珠三角地区猪圆环病毒2型的分离鉴定及序列分析

小量提 取试 剂 盒 、 ｘ Ｔ ｑＤ Ｅ ａ ＮＡ 聚合 酶 购 于宝 生 物 工 程 （ 连 ） 限公 司 ， Ｃ 一 大 有 Ｐ Ｖ ２阳 性血 清 、 性 血 清 阴
Ｐ Ｖ ２ 可引起 断奶 后 仔猪 多 系统 衰竭 综 合征 （ Ｍ— Ｃ －） Ｐ ＷＳ 、 ） 猪皮炎 肾病 综 合 征 （ Ｄ ） 繁 殖 障 碍等 相 关 Ｐ ＮＳ 、
２ 结 果
２ １ 病料 Ｐ ． ＣＲ 扩 增 结 果
．
： １ｔ ｕｆ ｆ
Ｐ Ｖ２ Ｃ － 标准 阳性 血清 ， 照组加 阴性血 清 ，７℃温育 对 ３
１ｈ 再用 Ｐ Ｓ洗 涤 ３次 ， 次５ｒｉ； ＦＴ ； Ｂ 每 ｎ 加 Ｉ Ｃ标 记 的 ａ 羊抗 猪 ＩＧ染 色 ，７℃温育 ｌｈ 最后 用 Ｐ Ｓ洗 涤 ３ ｇ ３ ； Ｂ
接种 到有 Ｐ —５的 ｌ Ｋｌ ２孔细胞 板上 ， 每个 梯 度接种 ８ 孔， 按照 １２ ５的方法处理 后 ， 间接 免疫 荧光 试 验 ．． 用 测病 毒 的 Ｔ Ｉ ５。 Ｃ Ｉ 。 ）
１２ ８ 全 基 因 组 序 列 Ｐ ． ． ＣＲ 的 扩 增 用 Ｐ Ｐ４和 ３、
ｔ ｔ
物 Ｐ５ ５＿ ： ，ＡＣＡＴＧＧＴＴＡＣＡＣＧＧＡＴＡＴＴＧＴ一 下 ３，
１ 材料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
１ １ １ 细 胞 和病 料 无 Ｐ Ｖ １污 染 的 Ｐ １ ． ． Ｃ 一 Ｋ一５细
游 引 物
Ｐ ： ５一 ６ ＡＡＴ Ｔ ＡＣ ＴＡＣ Ｃ Ｃ Ｔ— ＡＧ Ｇ ＡＣ
以上 引物 由上海生 物工程 技术 服务 有限公 司合 成 。 １ ２ ３ 模 板 的 制 备 １ ． ． ３份 病 料 研 磨 后 用 组 织
Ｄ ＮＡ 提取 试剂盒 抽提 Ｄ ＮＡ， 一２ 于 Ｏ℃保存 。 １ ２ ４ 病 料 的 Ｐ Ｒ检 测 ．． Ｃ Ｐ Ｒ 的反 应体 系 ： ＮＡ Ｃ Ｄ
法对这些毒 株进行 全基 因扩 增及 测序 分析 。结果 显示 ， 接毒 细胞 内观察 到 了特 并性 免疫 荧光 ， 在 ８株 Ｐ Ｖ ２ Ｃ － 分 离株与 Ｇ ｎ ａ ｋ 中的其 他 Ｐ Ｖ ２基 因组 同 源性 在 ９ ． ～ ９ ． 之 间， 株 间 同 源性 在 ９ ． ～ ｅＢ ｎ Ｃ 一 １２ ９８ 毒 ４２
６
动 物 医学 进 展
２１ ０ １年
第３ ２卷
第 ５期 （ 第 ２ ５期 ） 总 １
圳 嚣ｍ
Ｄ ＮＡ 聚合 酶 ０ ２ Ｌ， ． 双蒸 水 ｌ ． Ｌ １ ８ 。反 应 条 件 ：
９ ℃ 预 变 性 ５ ｒｉ ； ４ ℃ ６ ， ３ ℃ ６ ， ２ ℃ ４ ｎ９ ａ ０Ｓ ５ ０Ｓ ７
胞 培 养增 殖 的特 性 ， 研 究 从 １ 本 ３份 临床 Ｐ ＭＷＳ病 料 中分离 Ｐ Ｖ一 Ｃ ２毒株 ， 细胞 连 续传 代 ， 经 获得 １ ３株
由华南农 业大 学禽病 室保 存 。
１ ２ 方 法 ．
１ ２ １ 引物 的设计 和合 成 参 照 Ｇｅ Ｂ ｎ ． ． ｎ ａ ｋ收录 的
２Ｆ ２ Ｐ － Ｓ ， ＣＶ－ － Ｑ１， Ｐ ＺＺ ＣＶ一 一 Ｑ２ Ｐ ２Ｚ ， ＣＶ一 一 ２ ＹＦ，
ＰＣＶ一 一 Ｄ１，ＰＣＶ一 一 ２Ｓ ２ ＳＤ２，ＰＣＶ一 一 ２ ＳＳ， ＰＣＶ一 一 ２ ＳＨ ， ＰＣＶ一 一 ２ ＺＣ，ＰＣＶ－ － ２ ＧＺ１，ＰＣＶ－ － ２ ＧＺ２， ＰＣＶ一 一 ２ ＧＺ３。
疾 病［ ］ 其 中 以 Ｐ １ ， － ３ ＭＷＳ最 为 严 重 。该 病 主 要 危 害
（ 经武汉 科前 动 物 生物 制 品有 限责 任公 司 生产 的猪
圆环病 毒 ２型 Ｅ ＩＡ 抗 体检测 试剂 盒检 测 为 阴性 ） ＬＳ
６周龄 ～ｌ ２周龄 仔 猪 ， 引起 渐 进 性 消 瘦 、 呼吸 困难 、 腹泻 和黄疸 等 ， 给世 界 养 猪 业 造成 了 巨大 的经 济 损 失 。国 内自 ２ ０ 年 报道 该病 以来 ， 各 省市均 有 不 ０１ 在 同程度 的流行［ ］ ４ 。为 了深入 研 究 Ｐ Ｖ一 体外 细 Ｃ ２在
司 ； ＮＡ 提 取 试 剂 盒 、 Ｃ 纯 化 试 剂 盒 、 粒 ＤＮＡ Ｄ Ｐ Ｒ 质
收稿 日期 ： ０ ０ １ — ８ ２ １— ｌ Ｏ 基金 项 目 ： 东 省科 技 攻 关 项 目（ ０ ６ ２ ３ １ ０ ） 广 ２ ０ Ａ ０ ０－ 扩增 １０ ４ ｂ ～ １７ ８ ｂ ８ ｐ ６ ｐ的 片 段 。
５一 ＴＡＧ ＴＡＣ ＴＡＧＧ Ｇ ＴＴ Ａ ＧＧＴ ＡＴ ３ ， 增 片 Ｃ Ａ一 扩
段 为 ４ ４ｂ 。参 照 Ｇｅ Ｂ ｎ ６ ｐ ｎ ａ ｋ收 录 的猪 圆 环病 毒 ２ 型全 基 因组序 列合成 两对 引物用 于 扩增 全基 因组 片
段 ，上 游 引 物 Ｐ ： ５－ Ｃ Ｃ Ｃ ＴＴ Ｃ— ３ ＡＣ ＡＧ Ｇ ＡＣ Ｃ Ｇ ＡＧＣ Ｇ一 ， 游 引 物 Ｐ ：５－ Ｃ Ｃ Ｇ ３ 下 ４ ＇ ＴＡＣ ＡＣ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ — Ｃ ＧＴ Ｃ ＴＡＣ Ｔ ３ ， Ｔ 一 扩增 １ ７ ｐ的片段 ； ～１２ ３ｂ 上游 引
９ ，０个 循环 ； 后 ７ ０Ｓ３ 最 ２℃延伸 １ ｉ。 ０ｒ ｎ 取反应 产 物 ａ
５肚 Ｌ在 １ ／ 的 琼 脂 糖 凝 胶 上 进 行 电 泳 。 ０ｇ Ｌ
１ ２ ５ 病 毒 的分 离 将病 料研 磨后 反复 冻融 ３次 ， ．．
上清 用 ０ ２ Ｌ的细 菌滤器 过滤 除菌 。取 上清 接 种 ．２
７ ， ２ｈ 将增殖 病毒 的细胞 反 复冻融 ３次 ， 收集 细 胞 毒液ｃ 。将毒 液提取 Ｄ ６ － ＮＡ 后进行 Ｐ Ｒ检 测 ， 阳 Ｃ 用
～
性细胞 毒液再 接 种 细胞 ， 共传 代 ６次。培 养 过 程 中 同 时设 立不 接毒 的细胞培 养物作 为阴性 对照 。
１ ２ ６ 间接 免 疫 荧 光试 验 检 测 按 照 １ ２ ５的 方 法 ． ． ．．
次 ， 次 ５ ｍ ｎ 自然 干 燥 后 至 于 荧 光 显 微 镜 下 观 每 ｉ，
察 。 １ ２ ７ 病毒 的 Ｔ Ｉ ｓ 定 ．． Ｃ Ｄ。 测 先 将 细胞 毒 液用 细 胞
维持 液做 ｌ 梯 度 稀 释 ， ｌ ～ １ ～ ， 后 将 其 Ｏ倍 从 ０ Ｏ 然
Ｍ． ＤＮＡ标 准 Ｄ ０ ；～ １ ． 次 为 Ｐ Ｖ一一Ｓ 、ＣＶ ２Ｆ ２ Ｌ ２０ ０ ｌ ３ 依 Ｃ ２Ｆ ＩＰ 一一Ｓ 、
猪 圆环病毒 ２型 （ Ｃ － ） Ｆ Ｐ Ｖ ２ ＯＲ ２基 因序 列选 择保 守 区域 设计合 成 一 对 特 异 性检 测 引 物 ， 游 引 物 Ｐ ： 上 １
５＿ ＡＴＣ ＡＡ ＡＧＧＣ ＴＴ 一 ， 游 引 物 Ｐ ： ， Ｔ Ｃ ＧＧ Ｇ ＡＣ ３ 下 ２
细 胞培育适 应 毒 ， 聚合 酶链 式 反 应 （ Ｃ 、 接 经 Ｐ Ｒ） 间 免 疫荧光 试验及 核酸序 列 分 析 等方 法鉴 定 ， 实 分 证 离株 为 Ｐ Ｖ ２毒株 ， Ｃ － 分别 命名 为 Ｐ Ｖ ２Ｆ １ Ｐ Ｖ Ｃ －－ Ｓ ， Ｃ －
将第 ６ 细胞 毒液接种到 Ｐ －５ 代 Ｋ １ 细胞 ，７℃培养 ６ 测定 由广州 英骏 生物技术 公 司完 成 。 ３ ０ｈ 后 ， Ｈ ． 的 Ｐ Ｓ洗 涤 ， 涤 后用 ９０ｍＬ Ｌ的丙 用ｐ ７２ Ｂ 洗 ０ ／ 酮 固定 ３ ｉ ； 用 Ｐ Ｓ洗 涤 ３次 ， 次 ５ｒｉ； ０ｒｎ 再 ａ Ｂ 每 ｎ 加 ａ
于 Ｐ 一５细胞 ，４ｈ后 用 ３ ０ｍｍｏ／ － 基 葡 萄 Ｋ１ ２ ０ ｌＬ Ｄ 氨 糖 （ －ｌｃ ｓｍｉｅ ７℃处理 ３ ｎ 再 培 养 ４ Ｄ ｇｕｏ ａ ｎ ）３ ０ｍｉ， ８ｈ
Ｐ 、 ６两对 引物扩 增 全基 因组序 列 ， Ｃ 的反 应 体 ５Ｐ ＰＲ 系 ： ＮＡ 模 板 ２ Ｌ， 、 游 引物 各 （ ０ｍｍｏ／ Ｄ 上 下 ２ ｌＬ）
珠 三 角地 区猪 圆环 病 毒 ２型 的分 离鉴 定 及 序 列分 析
黎 丁 滔 ，， 一 陈芳艳 。 陈瑞 爱 晏 勇邦 冯金 牛 王 林 川 ， ， ， ，
（． 南 农 业 大 学 兽 医学 院 ， 东 广 州 ５０ ４ ；． 东 大 华农 动 物保 健 品股 份 有 限 公 司 ， 东新 兴 ５ ７０ ； １华 广 １６ ２ ２广 广 ２ ４ ０
９ ． ％之 间。 ９８
关键 词 ： 圆环 病毒 ２型 ； 离； 定 ； 列分析 猪 分 鉴 序
中 图分 类 号 ： ８ ２ ６ ９ ２ ￥ ５ ．５ ． 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ７５ ３ （０ １ ０ — ０ ５ ０ １ ０ — ０ ８ ２ １ ） ５０ ０ －５
猪 圆 环 病 毒 ２型 （ ｏ ｃ ｅｃ ｃｖｒ ｓｔｐ ， Ｐ ｒｉ ｉ ｏ ｉ ｙ ｅ ２ ｎ ｒ ｕ
３ 华 南 农 业 大 学 动物 科技 学 院 ， 东 广 州 ５ ０ ４ ） ． 广 １ ６２
摘
要 ： 了解珠 三 角地 区猪 群 中猪 圆环病 毒 ２型 （Ｐ Ｖ一）的 流行 变异 情 况 ， ２ ０ 为 Ｃ ２ 从 ０ ８年 一２ １ ０ ０年 珠
三 角地 区疑 似 Ｐ ＭＷ Ｓ病 死猪 组织 中分 离获得 Ｐ Ｖ一 Ｃ ２流行 毒株 ， 间接 免 疫 荧光 方法进 行检 测和 用 Ｐ Ｒ方 用 Ｃ
１ ３份 病料 Ｄ ＮＡ 的 Ｐ Ｒ扩 增 产物 经 琼脂 糖凝 Ｃ
胶 电泳分 析 ， 明扩增 出了 ４ ４ｂ 表 ６ ｐ大小 的特异 性 片 段， 与预期 结果相 符 （ １ 。 图 ） ２ ２ 细胞 毒液 Ｐ Ｒ扩增 结果 ． Ｃ 第 １ ６代细胞 毒液抽 提 Ｄ － ＮＡ 后经 Ｐ Ｒ检测 ， Ｃ 均能 扩增 出 ４ ４ｂ ６ ｐ大小 的特异性 片段 （ ２ 。 图 ）
模板 ２ Ｌ， 、 游 引物 各 （ ０ｍｍｏ／ ） Ｌ，０ 上 下 ２ ｌＬ １ １×
ｂ ｆｅ Ｌ，ｄ ｕ ｆｒ５ ＮＴＰ（ ０ １ ｍｍｏ／ ４ 肚 ｌＬ） Ｌ，Ｅｘ Ｔ ｑ ａ
作者 简 介 ： 丁滔 （９ ６ ，－ａ ￣） 广 西 河池人 ， 士研 究 生 ， 从 事 动 物 疾病 病原 分 子 生 物 学研 究 。 ＊ 讯 作者 黎 １８ 一） － （ ｋ ， 硕 主要 通
ｌ Ｌ １ ｂ ｆ ｒ５ Ｌ，ｄ Ｐ（ ０ｍｍｏ／ ４ ｇ ，０× ｕｆ ｅ ＮＴ １ ｌＬ） Ｌ，
Ｅ ａ Ｄ ｘＴ ｑ ＮＡ 聚合酶 ０ ２ Ｌ 双蒸水 １ ． Ｌ ． ， １ ８ 。反应
程序 ： ４℃预 变性 ５ ｒｉ； ４ ℃ ６ ， ６℃ ６ ， ９ ｎ９ ａ ０Ｓ ５ ０ ｓ ７ ２℃ ９ ，０个循 环 ； ０Ｓ３ 最后 ７ ２℃延 伸 １ ｉ。取反 ０ｒ ｎ ａ 应产 物 ５ Ｌ在 １ ／ ０ｇ Ｌ的琼脂 糖凝胶 上进行 电泳 。 １２ ９ 全基 因组 序 列分 析 ．． 两 个 片段 扩 增后 连接 于 ｐ １一 ＭＤ ８Ｔ载 体 ， Ｐ Ｒ 鉴定 后 送 往 测序 。序列 经 Ｃ
胞 由华南农 业 大 学 禽 病 实 验 室 保 存 ； ３份 病 料 （ １ 淋 巴结 、 脏 ） 自珠 三 角 地 区 （ 山 、 庆 、 浮 、 脾 采 佛 肇 云 顺 德、 山水 、 四会 、 增城 和广 州 ） 临床 症状 和 剖检病 变 疑
似 Ｐ ＭＷＳ猪场 ， 置于 － ８ ０℃冰柜 中保存备 用 。 １ １ ２ 主要 试 剂 ．． ＤＭＥ 、 牛 血 清 、 光 抗 体 Ｍ 胎 荧 ＦＴ 一 Ｉ Ｃ 羊抗猪 ＩＧ 购 于 广 州 美 津 生 物 技 术 有 限公 ｇ