三种快速制备含重复序列质粒PCR模板的方法

μL TE清洗 , 4 000 r/m in、4℃离心 3 m in,去上清 ,加
20μL TE 回溶 ,分别煮沸 1、115、2、215 和 3 m in,
12 000 r/m in、4℃离 心 2 m in, 取 上 清 用 于 PCR
扩增 。
11314 TE / SDS煮沸法制备模板 取过夜培养的
Ab s tra c t: H igh, TE boiling method and TE / SDS boiling method were used to treat E. coli in order to exp lore the rap id p reparation method of PCR temp late using p lasm id with DNA repeat sequence. It was found that clear objective bands could be got using these three methods which could be app lied to p relim inary identification of p lasm id w ith repeat sequence. The results of centrifugating 5 m in, boiling 3 m in by TE and boiling 2. 5 m in by TE / SDS were better than that of others. The three methods were rap id, simp le, low cost, no pollu2 tion and simp lification of p reparation of PCR temp late, that could lay a basis for further study of rap id screening and identification of re2 combinant p lasm id.
Key wo rd s: H igh speed centrifugation TE boiling method TE / SDS boiling method PCR temp late Repeat sequence
近年来 ,人们已经发现 40多种人类神经系统疾 病与 DNA 重复序列扩增或删除有关 [ 1 - 3 ] ,这些疾病 所涉及的重复序列的一个共同特点是以非孟德尔遗 传方式在世代间发生动态突变 [ 4 ] ,且往往伴随着遗 传早现现象 [ 5, 6 ] 。在研究该类疾病的致病机理时 , 需要应用 PCR 的方法对构建含重复序列的质粒重 组子进行大量的筛选鉴定 ,并且探索治疗药物及方 案时也需制备成百上千的 PCR 样品进行定性检测 重复序列的长度变化情况 。传统的 PCR 模板制备 一般需要进行碱法小提质粒 ,即 SDS /NaOH 消化 、 酚 /氯仿 等 有 机 溶 剂 抽 提 及 乙 醇 沉 淀 等 多 步 操 作 [ 7 ] ,虽然得到的质粒 DNA 样品纯度较高 ,但费时 、
μL TE清洗 , 14 000 r/m in、4℃分别离心 1、2、3、4和
5 m in,去上清 , 20 μL TE回溶 , 12 000 r/m in、4℃离
心 2 m in,取上清用于 PCR 扩增 。
11313 TE 煮沸法制备模板 取过夜培养的菌体
115 mL , 4 000 r/m in、4℃离心 3 m in,去上清 ,加 20
( GeneGenius) ;高速冷冻离心机 ( Eppendorf) ; 紫外 2
可见分光光度计 (NanoD rop )等 。
113 模板的制备
11311 对照质粒的提取 利用 Tiangen 质粒小提
试剂盒提取 。
11312 高速离心法制备模板 取过夜培养的菌体
115 mL , 4 000 r/m in、4℃离心 3 m in,去上清 ,加 20
每一种方法的第 1 个样品条带 (即泳道 A1、B1、C1 的目的条带 )分别定义为 1000,去除背景噪声干扰 后 ,其余的条带则选定目的区域后由软件自动处理 , 试验结果如表 2。从表 2 中数据可看出 ,同种方法 不同处理时间制备的模板扩增后的量化值相差不 大 ,说明处理时间对试验结果的影响较小 ,与文献中 报道的有所差异 [ 11 ] 。
1 材料与方法
111 菌株 大肠 杆 菌 DH5α, 本 实 验 室 保 存 。重 组 质 粒
pLC ( GAA ) 42 、pLC ( GCCT) 18由本实验室构建 ,分别 含有一段三核苷酸重复序列 ( GAA ) 42和四核甘酸重
收稿日期 : 2009211202 基金项目 :国家自然科学基金 (30460038) ,内蒙古自然科学基金重点项目 (200508010102) 作者简介 :赵宏宇 ,男 ,讲师 ,硕士研究生 ,研究方向 :分子生物学 ; E2mail: zhaohongyu2000@163. com 通讯作者 :蔡禄 ,男 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向 :生物信息学及分子生物学 ; E2mail: nmcailu@163. com
120
生物技术通报 B io techno logy B u lle tin
2010年第 2期
复序列
(
GCCT)
[8 18
,
9
]
。
112 试剂与仪器
11211 试剂 Taq DNA 聚合酶 、dNTP、100 bp mak2
er购自 TaKaRa公司 , Tris2base、SDS购自 OXO ID 公
关键词 : 高速离心法 TE煮沸法 TE / SDS煮沸法 PCR模板 重复序列
Three M ethods of Rap id Prepara tion of Pla sm id D NA Tem pla te w ith Repea t Sequence for PCR
Zhao Hongyu1, 2 Cai Lu1, 2 Zhao Xiujuan1, 2 W ang J ingyan1, 2 L i J ing1
·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO G Y BULL E T IN
2010年第 2期
三种快速制备含重复序列质粒 PCR模板的方法
赵宏宇 1, 2 蔡禄 1, 2 赵秀娟 1, 2 王晶妍 1, 2 李晶 1
(1内蒙古科技大学数理与生物工程学院 ,包头 014010; 2内蒙古科技大学生物工程与技术研究所 ,包头 014010)
反应体系为 25μL ,其中包括 1 ×PCR B uffer (内 含 115 mmol/L M g2 + ) 、模板 DNA 2μL、Taq DNA 聚 合酶 0175 U、引物终浓度 013μmol/L、dNTP终浓度 0125 mmol/L ,其余用 ddH2O 补足 。
反应程序 : 94℃预变性 2 m in; 94℃变性 30 s、 65℃退火延伸 2 m in, 29 个循环 ; 72℃延伸 5 m in; 4℃保存 。反应结束后 ,取反应产物 20μL ,于 5%聚 丙烯酰胺凝胶电泳 , EB 染色 , 凝胶成像仪下观察 结果 。
赵宏宇等 :三种快速制备含重复序列质粒 PCR模板的方法
121
图 1 样品的琼脂糖电泳检测结果
212 PCR 扩增检测 对 3种方法制备的含 ( GAA ) 42重复序列的质粒
的直接进行进行 PCR 扩增后 ,其结果见图 2。从图 2中可见 , 3种方法得到目的条带都在 159 bp 左右 , 位置正确 ,条带清晰 ,与试剂盒提取质粒作为对照扩 增的结果基本一致 ,均可以用于重复序列长度的初 步鉴定 。
样品编号
浓度 ( ng/μL)
wk.baidu.com
表 1 三种方法制备的含 D NA重复序列质粒样品的浓度与纯度
OD260 /280
样品编号
浓度 ( ng/μL)
OD260 /280
样品编号
浓度 ( ng/μL)
OD260 /280
A1
78114
2119
A2
54310
2115
A3
53112
2108
A4
61018
2117
菌体 115 mL , 4 000 r/m in、4℃离心 3 m in,去上清 ; 加 20μL TE清洗 , 4 000 r/m in、4℃离心 3 m in,去上
清 ,加 20 μL TE /011% SDS回溶 ,分别煮沸 1、115、
2、215和 3 m in, 12 000 r/m in、4℃离心 2 m in, ,取上 清用于 PCR扩增 。 114 PCR 扩增 [ 10 ]
表 2 PCR扩增的目的条带量化值
摘 要 : 为了探索含重复序列质粒 PCR模板的快速简易制备方法 ,分别利用高速离心法 、TE煮沸法和 TE / SDS煮沸法 处理过夜培养的含重组质粒大肠杆菌菌体 ,制备模板后进行 PCR 扩增发现 ,均能得到比较清晰的目的条带 ,可以用于含重复 序列质粒的初步鉴定 。相比较而言 ,高速离心 5 m in、TE煮沸 3 m in、TE / SDS煮沸 215 m in制备的样品 PCR 扩增后效果较好 。 这 3种方法快速 、简便 、费用低 、无污染 ,简化了 PCR模板制备的过程 ,为重组质粒大量筛选鉴定的研究奠定了基础 。
A5
50310
2111
B1
1 44319
2101
B2
1 28719
2112
B3
1 14711
2112
B4
1 67010
2111
B5
2 00719
2110
C1
2 42819
C2
2 08515
C3
1 97911
C4
2 32013
C5
2 28010
2107 2109 2108 2107 2109
2010年第 2期
2 结果与分析
211 PCR 模板的制备 高速离心法分别离心 1、2、3、4 和 5 m in 得到
PCR 模板样品记为 A12A5; TE 煮沸法分别煮沸 1、 115、2、215和 3 m in得到 PCR 模板样品记为 B1 B5; TE / SDS煮沸法分别煮沸 1、115、2、215和 3 m in 得到 PCR模板样品记为 C1 - C5。紫外分光光度计 测量制备样品的浓度与纯度 ,含 ( GAA ) 42质粒的模 板测量结果见表 1。从表 1 中数据可看出 ,高速离 心法制备的样品浓度普遍较低 , TE / SDS煮沸法制 备的 样 品 浓 度 较 高 , OD260 /280 值 均 大 于 2。经 过 018%琼脂糖凝胶电泳检测 , A 组样品 DNA 含量较 低 ,没有明显的条带 (图略 ) ,B组、C组检测结果如图 1 所示。图 1中 C为对照 ,是用试剂盒提取的质粒 pLC (GAA)42 ,B组与 C组样品的相应位置均具有明显的条 带 ,说明含有该质粒 ,由于制备样品过程中 E. coli基 因组断裂片段或 RNA 的存在造成拖尾现象 。
司 ,其余为国产分析纯 。
11212 引物 引物为 pLC质粒系列插入的重复序
列两端接头 [ 8, 9 ] , 由 上海 生工 合成 , 其 序列 为引 物
EP1: 5′2GGA ATT CGA GTC GCG C23′,引物 PB2: 5′2
CGG GAT CCG AGT CGC GC23′。
11213 仪器 基因扩增仪 (B iometra) ;凝胶成像仪
费力 ,因此如何简化 DNA 模板的制备便成为 PCR 试验中的重要问题 。本试验探索了高速离心法 、TE 煮沸法和 TE / SDS煮沸法制备 PCR 模板 ,整个提取 过程在较短时间内即可完成 ,建立了快速 、简易 、低 成本的 PCR模板制备方法 ,为分子克隆及药物处理 菌体后大量检测 DNA 重复序列及相关遗传疾病分 子机制研究奠定了基础 。
(1 School of M athem atics Physics and B iological Eng ineering, IMUS T, B aotou 014010; 2 Institute of B ioengineering & Technology, IMUS T, B aotou 014010)