基因敲除技术及其在微生物育种中的应用

基因敲除技术及其在微生物育种中的应用
张红岩;申乃坤;周兴
【摘要】基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是研究基因功能的直接手段,而且在微生物育种方面发挥了巨大的作用.论述了基因敲除的基本原理、几种常用技术及该项技术在微生物育种方面的应用.分析存在的问题并展望了相关技术诸多领域的发展趋势.
【期刊名称】《酿酒科技》
【年(卷),期】2010(000)004
【总页数】5页(P21-25)
【关键词】微生物;基因敲除;同源重组;插入突变;RNA干扰
【作者】张红岩;申乃坤;周兴
【作者单位】广西科学院生物研究所,广西,南宁,530003;广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心,广西,南宁,530007;广西科学院生物研究所,广西,南
宁,530003
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-3;TS261.1;Q78
目前，微生物在解决人类的粮食、能源、健康、资源和环境保护等问题中正显露出越来越重要且不可替代的独特作用。

微生物育种作为一门应用科学技术，可以解决发酵工程中的关键问题，一直就在发酵工业中受到人们的关注[1]。

随着科技的发
展,发酵工业与生物催化向人们提出了更高的要求，进一步提高目的产物的产量、纯度及开发有价值新化合物等都是有待解决的问题，因此微生物应用的难题集中到如何对菌种进行改造，以获得高产高效的工业菌株。

初期多采用诱变育种即在人为条件下，利用物理、化学因素诱发物种产生基因突变，从而培育出新的微生物品种的方法。

但经过几十年的研究，人们发现：诱变育种盲目性高，产生的正向突变体频率低，人们难以有效地控制变异的方向和性质。

随着对微生物遗传规律的深入认识，微生物育种工作正在沿着从不自觉到自觉，从低效到高效，从随机到定向，从近缘杂交到远缘杂交的方向发展[2]。

在这一过程中，基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，利用生物体内的同源重组系统，在一定选择压力下使体外改造的带有选择标记或一定功能基因与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重组，从而使受体细胞特定基因失活或改变细胞的遗传特性[3]。

基因敲除技术广泛应用于构建具有特定突变的工程菌，改变生物代谢途径，阻断副反应的进行，防止副产物或有毒产物形成，促进目的产物积累等方面；在生物医学研究中，RNAi现象广泛存在于真核生物体内，操纵着许多细胞功能，如参与了细胞正常的生长、发育调控，稳定转座子，同时调控机体抵御外来病毒的入侵。

总之，基因敲除已成为当前医学和生物学研究的热点与前沿[4]。

本文论述了基因敲除技术的基本原理、常用技术及其该项技术目前在微生物育种中的应用。

1 基因敲除的技术原理及应用
1.1 基因敲除技术的概念及原理
基因敲除（gene knockout）又称基因打靶（Gene targeting）是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，其传统概念是指同源重组敲除技术即利用DNA转化技术，将构建的打靶载体导入靶细胞后，通过载体DNA序列与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的重组，将载体DNA定点整合入靶细胞基
因组上某一确定的位点，或与靶细胞基因组上某一确定片段置换，从而达到基因敲除的目的[5]。

随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。

所以，基因敲除的基本原理是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的一种分子生物学技术。

1.2 基因敲除技术的应用
基因敲除技术的作用主要分为两个方面：一方面是为基因功能分析提供直接证据，目前基因功能的直接证据仍是来自对缺失相应基因的突变体进行的功能分析，虽然其他研究基因功能的方法如基因芯片等在基因功能方面发挥了巨大的作用，但这些技术只是提供相关性证据，不能证明基因序列和基因功能之间的因果关系[6]；另一个方面是用于生物育种方面，基因敲除技术与代谢工程相结合，可通过阻断细胞的代谢旁路，或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量，从而达到对生物进行育种的目的。

2 基因敲除的常用技术
随着基因敲除技术不断得到发展和完善，基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段,现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。

基因敲除技术除包括最早的同源重组技术外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和RNAi,它们同样可以达到基因敲除的目的。

归纳起来，基因敲除可分为3类：同源重组、随机插入突变和RNAi基因敲除技术。

2.1 利用同源重组技术进行基因敲除
基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)技术的基础上逐步完善发展起来的，主要是利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，
将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。

通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的[7]。

目前，以λ噬菌体Red重组酶作用的同源重组技术，以及噬菌体的Cre-Loxp系统和酿酒质粒的Flp-FRT系统应用得最为广泛。

2.1.1 Red重组敲除系统
Red同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40～60 bp同源序列的PCR片段导入宿主菌细胞，利用λ噬菌体Red重组酶的作用，使导入细胞的线性DNA片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来(见图1)。

2.1.2 Cre-Loxp和Flp-FRT敲除系统
图1 利用Red同源重组技术实现基因敲除的原理[8]Ha和Hb：同源重组区域；Pa和Pb：引物位点；sm：筛选标记
Cre-loxP系统是由Hua Gu和JD Marth等人在1993年首先提出的[9]。

它包括Cre重组酶和loxP位点两部分，前者为来自E.coli噬菌体P1的cre基因编码，loxP由两个13 bp的反向重复顺序和8 bp的间隔区域构成。

Cre重组酶可介导34 bp的重复单元，切除同向重复的两个loxP位点间的DNA片段和一个loxP位点，保留一个loxP位点。

Flp-FRT系统与Cre-loxP系统相同，也是由一个重组酶和一段特殊的DNA序列组成。

从进化的角度上考虑，Flp-FRT系统是Cre-loxP系统在真核细胞内的同源系统。

其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白。

与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。

该系统的另一个成分Flp识别位点 (Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似，同样由两个长度为13 bp的反向重复序列和一个长度为8 bp 的核心序列构成。

在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺失
还是倒转。

这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。

loxP和FRT位点的序列见图2。

图2 利用Cre-LoxP或Flp-FRT技术实现基因敲除的原理[10]
2.2 利用随机插入突变技术进行基因敲除
利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞，其原理见图3。

根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。

逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。

以农杆菌介导的T-DNA插入突变适用于多种植物，可以直接在植物基因组DNA 中产生稳定的插入突变，而且插入位点的随机性较强，但是它只适用于那些容易被T-DNA转化的植物，且常常会引起的染色体重排现象，使突变体表型与T-DNA 插入无关而难以进行遗传学分析。

尽管如此，近年来将T-DNA插入突变应用于拟南芥还是获得了广泛的成功。

转座子插入突变是利用了转座子在染色体上可移动的特点，当它跳跃插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。

因此，可以利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞[6]。

图3 利用插入突变技术实现基因敲除的原理[11]A：正常cdc21基因及其转录产物示意图。

该cdc21基因含有20个外显子转录后产生一个2590 bp转录产物。

引物P1和P2分别位于外显子12和13处；转录产物的1435 bp处是外显子12和13拼接位置。

B：在外显子12和13之间的内含子处插入含有β-Geo筛选标记的
Cdc21基因后，靶基因转录在1461 bp提前终止。

2.3 RNAi技术进行基因敲除
RNAi系统是真核敲除系统的另一代表。

其分子机制现在还没有完全弄清楚，在线虫、果蝇、植物和动物卵细胞的RNAi试验中，相继发现了一些与RNAi作用相关的酶和蛋白质。

RNAi在哺乳动物中的机制基本上与果蝇和其他低等生物中RNAi
的机制相似[12]。

现在公认的RNAi的分子机制模型，把RNAi发生的基本过程分为起始阶段和效应阶段。

在起始阶段，RNAIII家族的双链特异的核糖核酸酶(在果蝇中命名为Dicer)及其可能的dsRNA结合因子，以ATP依赖的方式将长片段dsRNA切割成21～23 bp的siRNA。

在效应阶段，siRNA组装成一个siRNA核糖核蛋白复合体(siRNP)，siRNP重排形成RNA诱导的沉默复合物 (RNA-induced silencing complex,RISC)，在RNA介导的RNA聚合酶（RNA-directed RNA polymerases,RdRPs）作用下合成新的双链RNA分子，产生随机降解性聚合酶链式反应，不断降解目的mRNA，导致目的基因沉默[13-14]，其原理见图4。

从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA[15]。

由于
在原核细胞中共翻译，所以在原核细胞中不能使用RNAi技术[17]。

图4 利用RNAi干扰技术实现基因敲除的原理[16]
3 基因敲除在微生物育种中的应用
3.1 研究微生物基因的结构和功能。

基因敲除技术作为研究基因功能和结构的最直接最有效的方法之一，为从分子水平研究工业生产菌株代谢途径中各相关基因的结构和功能，为下一步改造打下坚实的基础；同时利用基因敲除技术可对病原菌致病、耐药机理，并为最终防治病害提供了强有力的基因功能。

基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。

丁醇除了是重要的有机化工原料外，还是一种极具潜力的新
型生物燃料。

Green等[18]通过非复制性质粒，对乙酰乙酸脱羧酶aad基因进行
阻断试验，发现丁醇合成显著下降，转化子经过25次传代，此性状稳定存在，证实了aad基因在丁醇合成中起着重要作用。

而其进一步的研究发现，敲除磷酸转
乙酰酶基因pta或丁酸激酶基因buk，丁酸合成会减少，而丁醇产量明显提高[19]。

尼克霉素是一种能够抑制几丁质合成酶的抗生素，可由一种链霉菌发酵生产。

其有效活性成分包括X组分和Z组分，运用基因敲除技术对尼克霉素的生物合成基因sanO基因进行敲除，发现突变株的X组分消失，而Z组分与野生菌相当，把含有anO基因重组质粒转入野生菌后，X组分含量加倍，证明sanO基因与X组分合
成直接相关[20]。

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是曲霉属中最常见的致病真菌，在免疫受损的患者中常引起有致命危险的侵袭性肺曲霉病。

Alcazar等[21]研
究了烟曲霉erg3A和erg3B两个基因在固醇合成和对抗真菌药物耐受性中的作用。

分别敲除了erg3A基因、erg3B基因和将两个基因共同敲除，结果显示erg3B编码C25固醇脱氢酶，而erg3A对烟曲霉麦角固醇合成没有明显的作用。

3.2 阻断或降低副产物的合成，提高目标产物的产量，从而改良工业生产菌株
乙醇生物合成过程中，酵母菌等乙醇生产菌除生成乙醇外还生成乙酸、甘油等副产物，可以通过敲除副产物合成有关基因从而增加乙醇产量。

从酵母代谢途径可知，与乙醇合成和分解相关的是5个乙醇脱氢酶的同工酶，而控制乙醇含量的2个酶
是乙醇脱氢酶I(ADH I)与乙醇脱氢酶II(ADH II)。

ADH I的作用是将乙醛变成乙醇，ADHII的作用是将乙醇转变为乙醛。

赵丽娟等[22]通过敲除ADH II基因，使改造后菌株发酵产乙酸的含量大幅下降，而乙醇含量得到升高。

酵母菌乙醇发酵中甘油的合成是受GPD1和GPD2编码的两个同工酶控制，许多科学家[23-24]希望通过敲除这2个基因来降低甘油含量，进而提高乙醇产量。

但敲除甘油合成基因后会
导致细胞耐渗透性下降及NADH积累还不能达到预期效果。

Bro等[25]利用生物
信息学手段分析酿酒酵母的基因组水平代谢模型，并对其基因组进行修饰，综合模
拟与评估菌株的生物量和副产物的形成，成功构建了降低甘油产量提高乙醇产率的酿酒酵母工程菌株。

Tummala等[26]过度表达乙醇/乙醛脱氢酶，并且通过反义RNA技术抑制CoAT
活性，下调乙酰辅酶A转移酶基因ctfB的表达，最终使得丁醇产量增加到2.8倍。

1,3-丙二醇（1,3-PD）的生物合成过程中醛脱氢酶是乙醇合成途径的关键酶，其
催化作用消耗大量甘油。

张延平等[27]用同源重组技术敲除醛脱氢酶（ALDH）基因后，1,3-PD合成浓度明显提高了27%～42%。

3.3 提高产物纯度
乳酸在工业领域具有广泛的用途，乳酸可由乳酸菌发酵生成，但发酵生成的乳酸常有两种构型。

因为乳酸菌既有D-乳酸脱氢酶基因（ldhL），又含L-乳酸脱氢酶基因（ldhD）。

Kyla-Nikkila K等[28]用基因敲除的方式构建了2株菌GRL86和
RL89，其中GRL86菌株缺失了ldhD的启动子区域；GRL89菌株中用另一个
ldhL基因替代了ldhD基因，新增加的ldhL在原来ldhD启动子的调控下表达1
敲除后，2株菌都只产生L-乳酸，且L-LDH的最高活性分别比原始菌株高出53%和93%。

大肠杆菌琥珀酸发酵时发酵液中常含有甲酸、乙酸、乳酸等副产物，给
后续分离带来诸多不便。

Pan等[29]人以大肠杆菌W3110作为受体菌株，构建了乙酸和乳酸形成缺陷的双重突变株SS373(W3110 pta::Tn10 ldhA::Kan)。

SS373大肠杆菌能够在葡萄糖培养基上在厌氧条件下生长，因为它可以产生乙酰辅酶A，而大肠杆菌NZN111却不能。

在两步法培养中，琥珀酸和丙酮酸是主要的发酵产物。

当使用非PTS糖类发酵时，可以发酵产生几乎纯的琥珀酸。

4 基因敲除技术存在问题及应用前景
自20世纪80年代建立并发展起来后,基因敲除技术已经应用到许多领域,如疾病模型的建立和临床治疗、异种器官移植、动物育种等,成为功能基因组学研究的重要
手段。

随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基
因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。

但是作为一项新兴的微生物育种技术，基因敲除克服了传统诱变方法的盲目性和偶然性，敲除后被改变的基因会随染色体DNA进行复制，改良的菌种可稳定地用于后续的研究和生产。

随着现代分子生物学的发展和人类基因组图谱的完成，功能基因组学研究正大规模启动,基因敲除技术已成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。

相信随着分子生物学的不断发展与完善，如表达载体系统的不断更新，标记基因被荧光基因替代等，基因敲除技术必将给基因功能的研究带来新的飞跃。

随着人们对基因敲除技术认识的逐步深入，这种技术必将具有更加广泛的应用前景。

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