离子交换层析剂的种类
蛋白纯化离子交换层析
蛋白纯化离子交换层析离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。
离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。
常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。
根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。
例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。
根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。
强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类；在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。
根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。
一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。
离子交换柱层析原理
离子交换层析介质的应用离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。
现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。
子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
1.离子交换层析的基本原理：离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。
离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。
几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。
由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。
目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。
2.离子交换层析介质：离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。
离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。
平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。
离子交换层析
样品进柱
离子交换层析的基本操作
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数
样品洗脱
恒定洗脱
离子交换层析的基本操作
分子浓度 离子强度
pH值
阶段洗脱
梯度洗脱
弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换树脂：
最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物
离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
离子交换层析
离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本操作
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为 流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混 合物中不同离子进行分离的层析技术。
离子交换介质的基本性质
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换葡聚糖：
离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G） Sephadex的优点如下：
亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核 酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小
10 20 30 40 50 60 70 80 90
离子交换层析柱子的选择
离子交换层析技术离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
（一）原理在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。
如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。
在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。
当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。
纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。
反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。
溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。
反之则越少。
血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和球蛋白。
在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。
由于各种蛋白质所带的电荷不同。
它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。
交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。
当Cl一的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl一浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。
因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。
离子交换层析讲解
三、离子交换剂的种类和性质 1.离子交换剂的基质
• 其中：聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以
苯乙烯和二乙烯苯合成的具大、流速快。但它与 水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变 性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、 核苷酸等。 以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚 糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交 换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子 物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50 为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基 质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
离子交换层析
原理及应用
一、简介
• 1、定义：
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换 剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力 大小的差别而进行分离的一种层析方法
2、发展历程
• 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交
二、基本原理 阴离子交换
• 通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子
强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加， 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上 的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置 换出来，随洗脱液流出。 与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来， 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度 才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与 离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下 来，从而达到分离目的。
X+ Y-↔ A-
二、基本原理
• 从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交 •
离子交换层析
以Sepharose CL－6B 为载体，引入电荷基团制成的。
二、性质
（一）颜色与形状 树脂类离子交换剂颜色很多，褐色、黄色、乳白
色等；亲水性的离子交换剂基本都是白色的。 （二）交联度：交联剂在载体中所占的百分数。
树脂交联剂为二乙烯苯，交联葡聚糖和纤维素 的交联剂为3-氯代-1，2-环氧丙烷，琼脂糖交 联剂2，3-二溴丙醇
亲水性离子交换剂的载体是一类天然的或人 工合成的、与水结合力较大的物质。
常用的有纤维素(Cellulose) 、交联纤维素 (Sephacel) 、交联葡聚糖(Sephadex) 、交联琼 脂糖(Sepharose) 。
引入电荷基团
1、纤维素离子交换剂
交换剂
名称-纤维素
阴离子 交换剂
二乙基氨基乙基 氨乙基
R-N(CH3)3-Cl＋OH –
弱碱性： R-NHCH3 OH ＋Cl – R-N(CH3)2-Cl＋OH –
1
2
3
4
5
起始缓冲 液中的反 离子
1. 平衡阶段: 离子交换剂与反离子结合
2. 吸附阶段：样品与反离子进行交换
样品液中的 离子
洗脱液中的 离子
3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ吸附物质，后洗下强 吸附物质
实用的离子交换剂应满足下列要求
有高度的不溶性 有疏松的多孔结构和巨大的比表面积 有较多的交换基团 有稳定的物理化学性质
一、分类
根据载体的组成和性质分为：
（一）疏水性离子交换剂 （二）亲水性离子交换剂
（一）疏水性离子交换剂 载体是一种人工合成的、与水结合力小 的树脂物质。苯乙烯和二乙烯苯的聚合 物，海绵状结构。
3、琼脂糖离子交换剂
离子交换柱层析原理
离子交换层析介质得应用离子交换层析分离纯化生物大分子得过程,主要就是利用各种分子得可离解性、离子得净电荷、表面电荷分布得电性差异而进行选择分离得。
现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁得纯化技术之一。
离子交换层析(IｏｎExcｈａnｇｅChromatｏgraphｙ简称为IＥC)就是以离子交换剂为固定相,依据流动相中得组分离子与交换剂上得平衡离子进行可逆交换时得结合力大小得差别而进行分离得一种层析方法。
离子交换层析就是目前生物化学领域中常用得一种层析方法,广泛得应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等得分离纯化。
1、离子交换层析得基本原理:ﻫ离子交换层析就是通过带电得溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化得方法,也可以认为就是蛋白质分子中带电得氨基酸与带相反电荷得介质得骨架相互作用而达到分离纯化得方法。
离子交换层析法主要依赖电荷间得相互作用,利用带电分子中电荷得微小差异而进行分离,具有较高得分离容量。
几乎所有得生物大分子都就是极性得,都可使其带电,所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子得分离、中等纯化及精制得各个步骤中。
由于离子交换层析法分辨率高,工作容量大,并容易操作,因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立得操作单元,也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化得一种重要得方法。
目前,在生化分离中约有75%得工艺采用离子交换层析法。
2、离子交换层析介质:离子交换层析得固定相就是离子交换剂,它就是由一类不溶于水得惰性高分子聚合物基质通过一定得化学反应共价结合上某种电荷基团形成得。
离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团与平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电得可进行离子交换得基团。
平衡离子就是结合于电荷基团上得相反离子,它能与溶液中其它得离子基团发生可逆得交换反应。
平衡离子带正电得离子交换剂能与带正电得离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电得离子交换剂与带负电得离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。
离子交换层析法
离子交换层析法离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。
⒈离子交换剂预处理和装柱：对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。
溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。
阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。
已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。
为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。
⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。
样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。
为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。
柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。
洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。
为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH 或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。
由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。
最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。
离子交换层析法
离
子
+ OH-
交 换 R-N+（CH3）2 OH- + H2O == R-N+（CH3）2
剂
H·OH-
2．亲水性离子交换剂
磷酸纤维素 CM-纤维素 DEAE-纤维素 CM-交联葡聚糖 DEAE-交联葡聚糖 CM-Sepharose CL-6B
二、离子交换剂性质
颜色与形状 交联度 吸水量或膨胀度 交换容量 稳定性 比重
CA 、CB ＝梯度混合器A瓶、 B瓶的浓度； A1 、B1 ＝A瓶、B瓶的横切面积； V2＝流经层析柱的体积，V1＝梯度洗脱液的总体积。
线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清 白蛋白的图谱
第五节 离子交换拄层析应用
一、去离子水的制备 二、制备、纯化生命物质 二、测定蛋白质的等电点
一价离子：Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+ 二价离子：Mg2+＜Ca2+＜Sr2+＜Ba2+ 一价阴离子：F-＜Cl-＜Br-＜I不同价阳离子：Na+＜Ca2+＜Al3+＜Ti4+
磺酸基树脂和季胺基树脂 对各种离子的相对选择系数
阳离子树脂
反离子 相对选择系数
H+
1.0
Na+
1.5
NH4+
1.95
2、缓冲液离子组成的选择
①缓冲液离子的pK值要接近所用的pH， ②采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，
如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐 ③采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，
如：Tris ④缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、
溶解度。
3、缓冲液离子强度的选择
①起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换 剂结合，一般小于0.1mol/L。
UniGel
UniGel®离子交换层析介质产品使用说明书文件编号：NM-W-DF-0102版本号：A0UniGel®层析介质使用说明产品简介离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是根据生物分子表面电荷（种类、数目和分布）差异实现对不同生物分子的分离的方法，纳微科技提供基于单分散均一粒径和多分散聚合物微球的离子交换层析介质，经过亲水表面改性后再键合离子交换基团，根据应用需求的不同提供多系列产品，可以满足捕获、中度纯化、精细纯化以及分析纯化各环节的应用，具有卓越的生物分子相容性和柱床稳定性，为客户提供生物样品从实验室纯化到工业化生产的整体解决方案。
表1. 离子交换功能团分类及用途注：1.流动相pH介于pI和pKa之间;2.流动相p H与待分离样品等电点差1.0 pH;3.pH<3.0宜选用强阳交换介质，pH>10.0宜选用强阴交换介质。
图1. UniGel®系列离子交换层析介质实物图UniGel®离子交换层析介质的优势1) 超高动态载量，一般每毫升结合>105 mg 溶菌酶（阳离子交换）和>90 mg BSA（阴离子交换）；2) 可提供粒径30/50/65/80 μm 等多种不同粒径的离子交换介质以满足中纯到精纯的需求；3) 填料装柱压缩系数和溶胀系数小（远低于琼脂糖和葡聚糖凝胶），柱床稳定性高；4) 高强度的基质可以使用更快的流速和更高的柱床，提高纯化效率；5) 优越的耐碱性，可以有效延长使用寿命，提高生产效率，降低成产成本，提升企业效益。
表2. UniGel® 离子交换层析介质参数总览表3. UniGel ®离子交换层析介质其他技术参数总览注：1、动态吸附载量：阳离子用溶菌酶（Lysozyme ），阴离子用牛血清白蛋白（BSA ）/2、pH 值稳定范围是指使用、再生和在位清洗的pH 区间表4. UniGel ®系列离子交换层析预装柱参数信息注：对于特殊规格需求，提供专业化客户定制服务。
离子交换层析
子构成的!!基质与电荷基因以共价键连 接!!电荷基因与反离
子以离子键结合？？
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以
离子交换方式进行!!假设以RA+代表阳离子交换剂!!其中A+为
反离子!!A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应!!反
应式为：RA++B+
RB++A+
离子交换色谱中所进行的离子交换过程【以阳离子交换树脂为例】
㈡ 交联度和网孔结构
交联度的大小影响着离子交换剂的很多特 性!!包括机械强度、膨胀度、网孔大小、 交换容量等？？
一般交联度越高!!网孔的孔径越小!!交联度 越低!!网孔孔径越大？？仅琼脂糖交换剂 是例外.
㈡ 交联度和网孔结构
分离介质的孔有三种结构？？第一种通过交联 使大分子链间形成孔!!这叫凝胶孔？？
离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机 离子或生物大分子物质分开!!其主要依据是离子交换剂对 各种离子或离子化合物有不同的结合力？？
氨基酸的离子交换分离原理
8
What happens in ion exchange?
Equilibration
anion exchange
bead
+-- ++--+++---
两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离 子交换剂的结合力!!主要取决于它们的物理化学性质和在 特定pH条件下呈现的离子状态？？当pH低于等电点【pI】 时!!它们带正电荷能与阳离子交换剂结合!!反之!!pH高于 pI时!!它们带负电荷能与阴离子交换剂结合 ？？pH与pI 的差值越大!!带电量越大!!与交换剂的结合力越强？？
离子交换层析说明书
离子交换层析说明书CM Bestarose Fast FlowDEAE Bestarose Fast FlowQ Bestarose Fast FlowSP Bestarose Fast FlowCM, DEAE, Q and SP Bestarose 快速离子交换剂属于分离介质的一部分,主要为色谱工作服务，所有的介质都经过严格的控制生产从而保证其能够满足工业生产的需求。
为了正确操作以便得到最好的分离效果，请在使用前阅读该手册。
目录1. Bestarose 快速离子交换剂的特性 32. 装柱指南123. 装柱评价144. 保养175. 疑难解答17-19 1.Bestarose Fast Flow离子交换剂的特性Bestarose Fast Flow离子交换剂是以高度交联的琼脂糖为基质，它的化学、物理性质稳定，即离子载量、洗脱情况、反压及流量等特性不受层析和清洗过程中溶液的影响，详见下表。
高物理稳定性使它能在低背压下提供快速液流，在柱高15cm，1 bar压力下，它的流速可达300-700cm/h，见图1。
另外，刚性介质体积基本不因pH和离子强度的变化而变化。
线性流速图1. Bestarose 快速离子交换剂典型的压力/流速曲线。
CM Bestarose Fast Flow离子交换剂的特性CM Bestarose Fast Flow是一种弱阳离子交换剂，离子交换基团是羧甲基，如下：-O-CH2COO-表一. CM Bestarose Fast Flow 特性。
项目指标离子交换剂类型弱阳离子总离子载量0.09-0.13mmol/ml排阻限4×106（球形蛋白）骨架6%交联琼脂糖颗粒类型球形，45-165μm流速300–600 cm/h*工作温度4–40°C工作pH 见图2pH稳定性2-14(短期，CIP)4-13（长期）化学稳定性适合所有的缓冲体系1M NaOH8M Urea6M GuHCl70%乙醇避免事项氧化剂长期暴露（1星期，20°C）pH<4*15cm柱高，1 bar压强，25℃，XK 50/30 柱。
离子交换层析
上样及洗脱的一般规律：
在高盐浓度条件下，蛋白质与固定相疏水缔合；浓度降低时，疏水作用减弱，逐步被洗脱下来。一般用pH 6-8的盐水溶液[如（NH4）2SO4]。盐的浓度影响蛋白质的疏水性，从而影响蛋白质的保留值。
盐：Na2SO4，KH2PO4，NaHPO4，(NH4)2SO4，NH4OAc，KOAc，NaOAc，NaCl
多缓冲剂：
多缓冲剂是两性电解质缓冲剂，由相对分子质量大小不一的各种多羧基多氨基化合物组成，存在各自的等电点。常用的多缓冲剂有Pharmacia公司生产的Polybuffer 96、Polybuffer 74和Pharmalyte等，缓冲pH范围分别为pH 9-6，pH 7-4和pH 10.5-8。在相应的缓冲pH范围内，各种多缓冲剂具有均衡的缓冲容量，在层析聚焦操作中提供平滑的pH梯度。
（3)疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。
羟基磷灰石层析
羟基磷灰石（hydroxyapatite, HAP):是一种磷酸钙晶体，基本分子结构为
一般认为，HAP的吸附主要基于钙高子和磷酸根离子的静电引力，即在HAP晶体表面存在两种不同的吸附晶面，各存在吸附点c点和P点，前者起阴离于交换作用，后者起阳离于交换作用．因此，在中性pH环境下酸性蛋白质(pI<7)主要吸附于c点，碱性蛋白质(PI>7)主要吸附于P点．利用磷酸盐缓冲液(K2HP04+KH2PO4）为流动相洗脱展开时，磷酸根离子在c点竞争性吸附，交换出酸性蛋白质，而K+在P点竞争性吸附，交换出碱性蛋白质。所以HAP层
POROS介质的大比表面积和溶质吸附容量。同时，扩散孔道长度小于lm，溶质扩散所需时间极短，大大降低了利用传统介质进行层析分离的扩散传质阻力。
离子交换层析原理
简介离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中の组分离子与交换剂上の平衡离子进行可逆交换时の结合力大小の差别而进行分离の一种层析方法。
1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。
本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性の聚苯乙烯离子交换树脂。
50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸の分析。
目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用の一种层析方法，广泛の应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等の分离纯化。
基本原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂の结合力不同而进行分离纯化の。
离子交换层析の固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水の惰性高分子聚合物基质通过一定の化学反应共价结合上某种电荷基团形成の。
离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电の可进行离子交换の基团。
平衡离子是结合于电荷基团上の相反离子，它能与溶液中其它の离子基团发生可逆の交换反应。
平衡离子带正电の离子交换剂能与带正电の离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电の离子交换剂与带负电の离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。
其中R代表离子交换剂の高分子聚合物基质，X- 和X+ 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合の电荷基团，Y+ 和Y- 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂の平衡离子，A+ 和A- 分别代表溶液中の离子基团。
从上面の反应式中可以看出，如果A离子与离子交换剂の结合力强于Y离子，或者提高A离子の浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。
也就是说，在一定条件下，溶液中の某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析の基本置换反应。
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第一节 层析的基本原理与分类
• 一、层析分离的基本原理与特点 • （一）基本原理 • 层析分离是一种物理的分离方法，利用多 组分混合物中各组分物理化学性质的差别， 使各组分以不同的程度分布在两个相中。
• （二）层析分离具有如下基本特点 • 优点：（l）分离效率高。 • （2）应用范围广。 • （3）选择性强。 • （4）设备简单，操作方便。 • 缺点：处理量小、操作周期长、不能连续 操作，因此主要用于实验室，工业生产上 还应用较少。
上 样
三、吸附柱层析的基本操作与应用
在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱剂，进行梯 度洗脱，各组分先后被洗出。若用50g吸附剂，一般 每份洗脱液量常为50rnLo但若所用洗脱剂极性较大 或各成分的结构很近似时，每份的收集量要小。
洗 脱
整个操作过程必须注意不使吸附柱表面的溶液流干， 即吸附柱上端要保持一层溶剂。此外，应控制洗脱 液的流速，流速不应太快。着流速过快，柱中交换 来不及达到平衡，因而影响分离效果。
（三）层析的基本概念
• • • • • • 1.固定相 2.流动相 3.分配系数及迁移率（或比移值） 4.分辨率（或分离度） 5.正相色谱与反相色谱 6.操作容量（或交换容量）
二、层析分离技术的分类
（一）依操作形式分 分为纸层析、薄层层析和柱层析。
（二）依流动相分 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气 相层析。
（三）依分离机理分 1.吸附层析 2.分配层析 3.凝胶过滤 4.离子交换层析 5.亲和层析 6.疏水层析
第二节 层析分离的基本操作技术
一、柱层析基本操作技术 （一）柱层析的基本装置 1、固定相 2、流动相 3、收集系统 4、检测系统 5、蠕动泵
（二）柱层析系统的基本操作技术
1.装柱 2.平衡 3.加样 4.洗脱 5.流速控制 6.分部收集 7.洗脱峰检测、合并收集 8.层析介质的再生
（四）离子交换剂的选择、处理和保存 1、离子交换剂的选择 取决于被分离的物质在其稳定的pH值下所 带的电荷，离子交换层析柱的分辨率和流 速也都与所用的离子交换剂颗粒大小有关。 2、离子交换剂的处理和保存 处理：干粉状的离子交换剂首先要进行膨 化，再用酸碱分别浸泡 3、离子交换树脂的选择依据
三、离子交换柱层析的操作与应用
第四节 离子交换柱层析
• 一、原理与特点
离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂 的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相 是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物
基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。
电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行 离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子， 它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离 子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用， 称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电 的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。
（2）湿法装柱 将吸附剂加入合适量的色谱最初用洗脱剂调成稀糊 状，先把放好棉花、砂子的色谱柱下口打开，然后 徐徐将制好的糊浆灌人柱子。注意，整个操作要慢， 不要将气泡压人吸附剂中，而且要始终保持吸附剂 上有溶剂，切勿流干，最后让吸附剂自然下沉。当 洗脱剂刚好覆盖吸附剂平面时，关紧下口活塞。
三、吸附柱层析的基本操作与应用
（1）湿法上样 把被分离的物质溶在少量色谱最初 用的洗脱剂中，小心加在吸附剂上层，注意保持吸 附剂上表面仍为一水平面，打开下口，待溶液面正 好与吸附剂上表面一致时，在上面撒一层细砂，关 紧柱活塞口。
（2）干法上样 多数情况下，被分离物质难溶于最 初使用的洗脱剂，这时可选用一种对其溶解度大而 且沸点低的溶剂，取尽可能少的溶剂将其溶解。在 溶液中加入少量吸附剂，拌匀，挥干溶剂，研磨使 之成松散均匀的粉末，轻轻撒在色谱柱吸附剂上面， 再撒一层细砂。
固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状 结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子，小 的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于凝胶颗粒之 外，因而具分子筛的性质。又因整个层析过程一般不变换洗 脱液，好像过滤一样，故也称凝胶过滤。
二、离子交换层析剂的种类
（一）离子交换剂的基质 （二）离子交换剂的电荷基团 根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换 剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。 （三）交换容量 交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离 子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子 交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总 量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有 关。
（一）离子交换柱层析的操作 1．层析柱 2．平衡缓冲液 3．上样 4．洗脱缓冲液 5．洗脱速度 6．样品的浓缩、脱盐 （二）离子交换柱层析的应用 1.水处理 2.分离纯化小分子物质 3.分离纯化生物大分子物质
第五节 Байду номын сангаас胶柱层析
一、凝胶层析的原理
凝胶层析又称分子排阻层析、分子筛层析或凝胶过 滤。它是指混合物随流动相经固定相（凝胶）的层 析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分 离的技术。
• 一、吸附层析的原理与特点 基本原理同吸附薄层色谱法。 • 二、吸附剂的选择 • 常用的吸附剂除氧化铝、硅胶和聚酞胺外， 还有活性炭。 • 吸附剂的种类很多，而对吸附剂的选择尚 无固定的法则，一般需通过小样实验来确 定。
三、吸附柱层析的基本操作与应用
（1）干法装柱
装 柱
在柱下端加少许棉花或玻璃棉，再轻轻地撒上一层 干净的砂粒，打开下口，然后将吸附剂经漏斗缓缓 加入柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松紧一 致，最后，将色谱柱用最初洗脱剂小心沿壁加入， 至刚好覆盖吸附剂顶部平面，关紧下口活塞。
二、纸层析基本操作技术
• • • • （一）滤纸 （二）展开剂 （三）操作方法 （四）在抗生素中的应用
三、薄层层析基本操作技术
（一）基本原理 （二）吸附剂和展开剂的选择 （三）基本操作 1.薄层板的制备 2.样品的预处理 3.点样、展层与显色 4.影响Rf的主要因素 5.薄层色谱法的应用
第三节 吸附柱层