菌种的复苏传代及保存标准程序.

菌种的复苏传代及保存标准程序

目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。

范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。

职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。

内容：

菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。

1.菌种的复苏

1.1冻干菌种的复苏

检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。

1.1.1准备：

①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。

②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。

③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。

1.1.2操作：

1.1.

2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。

1.1.

2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。

1.1.

2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。

1.1.

2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。

1.1.

2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将

冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。

1.1.

2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。

1.1.

2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。

1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。

1.2.1准备：①冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。

②细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按1：1比例混匀制成。

1.2.2按1.1.2.1~1.1.2.4操作，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。

1.2.3按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-20℃或-80℃条件下冷冻保存。

1.2.4制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按1.2.3冻存。

1.3冻存菌悬液的复苏：

1.3.1准备：

①用具：灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。

②培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基10ml、硫乙醇酸盐流体培养基12ml或改良马丁培养基10ml等）、琼脂斜面或平板培养基。

③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。

1.3.2操作：

1.3.

2.1从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。

1.3.

2.2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台。

1.3.

2.3用75%酒精棉球擦拭菌种冻存管外壁，稍干。

1.3.

2.4点燃酒精灯，在火焰旁打开菌种冻存管盖，用一支灭菌滴管吸取解冻的菌悬液，接种至10ml液体培养基中（生孢梭菌需接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中）。或用接种环取菌悬液划线接种于琼脂斜面或平板培养基上。

1.3.

2.5将用过的滴管和菌种管投入消毒液内浸泡，接种环在火焰上灼烧。

1.3.

2.6将上述接种后的培养基在规定温度下培养（细菌在30~35℃恒温培养18-24小时，真菌在23~28℃恒温培养24-48小时，黑曲霉*培养5~7天）。

1.3.

2.7仔细观察培养物：如呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种，注明菌名、编号、代次和接种日期后，置2~8℃冰箱内保存；如发现菌苔形状不典型，可进行平板分离单菌落。

1.3.

2.8注意：已解冻的冻存管不可再冻存。

2.菌种的接种、传代

2.1.准备

①用具：接种环、酒精灯。

②培养基：营养琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基或适宜的液体培养基。培养基应新鲜制备，如斜面已干缩，无冷凝水，则不宜再使用。

③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液。

④菌种：根据2010年版《中国药典》的要求，传代次数（n）应不超过4代。

2.2将冰箱中取出的菌种斜面，在室温放置30分钟，待温度平衡后再移入接种室内或超净工作台。

2.3点燃酒精灯，将菌种管与接种管持在左手拇指、食指与中指之间，试管口斜向上，

两试管口平齐靠近火焰旁。

2.4用右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种时易拔取，再以右手持接种环在火焰上烧红30秒钟，随后将全部铂金丝及金属棒部分在火焰上灼烧，往返通过3次。

2.5右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔出棉塞，夹在无名指、小指及掌部，并勿使其与任何物品接触。

2.6将灼烧过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，取出时，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入至接种管内液体培养基中，或在琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上，注意只划动一次，勿重复移动，且勿使菌苔沾在管壁口。

2.7取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁将试管棉塞塞上，然后将接种过细菌的接种环在火焰上灼烧灭菌。

2.8已接种毕的各管贴好标签，注明菌名、编号、代次（n+1）和接种日期，细菌管置30~35℃培养18~24小时；真菌管一般置23~28℃培养24~48小时（黑曲霉需培养5~7天）。

2.9培养到期后取出培养物，仔细观察菌苔形态，是否正常，并与上代菌种比较，有无杂菌。必要时涂片，革兰氏染色镜检，呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种。如发现菌苔形状不典型，可继续进行平板划线培养，分离单菌落，挑选典型菌苔接种于营养琼脂斜面上，代替原有的工作用菌种。

2.10检查合格的工作用菌种，放入冰箱内2~8℃保存，一般1个月转种一次。2.11菌种（第n 代）接种至适宜培养基中，在规定的温度条件下的培养物，即为第n+1代。

注意：黑曲霉*致病性很强，操作时应特别注意：

①黑曲霉孢子相当稳定，其在0.9%氯化钠溶液中，4℃左右的条件下可以保存较长的时间，故可将此孢子悬液作为储备液在1~2月内使用，以减少反复操作的风险性。

②为防止黑曲霉孢子的传播，接种传代时应关闭风机，近酒精灯操作。

③若传代的母代菌种为菌悬液，则用无菌吸管吹吸管内液体，取1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7日。

④接种传代时，改良马丁斜面必须是干燥的，否则影响其孢子的形成。

⑤接种传代后，使用过的器具均需在121℃，30分钟高压灭菌后再作处理。

3.菌种的保存：

3.1菌悬液冻存法：