第41章 基因工程及蛋白质工程12PPT幻灯片
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如EcoRI，当反应条件改变时，其特异性 可由原来6 bp的GAATTC降为4 bp的AATT，一 般用EcoRI＊表示，称为EcoRI的星活性。
14
同裂酶、同尾酶
由不同微生物分离得到的限制酶，如果识别 位点和切割位点完全一样，称为同裂酶 （isoschizomers）；如仅仅是粘性末端突出的 单链相同，称为同尾酶（isocaudamers）。
蛋白质工程（protein engineering):是在基因工程 基础上发展起来的。是指通过对蛋白质已知结构与 功能的认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位 诱变等技术改造蛋白质，以达到改进其某些性能的 目的。
1
1972年美国斯坦福大学的Berg和他的同事将λ噬 菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入猴病毒SV40 DNA中，首次构建出DNA的重组体。
3
ห้องสมุดไป่ตู้
一、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)又称限制性内切酶，简称为限 制酶。这类酶能识别双链DNA分子内部的特 异位点并且裂解磷酸二酯链。
主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外 来DNA的入侵。1968年，Smith等人首先从 流感嗜血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III 。
退火 4-7 ℃ HO P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ P OH
10
PstI 等产生的3‘粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
特异性切割
24-26 bp处
8
（二) II型限制酶的识别和切割位点
II 型限制性核酸内切酶的基本特性:
识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列,大部 分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列 呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome).
EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列
6
（一)限制酶的命名和分类
1. 限制性核酸内切酶的命名
属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d （嗜血流感杆菌d株）
H i n d II H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
7
2. 限制性核酸内切酶的分类
主要特性 I 型
II 型
III 型
限制修饰
由同尾酶切割的限制片段彼此相连，不能再 被原来的限制酶切割。例如，BamH I限制片段 与Bgl II的限制片段相连后，其序列变为，与原 来两个限制酶的识别序列均不相同，因此不再 为原来的酶所切割。
15
3 5 ''- -A T A T T A A T A T T A - -5 3 '' A D h ra a Ⅲ Ⅰ 3 5 ''- -A T A T T A +A T A T T A - -5 3 ''
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C … 5’
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ … G C T G 3’‘ … C G A C T T A A
AATTCGAG… G C T C … 5’
EcoRI等产生的5‘粘性末端(Sticky end)
12
现巳提纯供商品用的限制酶有400余种，其中常用者列举于表下表
13
使用限制酶时应注意提供适宜的反应条件， 如DNA底物的纯度、浓度、分子结构和构型、 缓冲液的PH及离子强度等。如果反应体系不能 满足最适条件，则可能导致酶产生第二活性， 又称星活性(star activity)，即限制酶严格的识 别特异性降低，导致其在DNA分子内产生附加 切割。
1973年，Cohen和Boyer获得了抗四环素和新霉 素的重组菌落，标志着基因工程的诞生。
Kanamycin R6-5
Tetracycline pSC101
EcoR I
DNA Ligase
Kanr and Tetr
2
技术上的三大发现
➢ 限制性内切酶和DNA连接酶的发现 （标志着DNA重组时代的开始）。 ➢ 载体的使用。 ➢ 逆转录酶的发现。
双功能
单功能
双功能
蛋白结构 异源三聚体
同源二聚体
异源二聚体
辅助因子 ATP Mg2+ SAM
Mg2+
识别序列 TGAN8TGCT
旋转对称序列
A（AECcNo6BG）TGC（Eco C）
ATP Mg2+ SAM
GAGCC CAGCAG
切割位点 距识别序列1 kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游
随机性切割
PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH
P-G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G-P
OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
HO P 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
第一节 概 述
基因工程（gene engineering）:是对携带遗传信 息的分子进行施工的分子工程，包括基因重组、克 隆和表达。基因工程这个术语既可用来表示特定的 基因施工项目，也可泛指它所涉及的技术体系，其 核心是构建重组体DNA的技术，因此基因工程和重 组体DNA技术(DNA recombination)有时也就成 为同义词。
P OH
11
PvuII等产生的平头末端(blund end)
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
PvuII 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH 3‘ … C-G-A-G-T-C-P
P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’
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同裂酶、同尾酶
由不同微生物分离得到的限制酶，如果识别 位点和切割位点完全一样，称为同裂酶 （isoschizomers）；如仅仅是粘性末端突出的 单链相同，称为同尾酶（isocaudamers）。
蛋白质工程（protein engineering):是在基因工程 基础上发展起来的。是指通过对蛋白质已知结构与 功能的认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位 诱变等技术改造蛋白质，以达到改进其某些性能的 目的。
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1972年美国斯坦福大学的Berg和他的同事将λ噬 菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入猴病毒SV40 DNA中，首次构建出DNA的重组体。
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ห้องสมุดไป่ตู้
一、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)又称限制性内切酶，简称为限 制酶。这类酶能识别双链DNA分子内部的特 异位点并且裂解磷酸二酯链。
主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外 来DNA的入侵。1968年，Smith等人首先从 流感嗜血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III 。
退火 4-7 ℃ HO P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ P OH
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PstI 等产生的3‘粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
特异性切割
24-26 bp处
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（二) II型限制酶的识别和切割位点
II 型限制性核酸内切酶的基本特性:
识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列,大部 分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列 呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome).
EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列
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（一)限制酶的命名和分类
1. 限制性核酸内切酶的命名
属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d （嗜血流感杆菌d株）
H i n d II H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
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2. 限制性核酸内切酶的分类
主要特性 I 型
II 型
III 型
限制修饰
由同尾酶切割的限制片段彼此相连，不能再 被原来的限制酶切割。例如，BamH I限制片段 与Bgl II的限制片段相连后，其序列变为，与原 来两个限制酶的识别序列均不相同，因此不再 为原来的酶所切割。
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3 5 ''- -A T A T T A A T A T T A - -5 3 '' A D h ra a Ⅲ Ⅰ 3 5 ''- -A T A T T A +A T A T T A - -5 3 ''
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C … 5’
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ … G C T G 3’‘ … C G A C T T A A
AATTCGAG… G C T C … 5’
EcoRI等产生的5‘粘性末端(Sticky end)
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现巳提纯供商品用的限制酶有400余种，其中常用者列举于表下表
13
使用限制酶时应注意提供适宜的反应条件， 如DNA底物的纯度、浓度、分子结构和构型、 缓冲液的PH及离子强度等。如果反应体系不能 满足最适条件，则可能导致酶产生第二活性， 又称星活性(star activity)，即限制酶严格的识 别特异性降低，导致其在DNA分子内产生附加 切割。
1973年，Cohen和Boyer获得了抗四环素和新霉 素的重组菌落，标志着基因工程的诞生。
Kanamycin R6-5
Tetracycline pSC101
EcoR I
DNA Ligase
Kanr and Tetr
2
技术上的三大发现
➢ 限制性内切酶和DNA连接酶的发现 （标志着DNA重组时代的开始）。 ➢ 载体的使用。 ➢ 逆转录酶的发现。
双功能
单功能
双功能
蛋白结构 异源三聚体
同源二聚体
异源二聚体
辅助因子 ATP Mg2+ SAM
Mg2+
识别序列 TGAN8TGCT
旋转对称序列
A（AECcNo6BG）TGC（Eco C）
ATP Mg2+ SAM
GAGCC CAGCAG
切割位点 距识别序列1 kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游
随机性切割
PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH
P-G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G-P
OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
HO P 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
第一节 概 述
基因工程（gene engineering）:是对携带遗传信 息的分子进行施工的分子工程，包括基因重组、克 隆和表达。基因工程这个术语既可用来表示特定的 基因施工项目，也可泛指它所涉及的技术体系，其 核心是构建重组体DNA的技术，因此基因工程和重 组体DNA技术(DNA recombination)有时也就成 为同义词。
P OH
11
PvuII等产生的平头末端(blund end)
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
PvuII 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH 3‘ … C-G-A-G-T-C-P
P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’