清除自由基，对植物有抗逆效应，促进种子的萌发，根的生长发育，促进生根，促进蛋白质的合成，在植物细胞培养过程中，提高多种次生代谢物的合成。

发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供黄芪细胞悬浮培养的快速繁殖方法，并通过稀
土对悬浮细胞调控获得生长良好，内含物黄芪皂苷含量高的悬浮细胞，可以规模化的为药厂提供黄芪皂苷的来源。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案：
取黄芪叶片，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素1mg/LNAA，3mg/L2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH=8，温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000lx；光期14 h暗期10h；取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为MS+1mg/LNAA+2mg/LIBA，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为100-120 r/ min，温度25℃。

初次液体培养愈伤组织生长旺盛，摇匀培养液后稍置片刻，用颗粒适中的悬浮细胞团进行继代培养，换用200 mL三角瓶装60 mL液进行培养，再继而用500 mL三角瓶装120 mL液培养，以进行悬浮培养系的诱导，将3mg/l硝酸铈溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和黄芪皂苷的含量。

[0007] 所述培养基消毒方式为在121℃下灭菌20min。

[0008] 所述的稀土优选是硝酸铈稀土。

[0009] 所述的黄芪皂苷提取方法为超声提取法：黄芪悬浮细胞60℃烘干，研磨后过80目筛，准确称取1g，加入65%的乙醇和水1：1，溶液30ml放入超声波中，60℃超声提取45min，过滤弃残渣，使用65%的乙醇定容至100ml。

[0010] 所述的黄芪皂苷测定方法为UV法：取1. 00 mL提取液加入试管，再分别加入1.
00 mL 8%香草醛试剂，置于冰浴中缓缓加入10. 0mL体积分数为72%的硫酸，摇匀，放入70℃水浴中，保温25 min，取出置于室温冷却，摇匀，立即于波长542 nm处测定吸光度。

[0011] 酶活性的测定方法采用UV法测定。

[0012] 采用本发明制备的黄芪悬浮细胞，生长速度快，利于大生产操作，能耗小，污染小，黄芪皂苷含量0.2723%。

[0013] 下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

具体实施方式
[0014] 实施例1
取室外黄芪春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素1mg/LNAA，3mg/L2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH=8，温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000LX；光期14 h暗期10h；取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为MS+0.5mg/LNAA+1mg/LIBA，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为100-120 r/min，温度25℃，初次液体培养愈伤组织生长旺盛，摇匀培养液后稍置片刻，用颗粒适中的悬浮细胞团进行继代培养，换用200 mL三角瓶装60 mL液进行培养，再继而用500 mL三角瓶装120 mL液培养，以进行悬浮培养系的诱导，将1mg/l 硝酸铈溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和黄芪皂苷的含量，称重：悬浮细胞增量20%，UV法检测黄芪皂苷含量0.2604%。

[0015] 实施例2
取室外黄芪春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素0。

1mg/LNAA，3mg/L2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH=8，温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000LX；光期14 h暗期10h；取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为MS+0.5mg/LNAA+2mg/LIBA，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为100-120 r/min，温度25℃，初次液体培养愈伤组织生长旺盛，摇匀培养液后稍置片刻，用颗粒适中的悬浮细胞团进行继代培养，换用200 mL三角瓶装60 mL液进行培养，再继而用500 mL三角瓶装120 mL液培养，以进行悬浮培养系的诱导，将2mg/l 硝酸铈溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和黄芪皂苷的含量，称重：悬浮细胞增量25%，UV法检测黄芪皂苷含量0.2621%。

[0016] 实施例3
取室外黄芪春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素1mg/LNAA，3mg/L2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH=8，温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000LX；光期14 h暗期10h；取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为MS+1mg/LNAA+1mg/LIBA，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为100-120 r/min，温度25℃，初次液体培养愈伤组织生长旺盛，摇匀培养液后稍置片刻，用颗粒适中的悬浮细胞团进行继代培养，换用200 mL三角瓶装60 mL液进行培养，再继而用500 mL三角瓶装120 mL液培养，以进行悬浮培养系的诱导，将2mg/l硝酸铈溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和黄芪皂苷的含量，称重：悬浮细胞增量28%，UV法检测黄芪皂苷含量0.2651%。

[0017] 实施例4
取室外黄芪春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素1mg/LNAA，3mg/L2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH=8，温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000LX；光期14 h暗期10h；取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为MS+1mg/LNAA+2mg/LIBA，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为100-120 r/min，温度25℃，初次液体培养愈伤组织生长旺盛，摇匀培养液后稍置片刻，用颗粒适中的悬浮细胞团进行继代培养，换用200 mL三角瓶装60 mL液进行培养，再继而用500 mL三角瓶装120 mL液培养，以进行悬浮培养系的诱导，将2mg/l硝酸铈溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和黄芪皂苷的含量，称重：悬浮细胞增量36%，UV法检测黄芪皂苷含量0.2667%。

[0018] 实施例5
取室外黄芪春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素1mg/LNAA，3mg/L2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH=8，温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000LX；光期14 h暗期10h；取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为MS+1.5mg/LNAA+1mg/LIBA，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为100-120 r/min，温度25℃，初次液体培养愈伤组织生长旺盛，摇匀培
养液后稍置片刻，用颗粒适中的悬浮细胞团进行继代培养，换用200 mL三角瓶装60 mL液进行培养，再继而用500 mL三角瓶装120 mL液培养，以进行悬浮培养系的诱导，将2mg/l 硝酸铈溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和黄芪皂苷的含量，称重：悬浮细胞增量46%，UV法检测黄芪皂苷含量0.2689%。

[0019] 实施例6
取室外黄芪春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素1mg/LNAA，3mg/L2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH=8，温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000LX；光期14 h暗期10h；取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为MS+1.5mg/LNAA+2mg/LIBA，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为100-120 r/min，温度25℃，初次液体培养愈伤组织生长旺盛，摇匀培养液后稍置片刻，用颗粒适中的悬浮细胞团进行继代培养，换用200 mL三角瓶装60 mL液进行培养，再继而用500 mL三角瓶装120 mL液培养，以进行悬浮培养系的诱导，将2mg/l 硝酸铈溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和黄芪皂苷的含量，称重：悬浮细胞增量56%，UV法检测黄芪皂苷含量0.2695%。

[0020] 实施例7
取室外黄芪春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素1mg/LNAA，3mg/L2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH=8，温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000LX；光期14 h暗期10h；取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为MS+1.5mg/LNAA+3mg/LIBA，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为100-120 r/min，温度25℃，初次液体培养愈伤组织生长旺盛，摇匀培养液后稍置片刻，用颗粒适中的悬浮细胞团进行继代培养，换用200 mL三角瓶装60 mL液进行培养，再继而用500 mL三角瓶装120 mL液培养，以进行悬浮培养系的诱导，将3mg/l 硝酸铈溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和黄芪皂苷的含量，称重：悬浮细胞增量40%，UV法检测黄芪皂苷含量0.2711%。