全细胞催化

3.生物转化法合成核苷酸 生物转化法合成核苷酸
• 核苷酸是一类在代谢上极为重要的生化物质，除作为DNA、 RNA 的前体外，还参与细胞的生长代谢、能量的储存和 转化、免疫反应及信号传导。 • 近年来随着核酸工业的发展，嘧啶核苷酸作为药物中间体、 保健品和食品添加剂的重要性越来越突出。 • 全细胞生物催化法不但能缩短生产周期并简化后提取过程， 而且可以通过偶联不同的基因工程菌株，生产多种复杂的 核苷酸、核苷糖和寡聚糖。
目前我国酶法生产生物柴油的工作也有重要进展，其中北 京化工大学采用自己开发的酵母脂肪酶进行酶法合成生物 柴油研究，其生物柴油转化率已达到96%，固定化半衰期 达200h以上。
用生物酶法制备生物柴油目前存在着一些问题：
反应物甲醇容易导致酶失活 副产物甘油影响酶反应活性及稳定性 酶的使用寿命过短等
2.手性醇的生产 手性醇的生产
生物催化法一般通过2 种方式: 一是由拆分外消旋底物生 成，二是由手性前体化合物直接合成。 后者的优点是可预期催化转化率。 Kataoka等构建了一个新的生物还原系统：通过一对组合 酶羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶，能把前手性羰基底物转化 为手性醇。迄今已从微生物中获得十几个具有底物特异性 和立体专一性特征的酶，并建立了一个很大的羰基还原酶 库。
微生物全细胞催化技术在工业 生产中的应用
• 1.定义：全细胞催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、 组织甚至个体)作为催化剂进行化学转化，其本质是利用 细胞内的酶进行催化。 该法是介于发酵法和提取酶催化法之间的一种生物催化技 术。 • 2.优点：细胞内完整的多酶体系可以实现酶的级联反应， 从而弥补酶法催化中级联催化过程不易实现的不足，提高 了催化效率，同时，又省去了繁琐的酶纯化过程，制备更 加简单，生产成本更低。
谷氨酸、半胱氨酸、 谷氨酸、半胱氨酸、 甘氨酸 甘油
微生物
重组大肠杆菌
酶
Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶
谷胱甘肽合成酶 重组大肠杆菌 甘油脱氢酶 葡萄糖脱氢酶 氧化还原酶 磷酸激酶 内酯酶 脯氨酸羟化酶
L-甘油醛 甘油醛
手性醇 抗坏血酸-2-磷酸 抗坏血酸 磷酸 泛酸盐 羟脯氨酸
相应的酮类 抗坏血酸 泛酰内酯 脯氨酸
• 该酶库中一个成功的例子就是用能同时表达假丝酵母的4氯-3-羟基丁酸乙酯还原酶基因和巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱 氢酶基因的重组大肠杆菌催化4-氯代乙酰乙酸乙酯生成S4-氯-3-羟基丁酸乙酯。 • 在适当的条件下300 g/L的4-氯代乙酰乙酸乙酯转化为S-4氯-3-羟基丁酸乙酯，其摩尔产率96%，而NADP+ 的酶变 -396% NADP 率为21600 mol/mol。 • S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是抑制羟甲基戊二酰辅酶A 还原酶 的重要起始原料，在Kaneka公司已经商业化生产。这种 共表达系统也适合于其他NAD(P)H依赖型反应。
重组大肠杆菌 鞘氨醇单胞菌 尖孢镰刀菌 重组大肠杆菌
1.生物柴油的开发 2.手性醇的生产 3.生物转化法合成核苷酸
1.生物柴油的开发 生物柴油的开发
定义：生物柴油是由动物、植物、或微生物油脂与小分子 醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸脂类物质，可以替代 柴油作为柴油发动机的燃料。
全细胞酶催化合成生物柴油具有效率高，生产成本低，酶 对有机溶剂的耐受性强，条件温和、酶用量少、无污染排 放，反应后产物易分离，而且具有环境友好性等特点。
• 尿嘧啶核苷酸(UMP)是嘧啶核苷酸生物合成中处于结点位 置的重要核苷酸，在寡聚糖合成和抗癌药物生产中都是重 要的前体物质 。
• 在工业上，生物催化法合成UMP 通常以乳清酸为底物， 利用菌体自身产生的5-磷酸核糖焦磷酸( PRPP)经过乳清 酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的催化作用合成。
• 日本协和发酵公司的研究者把具有德夸菌素抗性、核苷酸 酶弱化和温度敏感性的产氨短杆菌KY13505 突变菌株用 表面活性剂Nymeen S-215和甲苯处理使之获得高通透性， 在乳清酸用量为20g /L的体系中反应26 h，产物UMP达 286g /L，这是到目前为止报道的UMP的最高产量。
• 手性醇在一些特殊化学和制药工业中是一个极为重要的原 料，尤其在制药工业。 • 手性醇作为合成手性药物的重要中间体，在当今制药领域 具有广泛的用途。 • 生产手性醇常用方法有贵金属催化合成法和生物对称催化 合成法。
生物催化合成法是利用生物代谢过程中产生的酶，选择性 的催化底物反应，从而获得高纯度的手性单体。 该反应具有反应条件温和、催化效率高、立体区域选择性 好，而且可ຫໍສະໝຸດ Baidu完成一些普通化学无法进行的反应等特点， 受到有机化学家、生物学家及药物学家的极大重视。
• 近几年，国内也开展了全细胞生物催化合成UMP的研究。 李慧采用链霉素抗性、卡那霉素抗性和产物结构类似物抗 性作为筛选手段，对产氨棒杆菌进行离子束和紫外诱变， 选育出一株UMP生成能力比出发菌株R248提高7倍的突变 株M14，其UMP的转化能力达21g /L。 • 研究表明，采用产氨棒杆菌模式菌株ATCC6872，确立催 化反应液的最佳组成为乳清酸、葡萄糖、磷酸根离子、 MgCl2和Triton X-100。其UMP的产量达104g/L，是优化 前的3倍。
全细胞催化技术因其自身的优点，必将成为整个生物催化 技术的核心。 但就目前情况来看，全细胞催化虽然比自由酶以及化学催 化具有更经济更环保的优势，但其催化反应过程的不确定 性、细胞膜对底物或酶的通透性、副反应导致的产物降解 以及副产物的累积等，却阻碍了其在工业上的推广。
• 因此，运用基因工程技术筛选和改造各种微生物催化剂将 是解决全细胞催化技术自身缺点的有效方法，这些研究也 将成为今后发展生物催化技术方面的重要研究课题。
日本的Yuji Shimada等利用Novozym 435(Candida antarctica)脂肪酶在分段反应器中通过流加甲醇生产生物 柴油，产品中脂肪酸甲酯的体积分数可以达到93%以上， 并且经过100天的反应，酶不会失活。
• 2008年Hama等首次采用重组真菌作全细胞催化剂生产生 物柴油。将异孢镰刀菌的脂肪酶基因转化到米根霉进行异 源表达，用多孔生物量支架颗粒固定重组米根霉细胞，用 于催化甲醇解反应。 • 结果表明，当向反应体系中添加5%水时，不但可以有效 阻止甲醇对脂肪酶的失活效应，而且还使部分甘油酯的酰 基转移更容易，使用10次后甲酯的产率仍可达94% 。表 明重组米根霉全细胞催化剂与野生米根霉全细胞催化剂相 比，具有更高的甲酯得率且脂肪酶更加稳定。
生命科学的飞速发展也大大增加了全细胞催化的可行性， 如利用DNA 重组技术，可使目标酶在不同宿主细胞中大 量表达。利用这种分子生物学技术甚至可以修饰宿主细胞 的代谢途径，合成复杂的代谢产物。
目前，部分已成功运用全细胞催化技术的实例见下表。
目前微生物全细胞催化在工业合成过程中的应用 产品
谷胱甘肽
底物
• Gao等从土壤中分离出一种产脂肪酶的细菌Proteu ssp.K107克隆其脂肪酶基因在大肠杆菌BL21中进行表达， 将重组大肠杆菌以全细胞催化剂的形式来催化生产生物柴 油。 • 结果表明，15℃时，当用0.3% (质量分数)十六烷基三甲基 溴化铵(CTAB)处理细胞后，其催化活力显著提高，反应12 h 后生物柴油的产率接近100%。 • 与其他全细胞催化剂相比，大肠杆菌全细胞催化剂对甲醇 有较高的耐受性，这为解决生物柴油生产过程中甲醇致使 脂肪酶失活提供了新的思路。