桑黄鲨烯环氧酶基因克隆与序列分析

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秦巴山区桑黄18SrDNA的序列与亲缘关系分析

（ｈａｘｓｔｔｏｃｏｉｇ，ｉｎ７０４，ｈｎ）ＳａｎｉｎｔｕｅｆｒｂｌｙＸ１０３ＣｉａＩｉＭｉｏａ
ＡｓａｔＡｉｂｔｃ：ｍ３ｄｆｒｎｈｌｎｓｉｔｓｓａｓｃｌｃｄｆｍｔｅＱｎａＭｏｎａｒａａｅｕｅ，ｌｅｎｒｉｅｅｔｅｌｕｎｅｔｉｏｅｔｏｉＢｕｔｎａｅｒｓｄｃｏｄａｄｆＰｉｌｕｒｎｌｅｒｈｉｎ
ＰｅｌｕｉｔｕｎＱｉｂｏｎａｎｈｌｎｓｌｅｓｉｎａＭｕｔｉｓｉｎ
ＬＩｉｇＷＵＹ — ａ，ＨＡＧＷｅ－ｎＺＡｕ－ａＬ－ｉＥｎ，ａｚｏＺＮｎｊ，ＨＮＧＹｅｊｎ，ＩｘｎＰｈｕｕＹｅ
西北大学学报（自然科学版）２１０２年８月，４第２卷第４期，ｕ．２１，ｏ．２Ｎ．Ａｇ，０２Ｖ１４，ｏ４
ＪｕｎｌｆｏｈｅｔｎｖｒｔＮｔｒｃｎｅＥｉｏ）ｏｒａｏ￣ｗｓＵｉｓｙ（ａｕａＳｉｃｄｉＮｅｉｌｅｔｎ
ｔｗｏＰｌｉｕｉｔｕｔａｎｈｅｔｈｅｌｎｓｌｅｓｓｒｉｓ，ＳａｇＳａｕａｇｔｇｔｒｗｉｈｅＰｗｅｌＳｐｎ— ｏｅｆｇｎｎｔｓｂｕｉｎｎ — ｎｄＨａＳｎｏｅｈｅｔｔｏｌｉｈｌｕｎｕｓＩｏｏｕａｍｉ，ｈｓｍｉａｉｉｓｗｅｅ９．ｉｌｒｔｅｒ９８％ａｄ９．ｎ９９％．
其中２个桑黄菌株桑一和桦桑与鲍氏针层孔菌（ｎｎｔｓｂｕｉＳＩｏｏａｍｉｕ）

暴马桑黄ras基因启动子的克隆及序列分析

第46卷第2期2021年3月Vol.46No.2Mar.2021林业科技FORESTRY SCIENCE&TECHNOLOGYDOI:10.19750/ki.1001-9499.2021.02.007暴马桑黄ras基因启动子的克隆及序列分析乌木提•巴合提别克王淑婷唐玉倩邹莉*(东北林业大学林学曉，黑龙江哈尔滨150040)摘要：以暴马桑黄(Sanghuan卽orus baumii)菌丝体提取的DNA为模板，采用PCR扩增技术，克隆得到ras基因启动子片段，并采取在线软件对其功能元件进行分析，结果显示：克隆得到的ras基因启动子片段含有典型启动子所具备的作用元件TATA-box和CAAT-box,还有许多其他重要作用元件G-box、CAG-motif、GATA-motif、MBS、TC-rich repeats等；并预测786-836bp是核心启动子区概率最高(0.97),且认为在826bp处碱基T为转录起始位点；除此之外，在ms基因启动子片段中预测到多个转录因子结合位点和1个长588bp的CpG岛，初步判断克隆得到的ms基因启动子具备调控外源基因表达的能力。

关键词：暴马桑黄；ms基因启动子；克隆；序列分析中图分类号：S567.3文献标识码：A桑黄是一类名贵大型药用真菌的统称，目前已知14种⑴，主要用于治疗盗汗、血崩、血淋、痢疾、带下、闭经、脱肛泄血、脐腹涩痛等病症⑵。

现代研究显示，桑黄在消炎止痛⑶、保肝护肝⑷、治疗糖尿病⑸、抑制癌细胞增殖®"等方面也有显著效果。

桑黄良好的药用效果主要由于其富含三祜、多糖、黄酮等多种药用活性成分⑻。

但各活性成分含量相对较低，无法满足生产上的需求⑺U期望利用分子技术定向培育出所需的桑黄菌株。

遗传转化体系的建立是定向育种的基础，高效率的启动子则是高效遗传转化的关键工具。

此前，食用菌转化体系并不完善，常借用来自CaMV35S (花椰菜花叶病毒)的外源启动子,但会出现表达效率偏低的现象口。

人参鲨烯合成酶基因的克隆与初步表达研究的开题报告

人参鲨烯合成酶基因的克隆与初步表达研究的开题报告
题目：人参鲨烯合成酶基因的克隆与初步表达研究
一、研究背景和意义
人参是一种重要的中药材，具有补气养血、益精强身、提神醒脑等功效。

其中人参鲨烯是一种重要的成分，具有降血脂、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性。

人参鲨烯的合成依赖于人参鲨烯合成酶，目前已经有多个鲨烯合成酶基因被克隆并进行研究，但对于人参鲨烯合成酶的研究还相对较少。

因此，克隆人参鲨烯合成酶基因并进行初步表达研究，有助于深入研究人参鲨烯的生物合成及其生物学功能，为人参的开发利用提供基础研究支持。

二、研究内容和方案
1. 利用PCR技术从人参中克隆鲨烯合成酶基因。

2. 构建真核表达载体，并进行初步表达研究。

3. 利用Western blot和蛋白质荧光染色等方法对表达的蛋白进行检测和定量分析。

4. 利用实时荧光定量PCR技术分析基因表达水平。

三、预期结果及成果分析
1. 成功克隆并鉴定人参鲨烯合成酶基因，并构建真核表达载体。

2. 成功实现基因的初步表达，并对表达的蛋白进行检测和定量分析。

3. 对人参鲨烯合成酶的基因表达水平进行分析和初步验证。

这项研究的成功完成将为深入研究人参鲨烯的生物合成及其生物学功能提供基础研究支持，并有助于推动人参的开发利用。

鲨烯环氧酶基因(SQEs)的克隆及其在温度胁迫下与枇杷悬浮培养细

ＬＩＨｕｉ — Ｈｕａ ’ ＸＵＪｉａｎＬＩＵＸｉａｏ－ＹｉｎｇＷＡＮＧＷｅｉＣＨＡＮＧＱｉａｎｇＳＵＭｉｎｇ — Ｈｕａ
ＦｕｊｉａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＢｏｔａｎｙ，Ｘｉａｍｅｎ３６１００６，Ｃｈｉｎａ
调控机制的研究悬浮细胞，熊果酸（ｕＡ１，鲨烯环氧酶基因（ＳＱＥｓ），温度胁迫
ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＳｑｕａｌｅｎｅＥｐｏｘｉｄａｓｅＧｅｎｅｓ（ＳＱＥｓ）ａｎｄＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓＢｅｔｗｅｅｎＴｈｅｉｒＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＵｒｓｏｌｉｃＡｃｉｄ（ＵＡ）ＣｏｎｔｅｎｔｉｎＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎＣｅｌｌｓｏｆＬｏｑｕａｔ（ＥｒｉｏｂｏｔｒｙａｊａｐｏｎｉｃａＬ．）ＵｎｄｅｒＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＳｔｒｅｓｓ
（１２ｄ）细胞生长与目标产物ＵＡ的相互关系。同时，采用同源克隆方法分离．ｓＱ，研究ｌ５℃处理中，两个
枇杷鲨烯环氧酶基因（ｅｊＳＱＥ１和ｅｊＳＱＥ２）的差异性表达。结果表明，ｅｊＳＱＥｌ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＪＱ２９４０５３．２）

桑黄真菌分子鉴定及遗传多样性分析

Mycosystema
菌物学报 15 May 2010, 29(3): 347-356
jwxt@ ISSN1672-6472 CN11-5180Q ©2010 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.
桑黄真菌分子鉴定及遗传多样性分析
桑黄是担子菌亚门 Basidiomycota 、层菌纲 Hymenomycetes，非褶菌目 Aphyllophorales，锈革孔菌科 Hymenochaetaceae，针层孔菌属 Phellinus 的真菌（张小青和戴玉成 2005），具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、消炎、增强免疫等药理活性（Kang et al. 2006；Cho et al. 2007；Zhu et al. 2008；宋爱荣等 2009），近年来其基础研究和应用开发成为热点。但何种确定的 Phellinus 属真菌可以作为药用真菌桑黄的基源，学界目前还没有达成共识，在研究及开发中多种 Phellinus 属真菌被当作桑黄入药使用（戴玉成 2003；张小青和戴玉成 2005；Kang et al. 2006；Zhu et al. 2008；曾念开等 2008），其中研究较多的为 Phellinus baumii Pilat（Dai & Xu 1998； Lim et al. 2003；Cho et al. 2007）、Phellinus linteus (Berkeley & Curtis) Teng（Lim et al. 2003；Jung et al. 2008）和 Phellinus igniarius (L. ex Fr.) Quél（宋爱荣等 2009）。
方法（Bruns et al. 1991）。其中位于 18S rDNA 及 28S rDNA 间的 rDNA 内转录间隔区（ internal transcribed spacer，ITS）序列，由于进化速率快、稳定性好和测序方便，已经被众多研究者应用于多种真菌种属水平的分类鉴定研究中（White et al. 1990；Bruns et al. 1991；李海波等 2008；Li et al. 2008；Geml et al. 2009；Alaei et al. 2009；Tedersoo et al. 2009）。

金铁锁ITS序列分析及其鲨烯合酶基因原位杂交的开题报告

金铁锁ITS序列分析及其鲨烯合酶基因原位杂交的开题报告一、研究背景和意义金铁锁（Carcharhinus plumbeus）是一种重要的海洋鱼类，广泛分布于世界各大洋。

其深受海产品市场的消费者所喜爱，同时也是许多捕鲨国家的重要渔业资源。

然而，随着过度捕捞、环境污染和气候变化等因素的影响，金铁锁种群数量不断下降，已经被列入濒危物种名录中。

因此，保护金铁锁的种群健康状况已成为当今迫切需要解决的问题。

在保护金铁锁种群健康状况的过程中，研究其基因表达特征和调控机制是非常重要的，特别是关注与脂质代谢相关的基因。

因为脂质代谢是维持鱼类生命活动不可或缺的生理过程，而鲨烯合酶是脂质合成途径中的重要酶催化剂，具有调节胆固醇和三酰甘油水平的作用。

因此，本研究采用金铁锁ITS序列分析和鲨烯合酶基因原位杂交技术，探究金铁锁脂质代谢相关基因的表达调控机制，从而为金铁锁种群健康管理提供理论和实践上的支持。

二、研究内容和方法本研究主要分为两个阶段：第一阶段，进行金铁锁ITS序列分析。

ITS序列是多个物种之间的DNA序列差异比较明显的区域，是研究分子系统学和物种遗传多样性的常用标记。

本研究将通过PCR扩增、克隆和测序等步骤得到金铁锁ITS 序列，进一步比对序列同源性，构建系统进化树，以此证实金铁锁物种的准确性和遗传多样性。

第二阶段，进行鲨烯合酶基因原位杂交实验。

原位杂交技术可用于检测转录水平和在特定细胞或组织中定位基因，在研究基因表达和调控机制方面具有广泛应用。

本研究将采用合成标记和探针标记两种方法对金铁锁组织切片进行原位杂交实验，以检测鲨烯合酶基因的转录水平和在组织结构中的分布规律。

同时，通过西方印迹和定量PCR检测鲨烯合酶基因在不同组织中的表达水平，以验证其原位杂交实验结果的可靠性和准确性。

三、预期结果本研究将从两个方面探究金铁锁脂质代谢相关基因的表达调控机制，预期结果如下：1、构建金铁锁ITS序列的系统进化树，验证金铁锁物种的准确性和遗传多样性。

人参SQS和SE酶基因的克隆及其表达载体的构建

人参SQS和SE酶基因的克隆及其表达载体的构建摘要鲨烯合酶(SQS)和鲨烯环氧酶(SE)是人参皂苷生物合成过程中的关键酶。

以五年生人参叶片为供试材料提取总RNA,根据GeneBank上已发布的SQS 和SE基因登录号(AB010148和AB122078),查找对应序列并设计特异性引物,运用RT-PCR方法,通过构建pMD18-T重组质粒、测序分析,成功克隆到大小分别为1440 bp的SQS基因和1780 bp的SE基因。

同时还构建了这2个基因的表达载体pCAMBIA1301-SQS和pCAMBIA1301-SE,从而为分子水平上探讨三萜皂苷生物合成机理及其在药用植物中的应用提供试验材料。

关键词人参;鲨烯合酶;鲨烯环氧酶;克隆;表达载体构建GeneCloningofSQSandSEEnzymeandConstructionofExpressionVectorinGinseng ZHANG Ming-zheWANG Zhen-huiZHANG Mei-pingWANG YiSUN Chun-yuJIANG Shi-cui(Cell Engineering Lab,College of Life Sciences,Jilin Agricultural University,Changchun Jilin 130118)AbstracSQS and SE are key enzymes of ginsenoside biosynthesis pathways. According to the SQS and SE accession number(AB010148 and AB122078)in GeneBank,which had been released,the corresponding sequences were researched and the specific primers were designed. Extracting total RNA from 5 years-old ginseng leaves,two genes of SQS and SE,which was about 1 440 bp and 1780 bp respectively,were successfully cloned using RT-PCR,by constructing of recombinant plasmid pMD18-T and sequencing analysis. At the same time,the expression vectors pCAMBIA1301-SQS andpCAMBIA1301-SE of these two genes were established,which would provide experimental materials for exploring the biosynthesis mechanism of triterpenoid saponins at the molecular level and the application of medicinal plants.Key wordsginseng;SQS;SE;clone;construction of expression vectors人参(Panax ginseng C.A.Mey.)为我国古老而名贵的药用植物,系五加科(Araliaceaae)人参属植物[1],是一种具有潜力的药用植物,在人类保健和医疗上应用广泛。

【国家自然科学基金】_克隆与序列分析_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140731

测序抗病基因实时定量pcr 多样顺式作用元件重组质粒酵母双杂交进化分析载体构建转染转化表达载体蓝氏贾第鞭毛虫萼花臂尾轮虫聚酮合酶绿色荧光蛋白线粒体dna 系统发育突变狂犬病毒牛瑟氏泰勒虫油茶条锈菌旋毛虫抑制性消减杂交序列分析,dna 平邑甜茶大肠杆菌大熊猫多态性分子进化分子克隆几丁质酶全序列分析免疫原性低传代二色补血草 trna基因 rnai rapd标记 rapd hsp70基因 cdna末端快速扩增 16s rdna 14-3-3蛋白黄瓜
科研热词序列分析克隆基因克隆原核表达表达 rt-pcr 生物信息学基因表纯化小麦聚合酶链反应组织表达同源性表达序列标签苎麻番茄电子克隆 rna干扰辣椒质粒绵羊系统发育分析真核表达载体生物信息学分析甘蓝型油菜杜氏盐藻日本血吸虫抗原性序列测定巴西橡胶树基因序列基因型同源性分析全长cdna 亚细胞定位麻疯树雄性不育鉴定融合蛋白芜菁细胞质雄性不育简并引物甜菜
科研热词克隆序列分析基因克隆原核表达基因表达 cdna克隆生物信息学分析 rna干扰转染表达分析电子克隆鉴定小麦质粒真核表达载体甘蔗抑制性消减杂交巴西橡胶树半定量rt-pcr 酵母双杂交进化载体构建表达模式茶树胁迫组织表达纯化系统发育分析白血病猪棉花差异表达基因山羊家蚕单核苷酸多态性 pcr cdna 锌指蛋白重组表达遗传距离进化树蛋白纯化脂肪酸去饱和酶羊驼
107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160

五加科中药鲨烯环氧酶的进化分析

五加科中药鲨烯环氧酶的进化分析摘要本研究选择六种五加科常用中药的鲨烯环氧酶进行比对分析，以获得其在进化上的关系，结果表明鲨烯环氧酶具有较高的保守性，在进化关系上，分为两支，人参与屏边三七的亲缘关系最近，与西洋参关系最远。

关键词五加科；鲨烯环氧酶；进化分析中图分类号：S567.19文献标识码：AAbstract: In order to gain the evolutionary relationship between six squalene epoxidases from traditional Chinese medicines of Araliaceae, comparison based on AA squences was carried out through bioinformatics software. Results indicate that qualene epoxidases had a conserved region. Panax ginseng and Panax vietnamensis var.fuscidiscus had a closest genetic relationship, however, a furthest realationshipwith Panax quinquefolius.Keywords: Araliaceae; Squalene Epoxidase; Phylogenetic analysis五加科植物是一个较大和较常用中药的来源，包含有人参、三七、刺五加、树参、通草等多种中药[1]。

近年来对五加科植物的研究较多，主要集中在药材的识别与分类[2-3]、成分的提取及其药理作用[4]。

鲨烯环氧酶（SE）作为三萜皂苷合成途径中的一个关键酶，而三萜皂苷是众多名贵中药材的次生代谢产物，具有抗肿瘤、降血糖血脂等生物活性[5]，在中药药理的研究中是一个重要的研究内容。

桑黄基因组DNA提取方法优化及分子鉴定

桑黄基因组DNA提取方法优化及分子鉴定作者：陈力群谭晴晴陈雪燕刘利平刘国霞胡悦范阳阳刘艳艳步迅张全芳来源：《山东农业科学》2019年第01期摘要：本研究以桑黄为材料，筛选出一种快速直接提取子实体DNA的方法。

利用CTAB 法、试剂盒及硅珠DNA纯化技术分别对桑黄子实体基因组DNA进行提取，结果表明，硅珠DNA纯化技术的提取效果最好，试剂盒方法次之。

经过PCR扩增和测序得到桑黄的rDNA ITS序列，通过BLAST比对及系统进化树构建，发现所检测的样品为哈尔蒂木层孔菌Phellinus hartigii。

关键词：桑黄;DNA提取;ITS;分子检测中图分类号：S567.3;;文献标识号：A;;文章编号：1001-4942（2019）01-0018-05Extraction Method Optimization and MolecularIdentification of Phellinus igniarius Genomic DNAChen Liqun;1，Tan Qingqing;2，Chen Xueyan;2， Liu Liping;3， Liu Guoxia;2，Hu Yue;2， Fan Yangyang;2， Liu Yanyan;2， Bu Xun;2，Zhang Quanfang;2（1. High School Attached to Shandong Normal University， Jinan 250014， China;2. Bio-Tech Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100，China;3. Shandong Academy of Agricultural Sciences Community Health Service Station of Quanfu Officein Licheng District of Jinan City， Jinan 250100， China）Abstract;Using Phellinus igniariusas as research materials， a method for rapidly extracting DNA from Phellinus igniarius was screened. The genomic DNA of Phellinus igniarius was respectively extracted by CTAB method， DNA extract kit and silica bead DNA purification technology. The results showed that the extraction method of silica bead DNA purification technology was the best， and the kit method was the second. The ITS gene sequence of Phellinus igniarius was obtained by PCR amplification and sequencing. By the BlAST sequence alignment and the construction of phylogenetic tree， we found the detected sample was Phellinus hartigii.Keywords;Phellinus igniarius; DNA extraction; ITS; Molecular detection桑黃（Phellinus igniarius）是一类珍贵的药用真菌的统称，又称桑臣、桑耳、胡孙眼、桑黄菇，素有“森林黄金”的美称[1]，最早记载于《药性论》中。

人参鲨烯环氧酶基因的克隆与原核表达

人参鲨烯环氧酶基因的克隆与原核表达胡薇;刘宁;田玉华;李雨婷;张连学【摘要】【目的】克隆人参皂苷生物合成途径中的鲨烯环氧酶（SQE）基因，并进行原核表达与纯化，初步探讨SQE活性与人参皂苷生成量之间的关系。

【方法】以4年生人参根组织须根为材料，提取其总RNA，反转录为cDNA。

以合成的cDNA为模板，对SQE基因进行克隆，再将其插入原核表达载体pET-30a中，构建pET-30a-SQE重组质粒，经酶切和测序鉴定后，转入Rosetta大肠杆菌，经0.8 mmol/L IPTG 37 ℃诱导表达4 h后，进行SDS-PAGE电泳检测，采用Ni Agarose亲和层析柱纯化目的蛋白，利用液相色谱串联质谱联用技术（LC-MS）检测SQE的活性。

【结果】获得了人参SQE基因1 611 bp的全长编码区cDNA。

酶切和测序结果表明，原核表达载体pET-30a-SQE构建成功；SDS-PAGE分析显示，在Rosetta大肠杆菌中成功诱导表达了SQE融合蛋白，且纯化后的目的蛋白纯度较高；LC-MS联用检测结果发现，随着SQE用量的增加，达玛烯二醇的生成量递增。

【结论】克隆了人参SQE基因，获得了在体外具有生物学活性的SQE蛋白，并证实了其活性与人参皂苷生成量有很大的相关性。

%【Objective】The research was conducted to determine the relationships with enzyme activity of squalene epoxidase (SQE) and the accumulation of ginsenosides after cloning and expression a full-length cDNA encoding squalene epoxidase for the biosynthetic pathway of ginsenosides.【Method】Fouryear ginseng root tissue fibrous was used as material.After extracting the total RNA and reversing transcription,primers were designed and then SQE gene cloned.And the production was inserted to expression vector pET-30a to obtain recombinant plasmid pET-30a-SQE andexpressed (0.8 mmol/L IPTG for 4 h at 37 ℃) in the host cells Rosetta.The results were analysed by SDS-PAGE.The recombinant protein was purifed by affinity chromatograph.And the enzyme activity of SQE was determined with LC-MS.【Result】The results showed that complete encoding sequence of SQE in ginseng root was 1 611 bp,which encoded 537 amino acid residues.Restriction enzyme mapping and sequencing showed that pET-30a-SQE expression vector was constructed successfully.SDS-PAGE showed that fusion protein of SQE was induced in Rosetta host cells and the purity of interest protein was very high.The production of dammarendiol was increased gradually as the concentration of SQE enzyme increased after liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS) analysis.【Conclusion】SQE gene was cloned and expressed,and gained active enzyme of SQE in vitro.The results indicated that there were significant correlations between the enzyme of SQE and the contents of total ginsenosides.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)010【总页数】6页(P207-212)【关键词】人参;鲨烯环氧酶;cDNA克隆;原核表达【作者】胡薇;刘宁;田玉华;李雨婷;张连学【作者单位】吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;吉林农业大学中药材学院,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】Q786;S567人参（Panax ginseng C.A.Meyer）为五加科人参属植物。

绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析

西北植物学报,2010,30(8):1520-1526Acta Bot.Boreal.2Occident.Sin. 文章编号:100024025(2010)0821520207绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析蒋军富,李雄英,吴耀生3,罗　育,周　娟,赵瑞强(广西医科大学生物化学与分子生物学教研室,南宁530021)摘　要:根据已报道植物鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因cDNA序列的保守区域设计引物,利用R T2PCR 和RACE技术,对绞股蓝SE基因进行克隆及序列分析.结果表明,绞股蓝SE基因cDNA全长为1818bp,编码一个由525个氨基酸残基组成的多肽.绞股蓝SE基因编码的氨基酸序列中含有52.4%的非极性疏水性氨基酸,26.1%极性中性氨基酸,9.0%酸性氨基酸,12.6%碱性氨基酸.Blast结果显示,绞股蓝SE基因核苷酸序列与其他已报道的植物SE基因相似性为73%～82%,推导的氨基酸序列相似性为63.2%～79.4%.SE氨基酸序列进化分析发现,绞股蓝SE与绿珊瑚、拟南芥亲缘关系较近.关键词:绞股蓝;鲨烯环氧酶;RACE;克隆;序列分析中图分类号:Q789文献标识码:ACloning and Sequence Analysis of Squalene EpoxidaseG ene from Gynostemma pent a phyll umJ IAN G J un2f u,L I Xiong2ying,WU Yao2sheng3,L UO Yu,ZHOU J uan,ZHAO Rui2qiang (Depart ment of Biochemistry and Molecular Biology,Guangxi Medical University,Nanning530021,China)Abstract:Degenerate p rimers designed from t he conservative domain of squalene epoxidase(SE)in plant s were used to amplify t he SE fragment s f rom cDNA of Gy nostem m a penta p hy ll um by R T2PCR and RACE technology.The f ull2lengt h cDNA of SE f rom G.pent a p hy ll um had1818bp wit h an open reading frame encoding525amino acids of protein.There are52.4%of nonpolarity hydrop hobic,26.1%of polarity neu2 t ral,9.0%of acidic,as well as12.6%of alkaline amino acid residues in t he SE polypeptide chain.The re2 sult s of homologous analysis in GenBank demonst rated t hat t he sequences had73%～82%similarity on t he nucleotide sequence and63.2%～79.4%similarity on t he deduced amino acid sequence.Furt hermore,p hy2 logenic analysis on t he amino acid sequence of SE f rom G.pent a p hy ll um wit h t hose of ot her plant s showed t hat G.penta p hy ll um was clo sely related to Eu p horbi a ti rucalli and A rabi dopsis t hali ana.K ey w ords:Gy nostem m a pent a p hy ll um;squalene epoxidase;RACE;cloning;sequence analysis 三萜皂苷(t riterpenoid saponin)是一类重要的中草药有效成分,常见于绞股蓝(Gy nostem m a pen2 t a p hy ll um)、人参(Panax gi nseng)、三七(Panax notogi nseng)、柴胡(B u pleurum chi nense)、积雪草(Centell a asi atica)等植物中,具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂等多种生物活性[1],具有重要的药用商业价值.三萜皂苷合成途径中,鲨烯环氧酶(EC.1.14.99.7,squalene epoxidase,SE)是一个关键的限速酶.该酶存在于内质网的微粒体中,催化鲨烯(squalene,SQ)生成2,32氧化鲨烯(2,32oxidosqual2①收稿日期:2010201221;修改稿收到日期:2010207208基金项目:广西科学基金(桂科基0575065;0731065)作者简介:蒋军富(1982-),男(汉族),在读硕士研究生,主要从事中药基因克隆研究.E2mail:Jiangjunfu2006@3通讯作者:吴耀生,博士,教授,硕士生导师,主要从事植物分子生物学和基因工程方面的研究.E2mail:wuyaosheng03@ene),可进一步合成三萜皂苷、甾醇、胆固醇等重要萜烯类物质,其含量和活性决定了后续产物的产量[2].目前,已从拟南芥(A rabi dopsis t hali ana)、人参、三七等植物中克隆出编码SE的基因,使植物体内三萜类物质代谢调控机制研究深入到分子水平.绞股蓝俗称七叶胆、公罗锅底,广泛分布于中国秦岭和长江以南地区,属葫芦科绞股蓝属植物.绞股蓝主要活性成分为三萜皂苷,有8种皂苷与人参皂苷结构完全相同[3],是五加科以外为数不多的含人参皂苷的植物,有“南方人参"的美称,具有抑制肿瘤、降低血脂、增强免疫等多种药理作用[4].高绞股蓝三萜皂苷含量以提高其药用价值,是绞股蓝育种的一个主要目标.本研究利用逆转录PCR(reverse t ranscription2 PCR,R T2PCR)和cDNA末端快速扩增(rapid am2 plification of cDNA ends,RACE)技术,对绞股蓝三萜皂苷合成途径关键酶SE基因进行克隆,并对克隆的序列进行生物信息学分析,这对从分子水平上探讨三萜皂苷的生物合成机制具有重要意义,并将为通过生物技术提高其含量奠定基础.1　材料和方法1.1　材　料供试材料绞股蓝采自广西医科大学校园,并经广西药用植物园凌征柱研究员鉴定.1.2　试剂T aq酶、限制性内切酶、pMD182T Vector、J M109感受态细胞、3′2Full RACE Core Set Ver.2.0、dA TP、末端脱氧核糖核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl t ransferase,TD T)、RNase H等为Takara产品;普通cDNA第一链合成试剂盒(Re2 vert A ID TM M2First St rand cDNA Synt hesis K it)为MB I产品;柱式胶回收及质粒小量提取试剂盒为杭州博日生物有限公司产品;其余试剂均为上海生工生物工程公司产品.1.3　方　法1.3.1　叶片总RNA提取　在陈莉等[5]方法的基础上对异硫氰酸胍法做进一步改进:减少样品的起始量(使之与提取缓冲液的比例在1∶10左右);将用于除去蛋白质和多糖的冰浴时间、离心速度和离心时间分别调整为10min、15000r/min、15min; -20℃异丙醇沉淀RNA的时间减为20～30min,离心速度增至15000r/min.1.3.2　总cD NA的逆转录　取1μg绞股蓝总RNA,以Oligo d T为引物,进行总cDNA逆转录.反应体系为25μL.按照RevertAid TM First st rand cDNA synt hesis K it(Fermentas)使用说明,进行逆转录反应,获得cDNA第一链.1.3.3　cD NA保守区序列的PCR扩增　根据Gen2 Bank中已报道的人参、三七、拟南芥、毛曼陀罗(D at ura i nnox i a)等植物SE序列进行多重比对,在序列保守区域利用Oligo6.0软件设计简并引物,扩增绞股蓝cDNA的保守区序列.上游引物为J SE2s(5′2GG(G/T)CT(A/T)G A(G/A)G ATTGT (G/T)TG23′),下游引物为J SE2as(5′2C(A/C) CCATT(T/A)G AAAT A G AA GG23′).PCR反应体系为25μL,包含10×PCR Buffer(Mg2+Free)2.5μL, MgCl2(25mmol/L)2.0μL,dN TP Mixture(2.5 mmol/L each)4μL,上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL,Taq聚合酶(1U/μL)1.0μL,总cDNA(1μg/μL)1.0μL,加dd H2O至25μL.反应程序为94℃预变性5min,94℃变性40s,54.1℃退火1min,72℃延伸90s,40个循环后,72℃延伸10min.1.3.4　3′R ACE扩增　根据SE基因cDNA保守区序列设计SE基因的3′RACE的引物3P15′2G AATT2 GTGAACTTCCTCATGC23′)和3P2(5′2AT ACT A G2 CA GACCCTTCTCCC23′),按照3′2Full RACE Core Set Ver.2.0说明书进行3′RACE反应.1.3.5　5′RACE扩增　根据已克隆的SE基因中间保守区片段和3′RACE片段的测序结果,利用Vec2 tor N TI Suit6.0软件拼接得到绞股蓝SE基因的部分序列,再根据这部分序列利用软件Primer Premier5.0设计基因特异性引物.其中AP为反转录引物,5P1和5P2分别作为第1轮和第2轮PCR的下游引物.互补的含同聚尾的锚定引物和相应的接头引物由3′2Full RACE Core Set提供.反转录引物AP (5′2GGG A G AA GGGTCTGCT A GT AT23′),5P1(5′2 GGG A G AA GGGTCTGCT A GT AT23′),5P2(5′2 GCATGA GG AA GTTCACAATTC23′).按下列方法进行cDNA第1条链合成和PCR扩增.按Fermentas Revert Aid TM First strand cDNA synthesis K it使用说明,以A P作为特异性反转录引物,进行反转录反应,合成cDNA第1链.用RNase H30℃反应1h 降解mRNA2cDNA杂化双链中的mRNA,然后通过柱式胶回收试剂盒纯化第一链cDNA,利用TD T 在单链cDNA的3′末端加入同聚A尾,作为PCR 扩增模板.第1轮PCR反应条件为:94℃预变性312518期蒋军富,等:绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析min ;94℃变性30s ;54.8℃退火30s ,72℃延伸1min ,30个循环;72℃延伸10min.取第1轮PCR 产物作为模板,进行第2轮巢式PCR.第2轮PCR 反应条件为;94℃预变性3min ;94℃变性30s ;55℃退火30s ,72℃延伸1min ,30个循环;72℃延伸10min.1.3.6　扩增产物克隆与测序　PCR 产物在1%琼脂糖凝胶电泳后,利用胶回收试剂盒回收产物,连接到p MD182T 载体,构建重组质粒.转化J M109感受态细胞,筛选重组子并提取质粒进行酶切及PCR 鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程公司测序.1.3.7　绞股蓝SE 基因cD NA 全长序列的拼接及生物信息学分析　利用Vector N TI Suite 6.0软件对中间保守区扩增片段、3′RACE 和5′RACE 所得片段的测序结果进行分析和拼接.利用DNAman 软件分析绞股蓝SE 基因cDNA 全长序列的性质,在NCB I 的blast (http :///Blast.cgi )中进行blast n 比对.运用Vector N TI Suite 6.0软件推导绞股蓝和已报道植物的SE 氨基酸序列,并进行相似性比对和构建系统进化树.2　结果与分析2.1　电泳结果绞股蓝鲨烯环氧酶基因的中间保守区序列、3′RACE 和5′RACE 的扩增产物电泳结果如图1所示,中间保守序列经PCR 扩增后得到约530bp 的片段(图1,A ),3′RACE 扩增出约1050bp 的片段(图1,B ),5′RACE 扩增出约800bp 的片段(图1,C ).2.2　PCR 产物的测序分别将PCR 产物进行测序,克隆的中间保守区序列、3′RACE 和5′RACE 片段分别为535、1030、802bp.2.3　生物信息学的分析2.3.1　绞股蓝鲨烯环氧酶基因cD NA 全长核苷酸序列分析　根据中间保守区序列、3′RACE 和5′RACE 扩增片段的测序结果,利用Vector N TI Suite 6.0软件拼接得到绞股蓝鲨烯环氧酶基因的全长序列.该基因全长为1818bp ,翻译起始位点位于57bp 处,polyA 信号位于1806bp ,开放阅读框共1578bp ,编码525个氨基酸残基(图2),相对分子质量为57.8Kda ,等电点(p I )值为9.04.氨基酸序列分析表明,绞股蓝SE 基因的氨基酸序列中含有52.4%的非极性疏水性氨基酸,26.1%极性中性氨基酸,9.0%酸性氨基酸,12.6%碱性氨基酸.将SE 序列提交至GenBank 获得登录号为FJ 906798.2.3.2　不同植物SE 基因的序列比较与进化分析　以绞股蓝SE 序列进行blast n 在线序列比对,结果表明来自葫芦科的绞股蓝SE 核苷酸序列与Gen 2Bank 中其它7个科的10种植物SE 基因的序列相似性较高,在73%～82%之间(表1),其推导的氨基酸序列与其它植物的SE 基因氨基酸序列的相似性在63.2%～79.4%之间(表1).从表1还可看出,不同植物来源的SE 氨基酸序列长度差别不大,均在519bp ～585bp 之间.植物SE 基因的核苷酸序列和氨基酸序列在整体上都表现出较高相似性,表明植物SE 基因在不同物种之间进化关系较近.运用Vector N TI Suite 6.0软件构建绞股蓝和GenBank 中7个科10种植物的18个SE 基因氨基酸序列系统进化树(图3),结果其构建出3个主要图1　绞股蓝SE 中间保守区序列(A )、3′RACE (B )和5′RACE (C )的扩增结果1.中间保守区序列扩增产物;2.3′RACE 产物;3.5′RACE 产物;M.DL2000Fig.1　G.pentaphy ll um SE f ragment amplified by conserved sequence (A ),3′RACE (B )and 5′RACE (C ),respectively1.Conserved sequence product ;2.3′RACE product ;3.5′RACE product ;M.DL20002251西　北　植　物　学　报 30卷图2　绞股蓝SE cDNA 核苷酸序列及推导的氨基酸序列粗斜体A T G 表示起始密码子;粗体加下划线T GA 表示终止密码子;小写字母表示5′和3′端非翻译区,大写字母表示编码区;上面表示核苷酸序列,下面为氨基酸序列Fig.2　Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence for SE cDNA f rom G.penta phy ll umA T G t he initiation codon is in bold and italics ;T GA t he termination codon is in bold and indicated by underlined ;Lowercase letters represent5′and 3′untranslation region ,Capital letters represent translation region ;above.Nucleotide sequence ;below.Amino acid squence32518期蒋军富,等:绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析分支.第Ⅰ个分支由7个基因构成,它们分别来自毛茛科的果黑种草、茄科的毛曼陀罗和印度人参、葫芦科的绞股蓝、大戟科的绿珊瑚、十字花科的拟南芥.其中,果黑种草、毛曼陀罗、印度人参聚为一类;绞股蓝与绿珊瑚、拟南芥聚为一类,说明绞股蓝与绿珊瑚、拟南芥的亲缘关系较近.第Ⅱ个分支由8个基因构成,它们主要来自五加科的辽东楤木、人参、三七.第Ⅲ个分支由来自于豆科蒺藜苜蓿和紫苜蓿的3个基因构成.在SE 基因系统进化树中,同属一个科目的植物SE 基因优先聚类合并,这与植物自然进化关系保持一致.聚类分析还发现,拟南芥SE (AB008021、NM_104624)(二者推导的氨基酸序列相似性为100%)没有与拟南芥SE (NM_119938、NM_127848)优先表1　绞股蓝SE 基因和已知其它植物的SE 基因核苷酸与推导的氨基酸序列相似性比较Table 1　Alignment of FJ 906798and some plant SE nucleotide sequences and amino acid sequences in G enBankGenBank 登录号Accession No.in GenBank SE 氨基酸长度Length of amino acid/bp科名Branch name种名Species相似性Similarity/%核苷酸Nucleotide 氨基酸Amino acid FJ906798525葫芦科Cucurbitaceae 绞股蓝Gy nostemma pentaphyllum 100100A Y995182529茄科Solanaceae 毛曼陀罗Datura innox ia7779.4GU574803531茄科Solanaceae 印度人参(睡茄)W ithania somni f era 7778.4AJ430609519豆科Fabaceae 蒺藜苜蓿Medicago truncatula 7777.8AJ430608526豆科Fabaceae 蒺藜苜蓿Medicago truncatula 7777.3DQ366569524豆科Fabaceae 紫苜蓿Medicago sativa 8276.8FJ232947521毛莨科Ranunculaceae果黑种草N igella sativa 7575.2AB253602531大戟科Euphorbiaceae 绿珊瑚Euphorbia tirucalli 7675.1AB003516539五加科Araliaceae 人参Panax ginseng 7573.1AB122078536五加科Araliaceae 人参Panax ginseng 7572.9NM_119938525十字花科Cruciferae 拟南芥A rabi dopsis thaliana 7372.9FJ393274545五加科Araliaceae 人参Panax ginseng 7672.8AB008021531十字花科Cruciferae 拟南芥A rabi dopsis thaliana 7472.3NM_104624531十字花科Cruciferae 拟南芥A rabi dopsis thaliana 7472.3DQ386734537五加科Araliaceae 三七Panax notoginseng 7472.2DQ457054537五加科Araliaceae 三七Panax notoginseng 7472.0GU354314547五加科Araliaceae 辽东楤木A ralia elata 7571.6NM_127848585十字花科Cruciferae拟南芥A rabi dopsis thaliana7363.2图3　不同植物SE 氨基酸序列进化树括号中为GenBank 登录号Fig.3　Phylogenetic tree based on amino acid sequence of SE in different plantsIn t he bracket s for GenBank accession No.4251西　北　植　物　学　报 30卷聚为一类,人参SE (FJ 393274)也没有与人参SE (AB003516、AB122078)优先聚类合并.这有可能是因为它们本为同一基因家族不同成员,进化结果不一致,因此产生这种差异;也有可能是同一基因诱导方式的不同而形成不同转录本,从而导致蛋白的表达产生差异[6].3　讨　论三萜皂苷是植物次生代谢产物的重要组成部分,具有重要的药用价值,探讨植物三萜皂苷生物合成途径及相关酶基因调控的影响,对实现三萜皂苷的工业化生产这一目标具有重要意义.三萜皂苷含量和组分主要取决于生物合成关键酶以及在细胞中的表达水平,从克隆与三萜皂苷合成密切相关的关键酶基因入手,阐明三萜皂苷生物合成及其调控机制,利用人工调控增加三萜皂苷在植物细胞中的产量,这将为提高药用植物的经济价值开辟新的途径.近些年来,三萜皂苷生物合成关键酶基因研究成为植物次生代谢工程研究热点,积雪草、三七、柴胡、西洋参、人参等多种中药材三萜皂苷合成途径部分关键酶基因相继被克隆和鉴定,如积雪草法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophaophate synthase ,FPS )[7],三七FPS [8]及鲨烯合酶(squalene synthase ,SS )[9],柴胡32羟基23甲基戊二酰辅酶A 还原酶(32hydroxy 232methylglutaryl coenzyme A reduetase ,HMGR )、异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomer 2ase ,IPPI )、FPS [10]及SE [11],西洋参和人参FPS ,SS ,SE ,HM GR ,达玛烷合酶(Dammarenediol 2Ⅱsynthase ,DS ),β香树脂合成酶(β2amyrin synthase ,β2AS )等基因[12].关于SE 基因转录和表达研究近年也有陆续报道.Choi 等[13]通过基因微阵列发现在人参发根的3134个表达序列标记(EST s )中,SE 等3个基因与三萜皂苷合成量高度相关,茉莉酸甲酯(MeJ A )可诱导SE 基因高表达增加三萜合成量;相反该酶在细胞分裂素活化蛋白激酶(MAP K )作用下发生磷酸化时,三萜合成量会大幅度降低[14].脱乙酰壳多糖(50μg/mL )可以使人参SE 转录水平提高[15].而国内外对于绞股蓝皂苷生物合成关键酶基因研究尚未见报道.本研究首次克隆并报道了绞股蓝SE cDNA 全长序列,为进一步研究三萜皂苷生物合成机制及其在提高植物药用价值方面的应用奠定基础.近年来随着生物技术的不断发展,出现了许多克隆新基因的方法和手段,如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA 差异显示技术、二基因组减法技术以及cDNA 文库筛选技术等.cDNA 完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要.但上述方法多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点.RACE 技术是1988年Froh 2man 等[16]发明的一种基于PCR 从低丰度的转录本中快速扩增cDNA 的5′和3′末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势成为获得全长cDNA 的一种重要手段.RACE 技术成功应用于基因的分离[17219],充分显示了其广阔的应用前景.本研究通过酶的保守区域设计引物,采用RACE 技术,首次在绞股蓝中获得了SE cDNA 的全长序列.SE cDNA 全长序列的获得,一方面,可利用RNA 干扰技术进一步研究绞股蓝SE 基因编码区与调控序列;另一方面,还可以构建相应的表达载体对其功能进行深入分析,以阐明绞股蓝三萜皂苷生物合成的分子基础,探索提高绞股蓝三萜皂苷含量的有效方法.参考文献:[1]　ZHAN G Y F (张云峰),WEI D (魏　东),DEN G Y R (邓雁如),GUO S Y (郭祀远),CH EN F (陈　峰).Research development s on t he bio 2logical activities of triterpene saponins[J ].Chinese T raditional Patent Medicine (中成药),2006,28(9):1349-1353(in Chinese ).[2]　GOLDSTEIN J L ,BROWN M S.Regulation of t he mevalonate pat hway[J ].N at ure ,1990,343(1):425-430.[3]　L IU F ,REN D ,GUO D ,PAN Y ,ZHAN G H ,HU P.Met hod development for gypenosides fingerprint by high performance liquid chroma 2tography wit h diode 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暴马桑黄gpd启动子的克隆与序列分析

１０．
１３２６８/
cnk
i．
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i
c．
２０２１．
０３．
００２
j．
暴马桑黄 gpd 启动子的克隆与序列分析
王淑婷,唐玉倩,刘增才,邹莉 ∗
(东北林业大学林学院,哈尔滨１５００４０)
摘要:暴马桑黄药用价值很高,但是其含有的一些药用成分含量很低,运用基因工程技术对暴马桑黄进行改造,
效.其良好的药用效果主要源于其含有的多糖、黄
酮、酚类、三萜等活性成分 [６Ｇ７]. 但是这些成分在暴
马桑黄中含量很低 [８],难以满足生产需求.近年来,
随着分子生物技术的发展,利用基因工程定向培育
优质的暴马桑黄菌株成为一种可靠的技术手段,目
到的 DNA 为模板,
gpdＧF 和 gpdＧR 为引物,对暴
马桑黄 gpd 启动子序列进行 PCR 扩增.PCR 扩增
产物用琼脂凝胶电泳检测,纯化回收后检测回收产
物浓度. 将纯化回收的 gpd 启动子序列与
PMD１８
ＧT 载体相连接并转化进入 DH５α 感受态细
a
s启动子,另一种则是 gpd 启动子１２ .
Hi
r
ano 等在１９９９年从香菇中分离出 gpd 启动子,
将其用于香菇转化体系的构建,结果显示该体系比
[ ]
r
a
s启动子转化体系的表达效率高１３ ,这说明 gpd

一株多环芳烃降解菌的鉴定及GST基因克隆和序列分析_夏颖

43卷　6期2003年12月微生物学报Acta Microbiologica SinicaVol .43December No .62003基金项目:国家“863计划”(2002A2104101);国家自然科学基金(30370048)＊通讯作者。

Tel :86-571-86971287;Fax :86-571-86971634;E -mail :minhang @z ju .edu .cn作者简介:夏　颖(1977-),女,安徽宿州人,博士研究生,从事环境微生物研究。

E -mail :xiaying7702@sohu .com 收稿日期:2003-01-28,修回日期:2003-07-31一株多环芳烃降解菌的鉴定及GST 基因克隆和序列分析夏　颖闵　航＊(浙江大学生命科学学院　杭州　310029)摘　要:由石油污染土壤中分离到一株能以多环芳烃(菲、芴、萘)为唯一碳源的细菌,经形态观察、生理生化(Biolog -GN )和G +C mol %分析,鉴定该菌为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingo monas paucimo bilis )。

与16S rDNA 序列同源性的比较进一步确证了鉴定结果。

经菲诱导后的细菌谷胱甘肽S -转移酶(Glutathione S -transferase ,GST )酶活明显高于未诱导前,表明谷胱甘肽S -转移酶可能与多环芳烃的降解有关。

根据该酶基因的同源性序列设计引物,PCR 扩增出编码谷胱甘肽S -转移酶基因片段,进一步证实在该菌中有GST 的存在。

测序后基于编码GST 的基因所进行的系统发育分析表明,该多环芳烃降解菌与其它多环芳烃降解菌在进化上亲缘关系较近。

关键词:鞘氨醇单胞菌,谷胱甘肽S -转移酶,系统发育中图分类号:X172 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2003)06-0691-07多环芳烃(Poly -aromatic hydr ocar bons ,PAHs )是一类广泛分布的化学污染物,因其潜在的毒性、致癌性及致畸致变作用引起了人们的极大关注[1]。

黄芪鲨烯合酶基因的克隆和序列分析

作者简介：李振秋（９４，，１７一）男河北行唐人，副教授，士。研究方向：物次生代谢工程。博植
第１期
１２方法．
李振秋等：黄芪鲨烯合酶基因的克隆和序列分析
Ⅺ
１７
；呈
平板上筛选，阳性菌落送测序公司进行测序。
１２１总ＲＡ的提取和第一链ｃＮ的合成及检．．ＮＤＡ测取黄芪幼苗根茎叶０１ｇ．于液氮冷冻研磨后按照传统ＴＩＯＲＺＬ法和植物总ＲＡ离心柱式提取试剂Ｎ盒的说明进行ＲＡ的提取，按逆转录试剂盒说明Ｎ并
Ｔ ℃ＡＣｒ１】１ｒＧＧＴＡ（ｔＧ＿Ｃ［、Ｇｎｒｎ１ＡＡＧＧｒＧＩＧＧＧＡＧｒＩＧＧ、Ｇｒ ’ ｒＧＡＧＡＴＧＣＡｌ；ＴＧＧＡＧＩＧＧＧＡＣ１（ＡＴＧＣＡ；ＧＧＡＧ兀ＴＧｒＧＧＡＧＡ０ＣＴ
ｒｇ１Ｔｅｒｓｌｆ — ｅｎＲＰＲｉ，ｎ如ｉ．ｈｕｓｐａｔＴ— ＣｎＡ．卯，日ｅｔｏｉ
２３黄芪鲨烯合酶ｃＮ．ＤＡ基因序列的克隆以上述方法获得的逆转录产物为模板，Ｓ系用
列引物分别和ＺＸ进行ＰＲ，Ｃ扩增序列５部分，果结
ｂｎｅｕｆｈ）Ｂｅ中克隆了鲨烯合酶基因ｃＮｒａｅｓ（ｓ．ｇ）ａｉＤＡ序列（ｅＢｎ登录号Ｈ８９７）ＧｎａｋＱ２９４。通过ＢＡＴ发现黄芪鲨ＬＳ烯合酶推测的氨基酸序列与大豆鲨烯合酶（Ａ２５９１序列相似性最高，到了８％。黄芪鲨烯合酶的克ＢＡ２５．）达８隆为以后通过基因转化提高黄芪皂苷含量亦或通过生物工程手段生产黄芪皂苷打下基础。

桑黄9个萜类合成酶基因的鉴定及表达分析

粉为氮源的培养基中表达量最高。基因簇分析显示，SsTPS1和SsTPS4编码基因所在contig有基因簇的存在。
关键词：桑黄；萜类合成酶；生物信息学分析；基因表达
中图分类号：Q786
文献标识码：A
文章编号：2096-0018(2021)04-0402-08
Identification and expression analysis of nine terpene synthase genes in Sanghuangporus sanghuang
萜类化合物又称类异戊二烯类化合物，是地球上最大、结构和功能最丰富的一类天然化合物，到目前为止，已发现了 80 000多种不同结构的萜类化合物，按碳原子数目分为单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)和多萜等；按照碳环数分为链萜、单环萜、双环萜和三环萜等萜类化合物有抑菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤及增强机体免疫力等功能［2］,具有巨大的医学及商业潜力。萜类化合物在高等真菌中的含量极为丰富，高等真菌中的萜类化合物主要有倍半萜、三萜等，倍半萜类化合物是高等真菌中结构最丰富的一类，三萜类也是其主要的次生代谢产物［3］o研究发现，高等真菌中不同类型的萜类在抗癌、抗病毒等方面具有显著的作用，如THANH et aZ［4］从火木层孔菌(Phellinus igniarius)子实体中分离得到一个新的三萜化合物对MCF-7等肿瘤细胞株具有较好的抑制作用; SANDARGO et al［5］从掌状玫耳(Rhodotus palmatus )中分离的12个倍半萜类化合物可显著抑制丙型肝炎病毒。
Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China)

赵云生,男,汉族,1974年8月生,副教授,硕士生导师。

赵云生，男，汉族，1974年8月生，副教授，硕士生导师。

1997年毕业于山西农业大学药用植物专业，同年入职山西省农科院经济作物研究所工作，任该所学术委员会委员，药材课题组负责人。

2002～2009年先后在成都中医药大学获生药学硕士与中药学博士学位。

现为宁夏医科大学药学院中药系副主任，承担《天然药物化学》、《中药化学》、《生物技术制药》与《中药栽培学》四门课程的教学任务。

2012年获宁夏医科大学优秀教师暨师德标兵称号。

1997年以来先后参与或主持各级科研项目22项，其中主持国家自然科学基金面上项目等科研项目13项，参加科研项目9项，发表论文25篇，其中第一作者或通讯作者论文20篇，申报专利3项，申报科技成果1项，选育并审定“远志”新品种1个，参编专著1部。

近五年来作为第一负责人累计科研经费180万元左右。

研究方向：天然药物活性成分与资源研究，研究内容如下：（1）天然药物活性成分研究；（2）中药质量控制与道地药材驯化栽培研究；（3）药效成分细胞生产研究。

主持或参加科研项目：（1）2013～2016年主持国家自然科学基金资助面上基金项目“栽培远志质量形成限制因子及质量追溯系统构建研究”（编号：31270381，经费70万）。

（2）2012～2015年主持国家自然科学基金资助地区基金项目“麻黄道地药材形成生境与遗传机制研究”（编号：81160505，经费54万）（3）2012～2014年主持“第四次全国中药资源普查”子课题（经费待定）。

（4）2010~2012年主持宁夏自然基金项目“甘草多糖提取分离与药理活性研究”（编号：NZ10110，经费5万）；（5）2012～2013年主持宁夏卫生厅项目“回药寄马桩药材基源鉴定研究”（编号：2012129，经费0.2万）（6）2011～2014年第二主持国家科技支撑计划子课题“黄芪质量标准提高及其综合利用研究”（编号：2010BAE00390-4-2，经费87.7万，排名第2）（7）2013～2016年参加国家自然科学基金资助地区基金项目“缺血性卒中的生物学基础和回药木香油方的干预研究”（编号：31270381，经费49万，排名第2）。

野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

品）连接，组质粒转化人大肠杆菌ＤＨ５感受态重ａ
因的克隆、序列分析及转录表达谱研究，旨在为进
步了解该基因的功能奠定基础．
１材料与方法
Байду номын сангаас１１实验材料．
菌株后，过蓝白斑筛选，阳性克隆菌液送上海通将
性质及功能进行了研究口，对昆虫漆酶的研究但报道极少．酶主要参与昆虫表皮的硬化过程，漆对昆虫的成活至关重要［迄今尚未见有关野桑蚕１．漆酶基因的研究报道，实验通过对野桑蚕漆酶基本
第４６卷第４期
２１０２年８月
华中师范大学学报（自然科学版）
ＪＯＵＲＮＡＩＯＦＨＵＡＺ０ＮＧＨＮＯＲＭＡＬＵＮＩＶＥＲＳＴＹ（ｔＳｉ）ＩＮａ．ｃ．
Ｖｏｌ４ＮＯ＿６．４
Ａｕｇ．２２０１
文章编号：１０ — １０２１）４０６ — ５００１９（０２０ —４８０
野桑蚕漆酶基因克隆、列分析及转录表达谱研究序
张永亮，武安泉，盛东峰，张杰
（口师范学院生命科学系，南周口４６０）周河６０１
漆酶基因开放阅读框序列．向引物序列：Ｔ— 正５ＴＧ
ＧＴＴＡＡＣＧＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡ３；向引物序列：Ｃ反