PCR引物设计及相关软件使用37907 PPT课件
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pcr培训课件ppt
遵循标准化操作流程，确保实验 的一致性和准确性。
数据分析
对实验数据进行统计分析，识别 并排除异常值。
质量控制标准
制定质量控制标准，对实验结果 进行评估和监测。
04
PCR技术发展与展望
PCR技术的改进与创新
1 2
优化反应体系
通过调整反应成分和条件，提高PCR的特异性和 灵敏度，降低背景噪音。
新型PCR技术的开发
PCR技术的原理
双链DNA加热变性
在高温下，双链DNA解旋为单链 DNA。
引物与单链DNA结合
根据已知序列设计特异性引物， 在低温下与单链DNA结合。
DNA聚合酶催化延伸
在适宜温度下，耐高温的DNA聚 合酶催化引物沿着单链DNA延伸
，合成互补链。
重复加热变性、退火和延伸
反复进行变性、退火和延伸，实 现DNA片段的指数级扩增。
产物检测与鉴定
电泳检测
可以使用琼脂糖凝胶电泳 或聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测PCR产物。
荧光检测
可以使用荧光染料或探针 检测PCR产物。
测序鉴定
如果需要，可以对PCR产 物进行测序，以确定其序 列是否与预期一致。
03
PCR实验注意事项
实验安全
实验室安全须知
确保实验室内环境整洁，避免交 叉污染。
个人防护措施
THANKS
食品安全检测
利用PCR技术检测食品中的微生物、毒素和污染 物，保障食品安全。
PCR技术的研究方向
提高灵敏度和特异性
进一步优化PCR技术，提高检测的灵敏度和特异性，降低假阳性 或假阴性的可能性。
标准化和质量控制
建立PCR技术的标准化和质量控制体系，确保实验结果的可靠性和 可比性。
数据分析
对实验数据进行统计分析，识别 并排除异常值。
质量控制标准
制定质量控制标准，对实验结果 进行评估和监测。
04
PCR技术发展与展望
PCR技术的改进与创新
1 2
优化反应体系
通过调整反应成分和条件，提高PCR的特异性和 灵敏度，降低背景噪音。
新型PCR技术的开发
PCR技术的原理
双链DNA加热变性
在高温下，双链DNA解旋为单链 DNA。
引物与单链DNA结合
根据已知序列设计特异性引物， 在低温下与单链DNA结合。
DNA聚合酶催化延伸
在适宜温度下，耐高温的DNA聚 合酶催化引物沿着单链DNA延伸
，合成互补链。
重复加热变性、退火和延伸
反复进行变性、退火和延伸，实 现DNA片段的指数级扩增。
产物检测与鉴定
电泳检测
可以使用琼脂糖凝胶电泳 或聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测PCR产物。
荧光检测
可以使用荧光染料或探针 检测PCR产物。
测序鉴定
如果需要，可以对PCR产 物进行测序，以确定其序 列是否与预期一致。
03
PCR实验注意事项
实验安全
实验室安全须知
确保实验室内环境整洁，避免交 叉污染。
个人防护措施
THANKS
食品安全检测
利用PCR技术检测食品中的微生物、毒素和污染 物，保障食品安全。
PCR技术的研究方向
提高灵敏度和特异性
进一步优化PCR技术，提高检测的灵敏度和特异性，降低假阳性 或假阴性的可能性。
标准化和质量控制
建立PCR技术的标准化和质量控制体系，确保实验结果的可靠性和 可比性。
pcr ppt课件教程
引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因 导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度 等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度， 通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进 行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的 退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链 。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小 ，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引 物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完 成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复 制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合 ，为聚合酶提供起始点。
第五章PCR引物设计-精选.ppt
ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度
引物与模板应具有较高的结合能量，这 样有利于引物与模板序列的整合。因此， 5´端与中间段的ΔG值应较高，引物3’端
的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构 并引发DNA 聚合反应。
算法：邻近热力学
例：ACGG 和其互补 TGCC 结合的ΔG： ΔG(ACGG)= ΔG(AC)+ ΔG(CG)+ ΔG(GG)
同时应预测将扩增的片段单链是否形二 级结构。如这个区域单链能形二级结构， 就避开它。如这一段不能形二级结构， 那就可以在这一区域设计引物。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮 助的。
1、引物设计的原则
① 引物要跟模板紧密结合； ② 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹
引物设计要点（3）
引物的Tm值。Tm值最好接近72℃。过高（>72℃）
或过低（<37℃）都不利于引发反应。上下游引物的 Tm 不能相差太大。
长度为25mer以下的引物：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) –
因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特 异性与效率。
引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性 影响不大。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、 地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入 突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。
引物的GC含量一般为45-55%，过高或 过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。
引物与模板应具有较高的结合能量，这 样有利于引物与模板序列的整合。因此， 5´端与中间段的ΔG值应较高，引物3’端
的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构 并引发DNA 聚合反应。
算法：邻近热力学
例：ACGG 和其互补 TGCC 结合的ΔG： ΔG(ACGG)= ΔG(AC)+ ΔG(CG)+ ΔG(GG)
同时应预测将扩增的片段单链是否形二 级结构。如这个区域单链能形二级结构， 就避开它。如这一段不能形二级结构， 那就可以在这一区域设计引物。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮 助的。
1、引物设计的原则
① 引物要跟模板紧密结合； ② 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹
引物设计要点（3）
引物的Tm值。Tm值最好接近72℃。过高（>72℃）
或过低（<37℃）都不利于引发反应。上下游引物的 Tm 不能相差太大。
长度为25mer以下的引物：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) –
因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特 异性与效率。
引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性 影响不大。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、 地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入 突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。
引物的GC含量一般为45-55%，过高或 过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。
PCR引物设计及软件使用.ppt
Primer 3 The Primer Generator AutoPrimer
基因多态性分析软件 SNP（单核苷酸多态性）查找软件 基因组数据建库与分析软件
引物分析著名软件 荧光定量PCR分子信标及TaqMan探针设计软件 PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件 快速筛选二聚体引物软件 用于定点突变的引物设计软件 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件
碱基的随机分布
引物中四种碱基最好随机分布，避免嘌呤、嘧啶堆积现象 避免引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC
引物的3’端
与目的位点必须完全同源 与非目的位点避免连续5-6bp的同源
引物设计的原则
引物的Tm值
上下游引物的Tm值尽可能一致，Tm差异不应超过5°C 根据Tm值，确定退火温度
∆G值：DNA双链形成所需要的自由能
GenBank DNA序列数据库拥有来自 47,000个物种的30亿个碱基
在“Search”搜索框 中选择“Nucleotide”
rfbE
检索结果中有很多无关菌，为查 找Ecoli.的rfbE基因带来麻烦
限制检索范围，将结果 锁定于待查目标
非特异杂交
引物、探针设计
查找基因序列 序列分析
引物、探针设计 特异性验证
GenBank
ClustalX
Primer Premier 5.0 TM Utility v1.3 mfold
BLAST
例:根据大肠杆菌rfbE基因序列， 设计引物和探针
1.检索大肠杆菌rfbE的基因序列
National Center for Biotechnology Information 美国国立生物技术信息中心
有名的在线引物设计程序 在线引物设计程序 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件
基因多态性分析软件 SNP（单核苷酸多态性）查找软件 基因组数据建库与分析软件
引物分析著名软件 荧光定量PCR分子信标及TaqMan探针设计软件 PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件 快速筛选二聚体引物软件 用于定点突变的引物设计软件 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件
碱基的随机分布
引物中四种碱基最好随机分布，避免嘌呤、嘧啶堆积现象 避免引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC
引物的3’端
与目的位点必须完全同源 与非目的位点避免连续5-6bp的同源
引物设计的原则
引物的Tm值
上下游引物的Tm值尽可能一致，Tm差异不应超过5°C 根据Tm值，确定退火温度
∆G值：DNA双链形成所需要的自由能
GenBank DNA序列数据库拥有来自 47,000个物种的30亿个碱基
在“Search”搜索框 中选择“Nucleotide”
rfbE
检索结果中有很多无关菌，为查 找Ecoli.的rfbE基因带来麻烦
限制检索范围，将结果 锁定于待查目标
非特异杂交
引物、探针设计
查找基因序列 序列分析
引物、探针设计 特异性验证
GenBank
ClustalX
Primer Premier 5.0 TM Utility v1.3 mfold
BLAST
例:根据大肠杆菌rfbE基因序列， 设计引物和探针
1.检索大肠杆菌rfbE的基因序列
National Center for Biotechnology Information 美国国立生物技术信息中心
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PCR及相关技术PPT课件
DNA是一种非常稳定的分子，其作为模板影响PCR效果 的因素有： 1. 模板的纯度； 2. 模板DNA的量；
2020/7/28
13
3. PCR引物：
PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链 ，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’ 端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片 段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。
核苷酸错误掺入的几率比较高
2020/7/28
9
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
Taq DNA聚合酶的特性
200 150
2
100
100
3
50
1
2020/7/28
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
温度
6 78
9 10
pH
1. 25 mM磷 酸 缓 冲 液 2. 25 mMTris-HCl缓 冲 液
2020/7/28
18
2020/7/28
6. PCR系统中的其他成分：
PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或 血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。
2020/7/28
16
PCR仪
2020/7/28
17
（四）PCR反应技术类型
1. 巢式PCR（nested PCR）：
设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物 为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度 ，比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性增加1000倍 。
C.therm.聚合酶
1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在 RT-PCR系统中催化逆转录反应。
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3. PCR引物：
PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链 ，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’ 端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片 段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。
核苷酸错误掺入的几率比较高
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掺入的 H-dNTTP微克分子数
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掺入的 H-dNTTP微克分子数
Taq DNA聚合酶的特性
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掺入的 H-dNTTP微克分子数
温度
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pH
1. 25 mM磷 酸 缓 冲 液 2. 25 mMTris-HCl缓 冲 液
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6. PCR系统中的其他成分：
PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或 血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。
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16
PCR仪
2020/7/28
17
（四）PCR反应技术类型
1. 巢式PCR（nested PCR）：
设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物 为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度 ，比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性增加1000倍 。
C.therm.聚合酶
1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在 RT-PCR系统中催化逆转录反应。
PCR引物设计原理 ppt课件
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点击 2020/12/22 Search，进行引物搜索
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Primer Length常设置在18－30bp, 短了特异性不好，长了没有必要。 当然有特殊要求的除外，如加个酶 切位点什么的。
PCR Product size最好是100－ 500bp之间，小于100bp的PCR产 物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模 糊，不好看。至于上限倒也不必要 求苛刻。
2020/12/22
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（3）重复或自身互补序列：
• 形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复 性。
2020/12/22
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（4）上下引物的互补性：
• 一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任 何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二 聚体。
• 当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端 都不能和 其他任何引物互补。
➢ 3’末端的性质非常关键。
➢ 如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最 好不要A，或AA等多聚A；
➢ 但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列 的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。
2020/12/22
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• 当末端碱基为 A 时，错配时引发链合成的效率大大 降低；
PCR引物设计原理
2020/12/22
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➢ PCR反应一般由三个步骤组成：① 模板的热变性；② 引物复性到单链模板上；③ 热稳定DNA聚合酶催化的 延伸
2020/12/22
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精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
PCR技术及其延伸与应用PPT课件
精选ppt课件2021
5
PCR与病毒类疾病应用
• 杂交法检测植物病毒和类病毒 • 利用RT-PCR对黄瓜病毒源种类进行检测 • 诊断人类乳头状病毒HPV感染
精选ppt课件2021
6
诊断遗传疾病
精选ppt课件2021
7
PCR的特点
• 特异性高-聚合酶 • 首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的
Klenow大片段。90℃会变性失活，需每次 PCR循环都要重新加入；同时引物是在37℃ 延伸 • Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等从温泉水中 分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的， 扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很 低、其错配率一般只有约万分之一
精选ppt课件2021
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• 高度敏感：
• dNTP贮备液 • DNA模板
精选ppt课件2021
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操作程序
• 试剂混合 • PCR仪程序设计：94℃变性30s，55℃退火20s，然后
在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后， 再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
精选ppt课件2021
12
PCR反应基本条件及其对PCR的影响
• 100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳， • Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的
精选ppt课件2021
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缓冲液
• 缓冲液的目的：给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应 条件。
• 目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (Tris是一种双极性离子缓冲液，pH变化于6.8-7.8之间。 将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。
PCR详细讲解PPT课件
4.为什么PCR产物出现片状拖尾？
①DNA聚合酶过多或酶活性差。 ②dNTP和Mg2+浓度过高。 ③退火温度过低，PCR循环数偏多。 ④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。 ⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非 特异扩增。
2021/3/7
CHENLI
22
2021/3/7
普通PCR仪
CHENLI
温度梯度PCR仪
对于20bp左右的引物：
2021/3/7
Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）
一般情况下，PCR的最佳退火温度比引
物Tm值低5℃左右。
CHENLI
32
引物设计的基本原则
6、引物中四种碱基最好是随机分布的
避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。 特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否 则会使引物在G+C富集序列区域产生错配， 降低扩增的特异性。
2021/3/7
CHENLI
36
引物设计的基本原则
10、引物3’端要避开密码子的第3位。
如扩增序列位于基因编码区域，引物3’ 端不要终止于密码子的第3位，因密码子的 第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与 效率。
2021/3/7
CHENLI
37
Real-Time PCR引物设计原则
1、避免重复碱基，尤其是G。
引物的5’端决定着PCR产物的长度，它 对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影 响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生 物素、引入点突变等。
由于延伸是从3’端开始的，所以不能进 行任何修饰。
2021/3/7
CHENLI
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引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
①DNA聚合酶过多或酶活性差。 ②dNTP和Mg2+浓度过高。 ③退火温度过低，PCR循环数偏多。 ④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。 ⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非 特异扩增。
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CHENLI
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普通PCR仪
CHENLI
温度梯度PCR仪
对于20bp左右的引物：
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Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）
一般情况下，PCR的最佳退火温度比引
物Tm值低5℃左右。
CHENLI
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引物设计的基本原则
6、引物中四种碱基最好是随机分布的
避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。 特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否 则会使引物在G+C富集序列区域产生错配， 降低扩增的特异性。
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引物设计的基本原则
10、引物3’端要避开密码子的第3位。
如扩增序列位于基因编码区域，引物3’ 端不要终止于密码子的第3位，因密码子的 第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与 效率。
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Real-Time PCR引物设计原则
1、避免重复碱基，尤其是G。
引物的5’端决定着PCR产物的长度，它 对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影 响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生 物素、引入点突变等。
由于延伸是从3’端开始的，所以不能进 行任何修饰。
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引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
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2
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
3
PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可
以是细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定
1、避免重复碱基，尤其是G。
2、引物退火温度在58-60℃之间。
3、G+C为30-80%。
4、3’端最后5个碱基内不能有多于2个
的G或C。
5、引物的产物大小一般在80-250bp之
间；80-150 bp最为合适（可以延长至
300 bp）。 2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
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Real-Time PCR引物设计原则
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
35
引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
引物3’端错配时，不同碱基引发效率存 在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即 使在错配的情况下，也能有引发链的合成， 而当末位链为T时，错配的引发效率大大降 低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所 以3’端最好选择T。
引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
26
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
30
引物设计的基本原则
PCR 技术及应用ppt课件
个体识别与亲子鉴定 GMO
学习交流PPT
31
PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不 对 称 PCR 的 目 的 是 扩 增 产 生 特 异 长 度 的 单 链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。
学习交流PPT
33
RT-PCR图解
学习交流PPT
34
• 三、锚定PCR(anchored PCR, A-PCR)
•
该法的基本原理是在基因未知序列端添加同
聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用
人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，
在与基因配对互补结合后进行PCR扩增。
学习交流PPT
35
四、反向PCR (inverse PCR, IPCR)
学习交流PPT
18
PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
• 引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好， 引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引 物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板 的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
• 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别 是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩 增条带。
• 引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格 要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
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