尾加压素Ⅱ对大鼠平滑肌细胞生存率的影响
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(西北民族大学 医学院,甘肃 兰州 ７３００３０)
[摘 要] 目 的:观 察 尾 加 压 素II(UII)对 培 养 大 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞(VSMC)生 存 率 及 活 性 氧 产 生 的 影 响,进 一 步 研 究 UII促 VSMC 的 增 殖 作 用 及 其 机 制 ．方 法 :培 养 大 鼠 VSMC,以 不 同 浓 度 UII(１０Ｇ１０,１０－９,１０－８,１０－７,１０－６)分 别 刺 激 VSMC(０h,２４h,４８h,７２h),噻唑蓝(MTT)法 检 测 VSMC 吸 光 度 (生 存 活 力 );荧 光 探 针 (DCFHＧDA)法,检 测 不 同 浓 度 UII刺激后,VSMC 中活性氧含量．各项检测均重复３次．结果:随着 UII刺激浓度的增高及作用时间的延 长,VSMC 吸 光 度呈上升趋势,１０－９ mol/LUII刺激４８h,７２h及(１０－８,１０－７,１０－６ mol/L)UII刺 激 ２４h,４８h,７２h,VSMC 吸 光 度 较 对 照组明显升高,差异有显著性(P ＜０．０５,P ＜０．０１);随 着 UII刺 激 浓 度 增 高,VSMC 中 活 性 氧 的 生 成 也 呈 升 高 趋 势．结 论:UII可促进 VSMC 生长、增殖,其机制可能与活性氧通路激活有关．
二氢荧光素二乙酯． １．３ 主 要 仪 器
CO２ 培养箱;Olympus相差显著镜、荧光显微镜;BioＧRad６８０酶标仪．
２ 方 法
２．１ VSMC 培养 用０．３ ％的戊巴比妥麻醉大鼠,无菌条件下迅速取出主动脉胸段,放入预冷的 PBS液移入超净台,
洗涤３次,仔细剥去 外 膜,眼 科 剪 纵 轴 剖 开,轻 轻 刮 去 内 膜,然 后 移 入 另 一 盛 有 含 ２０ ％ 胎 牛 血 清 的 DMEM 培养皿剪碎,移入培养瓶 中,均 匀 种 植 于 培 养 瓶 壁,置 ３７ ℃ 孵 箱 中,４h 后 加 含 有 ２０％FBS 的 DMEM,使组织块完全浸泡在培养液中．放入培养箱(３７ ℃,５ ％ CO２),４~６d 后 可 见 梭 形 细 胞 从 组 织 块周围爬出,此后每３~５d换液一次,至单层细胞 铺 满 培 养 瓶 近 ８０ ％ 以 上 时 采 用 酶 消 化 法 进 行 传 代． 实 验 采 用 ３~８ 代 细 胞 ． ２．２ VSMC 鉴定
尾 加 压 素II(utrotensinII)是 从 鱼 脊 髓 尾 垂 体 中 分 离 出 的 一 种 多 肽 ,广 泛 分 布 于 哺 乳 动 物 和 人 的 中 枢神经系统及心血管组织,是目前已 知 人 体 内 最 强 的 缩 血 管 物 质[４]．已 有 研 究 表 明:UII 强 效 的 缩 血 管 作用、致炎作用、促 VSMC 迁移、增殖及血管重塑等作用在 AS 进程中发挥着重要作用,其机制多与 Rho 相关激酶、丝裂原活化蛋白激酶等信号通路激活有关．Maguire等研究表明[５]:UII不仅 对 粥 样 硬 化 病 变 的血管起收缩作用,同时也能加重动脉损伤．Watanabe等 的 研 究 发 现[６]:UII 能 促 进 VSMC 增 殖,并 直 接或间接的参与了 AS 的发生和发展．在上述研究基础上,本文采用 MTT 法观察不同浓度 UII刺激培 养 VSMC 不同 时 间 对 VSMC 生 存 率 的 影 响,以 进 一 步 证 实 UII 对 VSMC 的 促 生 长 作 用．同 时,观 察 UII影响 培 养 VSMC 生 存 率 过 程 中,对 VSMC 中 活 性 氧 生 成 的 影 响,以 探 讨 活 性 氧 通 路 在 UII 促
第 39 卷总第 109 期 2018 年 3 月
西北民族大学学报 （自然科学版）
Ｊournal of Northwest Minzu University （Natural Science）
Vol.39,No.1 March，2018
尾加压素Ⅱ对大鼠平滑肌细胞生存率的影响
马小青,兰祖湧,王晓坤,孙 枫,汪晨净∗
— ３６ —
VSMC 增殖过程中的调控作用．
１ 材 料
１．１ 动 物 健康雄性 SpragueＧDawley(SD)大鼠,３~４月龄 UII(Sigma);DMEM(Gibco);胎 牛 血 清 (Hyclone);噻 唑 蓝 (MTT);二 甲 基 亚 砜 ;荧 光 探 针 ２＇,７＇Ｇ二 氯
[关键词] 血管平滑肌细胞;尾加压素II;动脉粥样硬化;MTT [中图分类号]R３６３ [文献标识码] A [文章编号]１００９Ｇ２１０２(２０１８)０１Ｇ００３６Ｇ０４
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、脑梗死、高 血 压 等 许 多 缺 血 性 心 脑 血 管 疾 病 的 主 要 病 理 基 础 [１]．血 管 炎 症 反 应 、血 管 平 滑 肌 细 胞 (vascularsmoothmusclecell,VSMC)迁 移 、增 殖 及 粥 样 斑 块 形 成均是 AS 过程中的重要病理环节,并已成 为 防 治 AS 的 关 键 靶 点[２]．有 关 VSMC 迁 移、增 殖 的 研 究 资 料表明,在心血管疾病危险因素损伤 血 管 内 皮 功 能 的 始 动 因 素 下,VSMC 由 分 化 状 态 转 变 为 去 分 化 状 态,并从中膜迁移至内膜;同时,一 些 血 管 活 性 物 质 或 细 胞 因 子 大 量 合 成、释 放,并 作 用 于 VSMC 膜 受 体,调控 细 胞 内 信 号 传 导 通 路,最 终 导 致 核 内 基 因 表 达,促 使 迁 移 至 内 膜 的 VSMC DNA 合 成,细 胞 分 裂、过度增殖的病理过程正是 AS 及其相关性心脑血管疾病中血管壁纤维性斑块形成、管壁增厚的主要 原因[３]．因此,调控 VSMC 增殖及 VSMC 两种表型之间的相互转化的研究引起了人们的广泛关注．
[收 稿 日 期 ]２０１８Ｇ０１Ｇ０２ [基金项目] 国家自然科学基金资助项目(８１３６０４９０);西北民族大学２０１７年度本科生科研创新项目(Y１７０５５);２０１７
年 国 家 级 大 学 生 创 新 创 业 训 练 计 划 项 目 (２０１７１０７４２１０３)． [通讯作者] ∗
[作者简介] 马小青(１９９５—),女(回族),甘肃广河人．
[摘 要] 目 的:观 察 尾 加 压 素II(UII)对 培 养 大 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞(VSMC)生 存 率 及 活 性 氧 产 生 的 影 响,进 一 步 研 究 UII促 VSMC 的 增 殖 作 用 及 其 机 制 ．方 法 :培 养 大 鼠 VSMC,以 不 同 浓 度 UII(１０Ｇ１０,１０－９,１０－８,１０－７,１０－６)分 别 刺 激 VSMC(０h,２４h,４８h,７２h),噻唑蓝(MTT)法 检 测 VSMC 吸 光 度 (生 存 活 力 );荧 光 探 针 (DCFHＧDA)法,检 测 不 同 浓 度 UII刺激后,VSMC 中活性氧含量．各项检测均重复３次．结果:随着 UII刺激浓度的增高及作用时间的延 长,VSMC 吸 光 度呈上升趋势,１０－９ mol/LUII刺激４８h,７２h及(１０－８,１０－７,１０－６ mol/L)UII刺 激 ２４h,４８h,７２h,VSMC 吸 光 度 较 对 照组明显升高,差异有显著性(P ＜０．０５,P ＜０．０１);随 着 UII刺 激 浓 度 增 高,VSMC 中 活 性 氧 的 生 成 也 呈 升 高 趋 势．结 论:UII可促进 VSMC 生长、增殖,其机制可能与活性氧通路激活有关．
二氢荧光素二乙酯． １．３ 主 要 仪 器
CO２ 培养箱;Olympus相差显著镜、荧光显微镜;BioＧRad６８０酶标仪．
２ 方 法
２．１ VSMC 培养 用０．３ ％的戊巴比妥麻醉大鼠,无菌条件下迅速取出主动脉胸段,放入预冷的 PBS液移入超净台,
洗涤３次,仔细剥去 外 膜,眼 科 剪 纵 轴 剖 开,轻 轻 刮 去 内 膜,然 后 移 入 另 一 盛 有 含 ２０ ％ 胎 牛 血 清 的 DMEM 培养皿剪碎,移入培养瓶 中,均 匀 种 植 于 培 养 瓶 壁,置 ３７ ℃ 孵 箱 中,４h 后 加 含 有 ２０％FBS 的 DMEM,使组织块完全浸泡在培养液中．放入培养箱(３７ ℃,５ ％ CO２),４~６d 后 可 见 梭 形 细 胞 从 组 织 块周围爬出,此后每３~５d换液一次,至单层细胞 铺 满 培 养 瓶 近 ８０ ％ 以 上 时 采 用 酶 消 化 法 进 行 传 代． 实 验 采 用 ３~８ 代 细 胞 ． ２．２ VSMC 鉴定
尾 加 压 素II(utrotensinII)是 从 鱼 脊 髓 尾 垂 体 中 分 离 出 的 一 种 多 肽 ,广 泛 分 布 于 哺 乳 动 物 和 人 的 中 枢神经系统及心血管组织,是目前已 知 人 体 内 最 强 的 缩 血 管 物 质[４]．已 有 研 究 表 明:UII 强 效 的 缩 血 管 作用、致炎作用、促 VSMC 迁移、增殖及血管重塑等作用在 AS 进程中发挥着重要作用,其机制多与 Rho 相关激酶、丝裂原活化蛋白激酶等信号通路激活有关．Maguire等研究表明[５]:UII不仅 对 粥 样 硬 化 病 变 的血管起收缩作用,同时也能加重动脉损伤．Watanabe等 的 研 究 发 现[６]:UII 能 促 进 VSMC 增 殖,并 直 接或间接的参与了 AS 的发生和发展．在上述研究基础上,本文采用 MTT 法观察不同浓度 UII刺激培 养 VSMC 不同 时 间 对 VSMC 生 存 率 的 影 响,以 进 一 步 证 实 UII 对 VSMC 的 促 生 长 作 用．同 时,观 察 UII影响 培 养 VSMC 生 存 率 过 程 中,对 VSMC 中 活 性 氧 生 成 的 影 响,以 探 讨 活 性 氧 通 路 在 UII 促
第 39 卷总第 109 期 2018 年 3 月
西北民族大学学报 （自然科学版）
Ｊournal of Northwest Minzu University （Natural Science）
Vol.39,No.1 March，2018
尾加压素Ⅱ对大鼠平滑肌细胞生存率的影响
马小青,兰祖湧,王晓坤,孙 枫,汪晨净∗
— ３６ —
VSMC 增殖过程中的调控作用．
１ 材 料
１．１ 动 物 健康雄性 SpragueＧDawley(SD)大鼠,３~４月龄 UII(Sigma);DMEM(Gibco);胎 牛 血 清 (Hyclone);噻 唑 蓝 (MTT);二 甲 基 亚 砜 ;荧 光 探 针 ２＇,７＇Ｇ二 氯
[关键词] 血管平滑肌细胞;尾加压素II;动脉粥样硬化;MTT [中图分类号]R３６３ [文献标识码] A [文章编号]１００９Ｇ２１０２(２０１８)０１Ｇ００３６Ｇ０４
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、脑梗死、高 血 压 等 许 多 缺 血 性 心 脑 血 管 疾 病 的 主 要 病 理 基 础 [１]．血 管 炎 症 反 应 、血 管 平 滑 肌 细 胞 (vascularsmoothmusclecell,VSMC)迁 移 、增 殖 及 粥 样 斑 块 形 成均是 AS 过程中的重要病理环节,并已成 为 防 治 AS 的 关 键 靶 点[２]．有 关 VSMC 迁 移、增 殖 的 研 究 资 料表明,在心血管疾病危险因素损伤 血 管 内 皮 功 能 的 始 动 因 素 下,VSMC 由 分 化 状 态 转 变 为 去 分 化 状 态,并从中膜迁移至内膜;同时,一 些 血 管 活 性 物 质 或 细 胞 因 子 大 量 合 成、释 放,并 作 用 于 VSMC 膜 受 体,调控 细 胞 内 信 号 传 导 通 路,最 终 导 致 核 内 基 因 表 达,促 使 迁 移 至 内 膜 的 VSMC DNA 合 成,细 胞 分 裂、过度增殖的病理过程正是 AS 及其相关性心脑血管疾病中血管壁纤维性斑块形成、管壁增厚的主要 原因[３]．因此,调控 VSMC 增殖及 VSMC 两种表型之间的相互转化的研究引起了人们的广泛关注．
[收 稿 日 期 ]２０１８Ｇ０１Ｇ０２ [基金项目] 国家自然科学基金资助项目(８１３６０４９０);西北民族大学２０１７年度本科生科研创新项目(Y１７０５５);２０１７
年 国 家 级 大 学 生 创 新 创 业 训 练 计 划 项 目 (２０１７１０７４２１０３)． [通讯作者] ∗
[作者简介] 马小青(１９９５—),女(回族),甘肃广河人．