几丁质酶在植物病害生物防治中的应用
抗稻瘟病几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究
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温度 （ ℃）
图 ４ 温 度 对 菌 株 产 酶 活 力 的 影 响
取在 Ｌ Ｂ培 养 液 中培养 ２ ｄ的 Ｈ３和 Ｈ９菌株种
第２ １卷 第 １ 期
２１ ０ １年 ３月
湖 南 工 程 学 院 学 报 Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｕ ａ ｎ ｔｔ ｔ ｆＥｎ ｉ ｅ ｒｎ ｏ ｒ ａ ｆＨ ｎ ｎ Ｉ ｓｉｕ ｅｏ ｇｎ ｅ ｉｇ
Ｖｏ ． １ Ｎｏ １ １２ ． ．
Ｍ ａ． ｒ ２Ｏｌ ｌ
抗 稻 瘟 病 几 丁 质 酶 产 生 菌 的 筛 选 及 产 酶 条 件 的研 究
参照 中国科学 院上海植 物生理研 究所和 上海市 植 物 生 理 学 会 主 编 的 《 代 植 物 生 理 学 实 验 指 现
南》 ［ ．
１ ３ 稻 瘟 病 病 原 茵 细 胞 壁 悬 浮 物 制 备及 菌 株 筛选 ．
质 的降解 产物 一几丁寡糖 能诱导启 动植 物的 防御 系 统， 刺激植 物生 长发育Ｌ ． 丁质酶 产生菌是 一类 能 ２几 ］ 够 利用几 丁质为碳 源 而 生长 的 微生 物 ， 其共 同特征
隔 １ ２ｈ检 测一 次几 丁质 酶 活 力 ． 结果 如 图 ３所 示 ，
Ｈ３菌株从 ６ ０ｈ开始 产 酶活力 增 长加 快 ， ７ 到 ２ｈ时 达 到最 高值 ． ２ｈ后 酶 活性 逐 渐 下 降． 可 能 是 随 ７ 这 着 时 问的延 长 ， 养 液 中 产 生 大 量 芽 孢 ，营养 体 生 培 成 减少 ， 导致 产 酶能 力 下 降． Ｈ９菌株 酶 活力 增 长 比
几丁质酶在植物病害生物防治中的应用
几 丁 质酶 的分 子结 构 主 要包 括 信 号肽 序 列 、 丁质 酶 几 催 化 区 、 丁质 结 合 区 域 、 几 Ｃ端 区 域 。 中 几丁 质酶 催 化 区 其 （ ２个 高 度保 守 区 ， ｌ （ ） Ａ ｐ Ｄ） 基 高度 保 守 ） 几 具 Ｇｕ Ｅ 和 ｓ （ 残 、 丁 质 结合 区 域 （ 物 几 丁 质酶 的 几丁 质 结合 区 主要 含 有 半 植 胱氨 酸残基 ， 生物几 丁质酶 的几丁 质结合 区主要含 有色氨 微 酸残 基 ） 化 区域相 似 的几 丁质酶 ， 催 它们 的几 丁质 结合 区域
部分 水 解 的几 丁 质均 可 以 诱导 几 丁质 酶 的产 生 ， 几丁 单 但 糖 （ ＡＧ） 不 能 。 种 诱 导物 对 不 同 微 生物 的诱 导作 用 亦 Ｎ 则 各 有所 不 同 ， 且 几 丁质酶 的诱 导 可被 过 量 的可 溶 性代 谢 物 并 所 阻遏 。 是 分 泌性 ， 生 物 所产 的几 丁 质 酶 多 是 分泌 型 三 微
几 丁质酶广 泛存在于 各种植 物 、 物及微 生物细 胞和组 动 织中， 参与 多种 生理 过程 １ 几 丁质 酶可 以有 效降 解几 丁 质 ， １ 。 在 自然界 的物质 循环 中起 着不可 替代 的作 用。 丁质是 构成 几
大 多 数 真 菌 细 胞 壁 的 主 要 成 分 ， 自然 界 中 存 在 数 量 巨 大 ， 在
Ａｐ ｌ ａ ｏ ｆ Ｃｈ ｔ ａ ｅ ｎ Ｂｉ ｃ ｎ ｒ ｌ ｏ ａ ｔ Ｄｉ ａ ｅ ｐ ｉ ｔ ｎ ｏ ｉｉ ｓ ｓ ｏ ｏ ｏ ｔ ｏ ｆ Ｐｌｎ ｓ ｓ ｓ ｃｉ ｎ ｅ
ＸＵ ｅ ｇ ｑ ｕ ＺＨＯＮＧ ｎ － ｎ ＧＯＮＧ ｈ Ｘｍ ａ ｇ ｍｉ ｇ’ Ｍ ｎ － ｉ Ｚｅ ｇ ｍｉ ｇ Ｙａ Ｘｉ ｎ － ｎ
几丁质酶在植物抗真菌病害中的作用
水 平 。
因工程 防 御 植 物 病 害 是 指 利 用 基 因 工程 的 手 段 ，
按水解 切 口位 置 不 同 可 将 几 丁质 酶 分 为 内切 几 丁质 酶 （ 解 位 点 为 同 聚 物 内 部 Ｊ— １ 水 ３ ，４连 键 ） 和外切 几 丁质 酶 （ ，４连 键 ） 。研 究 较 多 的 植 物 几 丁 质 酶是
1几丁质酶及其作用特性几丁质又称甲壳素或甲壳质是几丁质酶的作用底物在昆虫和动物的甲壳中大量存在真菌中除卵菌外都有分布这类天然聚合物在自然界中的生成量仅次于纤维素是大多数真菌细胞壁的主要组成成分而在植物中却不存在
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第３ 卷 ｌ
第３ 期
林 业 科 技
ＦＯ Ｒ ＥＳＴＲＹ ＣＩ Ｓ ＥＮ ＣＥ ＆ ＴＥＣＨ Ｎ ＯＬＯ ＧＹ
Ｖ０． ＮＯ． Ｊ３１ ３
Ｍａ ｙ ２００６
２０ ０６ 年 ５ 月
文 章 编 号 ：１ ０ —９ ９ （０ ６ ０ —０ ２ —０ ０ １ ４９ ２０） ３ ０４ ４
几丁质酶在植物抗真菌病 害 中的作用 。
・ 黑 龙 江 省 重 点 基 金 项 目 （ Ｉ ０ —０ ０ ） ｚＮ ４ １ １ ，东 北林 业 大 学 校 基 金 项 目
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第 ３期
张福丽等 ：几丁质酶在植 物抗真茼病 害中的作用
界 中的 生成 量 仅 次 于 纤 维 素 ，是 大 多 数 真 菌 细 胞
和 等点 聚焦 从 Ｔ ｉ ｏ ｅｍａ ｈ ｒｉｎ ｍ 中分 离 到 ｒ ｈｄ ｒ ａ ｚａ ｕ ｃ
的具 有抗 真 菌 活 性 的 内切 几 丁质 酶 对 ９种 真 菌 具 有抑 制 作 用 ］ 微 生 物 的 几 丁 质 酶 中 也 有 报 道 。 Ｃ Ｄ能 增 强酶对 不溶 性 几 丁质 的降 解 能 力 ，对 于 Ｂ 完 全 降解胶 状 几 丁 质 是 必 需 的Ｈ 。 据 分 子 细 胞 学 ］ 研 究 ：几 丁质 酶 只 对 幼 嫩 的 菌 丝 端 部 作 用 敏 感 ， 而成 熟菌 丝 细 胞 壁 的 几 丁质 层 不 易被 降解 。这 是
几丁质_壳聚糖在植物保护中的研究与应用进展_赵蕾
生物防治几丁质、壳聚糖在植物保护 中的研究与应用进展赵 蕾 汪天虹(山东省科学院生物研究所 济南 250014) (山东大学微生物技术国家重点实验室)几丁质(chitin),又称甲壳素,广泛分布于于虾蟹壳、软体动物的外壳与内骨骼,节肢动物的外骨骼及真菌、酵母菌等微生物细胞壁中。
与植物的纤维素一样,具有保护及支持生物体的作用。
壳聚糖(chitosan),又称几丁聚糖,是几丁质经脱乙酰作用而得到的一种氨基多糖,存在于某些生物体内,特别是真菌的细胞壁上。
近年来,对这类在自然界含量仅次于纤维素的几丁质和壳聚糖的研究与应用日益扩大,本文介绍其在植物保护中的应用潜力。
1 几丁质与壳聚糖的特性几丁质是一种构造类似于纤维素的直链聚合物,约由1000~3000个N -乙酰葡萄糖胺单体以B -1,4键构成的高分子糖类聚合物,其中约每6个N -乙酰葡萄糖胺连接一个葡萄糖胺[1]。
几丁质在生物体中以对称同向或反向非平行的糖链以氢键结合而成。
由于氢键结构十分强固,使得几丁质在物理性质和化学性质上较其它多糖类具有更高的稳定性。
对一般溶剂抗性大,只溶于强无机酸、氟化醇及含有5%氯化锂的N,N .-二甲基乙酰胺中。
壳聚糖为几丁质经去乙酰作用后失去乙酰基产物的总称,去乙酰程度为65%~99%,一般以70%~80%最常见。
分子特性为可生物分解,溶于10%的己二酸、醋酸、甲酸、乳酸、苹果酸、丙酸和琥珀酸等。
其中以甲酸为最好溶剂,在无机酸中的溶解度则相当有限。
几丁质与壳聚糖的化学结构式见图1。
2 几丁质与壳聚糖诱发植物防御机理分析几丁质与壳聚糖在植物保护中的作用正在引起有关方面的重视。
其诱发植物防御系统的机理是,病原菌入侵植物时,植物本身即有辨认系统,能识别病菌入侵。
而病菌细胞壁上的几丁质即扮演被辨认的角色,使被侵染植株中原本低量而具活性的几丁质酶大大提高,以分解入侵病菌细胞壁上的几丁质。
植株内产生的几丁质寡糖活化植物细胞膜上的蛋白质激发酶,使细胞内的酶产生磷酸化反应提高酶的活性,启动植物的防御系统并产生植物干扰素、酚类复合物等抗病物质,对病原菌产生抑制作用,这些反应均在数小时内完成。
微生物几丁质酶在植物线虫病害防治等领域的应用
（ 河 南 工 业 贸 易职 业 学 院 粮 食 工程 系 ， 河南 郑州 ４ ５ ｌ ｌ ９ １ ）
摘要： 几 丁质 酶在 防 治 由真 菌 、 昆 虫及 线 虫等 低 等 生 物 引 起 的植 物 病 虫 害 中发 挥 着 重要 的作 用 。 对 微 生物 几 丁 质 酶 在 植 物 寄 生 线 虫病 害和 其 它领 域 中 的 应 用等 方 面 的 现 状 及 今 后 的 发 展 方 向 进 行 了综 述 ， 以期 微 生 物 几 丁 质 酶 能 够 得 到 更 加 广 泛 地 研 究和 利 用 ， 并 将 其 应 用 于植 物 寄 生 线 虫 等 病 虫 害 的 生 物 防 治 。 关键词 ： 微 生 物 几 丁质 酶 ； 植 物 寄 有 的 昆 虫及 线 虫 病 原 细 菌 、
真 菌均 可产 生胞 内或胞 外几 丁质 酶 ， 在 有 害 昆 虫
称为 （ １ ， ４ ） 一 Ｊ ３ 一 乙 酰基一 Ｎ 一 聚 葡糖 胺 酶 ， 能 特 异性 地 将 几 丁质水 解 为寡 聚糖 和 Ｎ 一 乙酰氨 基 葡 萄糖 ， 其 水解 产 物具 有抗 菌 、 抗 肿瘤 等 生物 活性 ， 在食 品 、
Ｂｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ ０ １ ｂ， １ ９： ７ ４ １ — ７ ４ ５ ．
性评价［ Ｄ ］ ． 北京 ： 中 国农 业 大 学 ． ２ ０ １ ３ ．
［ ２ ４ ］ 郭颖 慧， 杨正友 ， 孙红炜． 转植酸酶基 因（ Ｐ ｈ ｙ Ａ２ ） 玉 米 对 家
几 丁 质是一 种 由 Ｎ一 乙 酰一 Ｄ 一 氨 基 葡 萄糖 以 ｛ ３ ｌ ， ４键连 接 而 成 的 多 聚 糖 ， 是 仅 次 于 纤 维 素 的第 二 大 多糖类 资 源 ， 也 是 甲壳类 动物 以及 许多 昆虫 、
几丁质酶在农作物免疫防御中的应用研究进展
Food Science And Technology And Economy粮食科技与经济2023 年4月第48卷 第2期Apr. 2023Vol.48, No.4随着世界人口的日益增长，粮食的需求量随之上升，导致农作物在全球的种植面积需求越来越大，而农作物病虫害的发生是造成农作物产量和质量降低的最主要因素，每年因病虫害造成粮食（农作物）减产20％～40％，直接损失超过2 000亿美元[1]。
目前在病虫害防治方面，主要还是依靠化学防治的方式和手段[2]，然而过度依赖化学防治方式会造成环境生态污染。
为了生态环境的可持续发展，降低化学试剂对土壤环境的影响，生物技术在农业建设过程中的应用逐渐被重视。
将生物技术应用于农业病虫害防治中，能够有效减少传统的化学农药防治方法给环境带来的负面影响，推动绿色农业的可持续发展[3]，而几丁质酶在农作物生物防治方面具有巨大的潜在应用价值。
几丁质酶（Chitinase, EC 3.2.1.14）是水解几丁质的酶，能够催化几丁质的β-1,4-糖苷键，将其降解成N -乙酰葡糖胺（N -actyl glucosamine, NAG ），并能由各种微生物，包括病毒、细菌和真菌，以及昆虫、高等植物和动物合成[4]。
几丁质由β-1,4-糖苷键将N -乙酰-D -氨基葡萄糖（Be -ta -1,4-linked Repeating N-acetylaminoglucose Units, GlcNAc ）分子连接而成，以结构多糖的形式存在于真菌细胞壁、节肢动物的外骨骼、甲壳纲动物的外壳以及寄生线虫的外壳中，但尚未在植物体内鉴定出几丁质的存在[5]。
几丁质酶能够通过降解真菌性病毒细胞壁中的几丁质和破坏昆虫及线虫的消化膜等方式达到抗病虫害的效果，且不会对植物体产生伤害。
同时，几丁质酶也是植物防御系统中重要的防卫因子，可以增强植物的防御系统，在抵御病原真菌以及病虫害中发挥着重要作用[6]。
植物保护论文题目选题参考
植物保护论文题目一、最新植物保护论文选题参考1、植物保护对粮食安全的影响分析2、植物交配系统及其在植物保护中的应用3、植物保护专业的发展方向及其人才培养方案的理论探讨4、植物保护潮湿地区土遗址适应性分析研究5、西瓜嫁接苗的植物保护酶同工酶与亲和力分析6、21世纪我国植物保护策略和技术的发展趋势7、植物保护专业教学手段现代化的改革与实践8、植物保护专业《普通昆虫学》教学方法探讨9、不仅仅是遗传多样性:植物保护遗传学进展10、可持续的植物保护与农药的发展11、植物保护喷雾机械的发展研究状况综述12、有机农业植物保护的核心技术和措施13、植物保护专用车即将成批生产14、加快构建新型植物保护体系——农业部副部长范小建在全国植物保护工作会议上的讲话15、北红尾鴝在长白山地区的生态学及其在植物保护中的意义之研究16、植物保护剂保卫德对黄曲条跳甲种群控制作用评价17、γ-射线辐照对植物保护性酶活性和MDA含量的影响18、植物保护专业培养模式改革与特色建设——以青岛农业大学为例19、可持续植物保护及其综合评价20、国际植物保护研究的发展现状与感思——第15届国际植物保护大会学术交流回顾二、植物保护论文题目大全1、转基因作物与植物保护2、植物保护剂保卫德对小菜蛾种群控制作用3、植物他感化合物在植物保护上的应用研究及展望4、烟草植物保护学文献计量分析5、几丁质酶在植物保护中的研究与应用进展6、几丁质及其衍生物在植物保护中的研究与应用进展7、有机农业病虫害防治的核心——可持续植物保护8、病毒唑在植物保护中的应用9、植物保护剂保卫德对黄曲条跳甲控制作用模拟10、免疫胶体金标记技术及其在植物保护上的应用前景11、我国农业院校植物保护专业实践教学的问题与对策12、大学生创新能力的培养实践——以植物保护专业农药生物测定实验为例13、植物保护专业普通昆虫学实验课教学模式的探讨14、从可持续植物保护理念看自然与人文的共通性15、植物保护专业昆虫学科教学体系探索16、《园艺植物保护》教学改革的思考17、植物保护专业多样化人才培养模式研究18、低温胁迫下紫萼藓科植物保护酶活性的变化19、我国植物保护工作的形势和任务20、从生物工程技术认识植物保护研究的发展趋势三、热门植物保护专业论文题目推荐1、基于NPWP的云南植物保护优先区分析2、多媒体在植物保护专业课程教学中应用的利与弊3、植物保护教学中应用病虫害新鲜标本的探讨4、植物保护专业课程教学实习模式创新与实践——以"农业昆虫学"和"农业植物病理学"联合教学实习为例5、无公害植物保护——无公害农业的重要科技支撑6、植物保护与持续农业7、植物农药与植物保护8、壳聚糖(低聚糖)诱导功能的发现及在植物保护上的开发应用9、我国植物保护科学研究现状和21世纪的发展展望10、植物保护专业作物生产教学实习的实践与思考11、植物保护专业规范化实践教学体系的构建与应用12、德国植物保护方面重要的法律法规13、浅谈园林种植设计与植物保护14、中国植物保护50年15、关于IUCN和WWF联合植物保护研究计划工作的成就和今后的任务16、植物保护与农业可持续发展关系分析17、高等农业院校植物保护专业创新人才培养体系理论与实践18、高等真菌在植物保护中的研究进展19、金钱槭属植物保护遗传学与分子亲缘地理学研究20、植物保护剂保卫德对小菜蛾种群控制效应评价四、关于植物保护毕业论文题目1、植物保护剂与植物免害工程——异源次生化合物在害虫防治中的应用2、植物保护剂防治害虫效果的评价方法3、植物保护遗传学研究进展4、几丁质、壳聚糖在植物保护中的研究与应用进展5、植物精油研究及其在植物保护中的利用6、昆虫几丁质酶及其在植物保护中的应用7、二十一世纪新疆植物保护的形势与对策8、植物保护遗传学9、昆虫化学生态学与植物保护10、农业部副部长范小建在全国植物保护工作会议上的讲话11、化合物、基因、化学生态学:21世纪植物保护的机会和挑战12、21世纪我国植物保护问题的若干思考13、水分胁迫下四种滨藜属植物保护酶活性的变化14、欧盟有机农业植物保护的理念和技术措施15、植物保护剂保卫德对黄曲条跳甲种群的控制作用16、新世纪植物保护专业人才培养模式的研究17、21世纪全球植物保护的主体农药—环境友好化学农药18、病虫综合治理是德国植物保护的基本策略19、环境保护和植物保护20、用于植物保护中的天然产物五、比较好写的植物保护论文题目1、人工神经网络及其在植物保护中的应用2、植物保护专业教学过程整体优化的研究3、可持续的植物保护——21世纪的必然选择4、植物保护步入“公共植保、绿色植保”新时代5、植物保护工作面临的挑战及对策6、现代科技与21世纪的植物保护7、苍耳中的活性物质在植物保护上的应用8、植物保护发展的方向——植物源杀虫剂9、几丁质酶及其在植物保护中的应用10、植物保护与农业可持续发展11、贵州野生百合属植物保护与开发利用研究12、植物保护学科本科教学核心课程体系建设与实践探索13、绿色食品蔬菜生产植物保护技术14、可持续发展与植物保护15、中国植物保护科学技术发展战略研究16、浅谈园林设计与植物保护17、农业植物保护网络数据库的开发及应用18、面向21世纪的植物医学──植物保护的再认识和植物害物治理的新策略19、植物保护专业教学改革探析20、地理信息系统在植物保护领域中的应用。
几丁质酶在农业方面的应用研究概况
几丁质酶在农业方面的应用研究概况作者：唐梦君有利利倪红来源：《南方农业·上旬》2017年第01期摘要目前，合成类杀虫剂和杀真菌剂的滥用造成了严重的环境污染。
而几丁质酶有潜在的抗含几丁质的病原体的特性，因此在农业方面应用前景广泛。
综述了在几丁质酶抗植物病原真菌、杀虫、抗细菌和果蔬采后病害的防治等方面的应用研究情况。
在此基础上，对几丁质酶在生物农业上的应用前景进行了展望。
关键词几丁质酶；生物防治；农业；应用研究中图分类号：Q814.9；S476 文献标志码：A DOI：10.19415/ki.1673-890x.2017.1.014知网出版网址：http：///kcms/detail/50.1186.s.20170123.1758.023.html 网络出版时间：2017-1-23 17：58：00如今，控制害虫和植物疾病最常用的方法是使用化学试剂，但是这给环境造成了巨大影响。
几丁质是一种天然多聚物，是寡聚体N-乙酰葡糖胺由β-1，4-糖苷键连接而成的，几丁质广泛存在于昆虫等甲壳类动物的外壳、软体动物器官以及多数真菌的胞壁中。
几丁质酶是一种能够将几丁质水解成N-乙酰葡糖胺的糖苷酶[1]，它作为一种天然溶菌酶类，在抗植物病原真菌、杀线虫作用、抗细菌以及果蔬采后病害等的生物防治方面都有应用，再加上它具有可诱导性、安全无毒副作用[2]等特点，在农业上的应用范围正在不断扩大。
1 在抗植物病原真菌方面的应用由真菌病原体引起的植物疾病使全球重要的农作物损失巨大。
传统的合成杀菌剂对人体健康和环境有明显的不良影响。
而大多数真菌的细胞壁都含有几丁质，几丁质酶可以通过破坏植物病原真菌的细胞壁使其受损死亡[2]，即几丁质酶可以杀死一些真菌，且不良影响较小。
已有研究表明，微生物几丁质酶能够用于防治由植物病原真菌引起的粮食作物病害。
如Karin等人发现苏云金芽孢杆菌BUPM255的培养基上清具有高抗真菌A. niger活性；还报道了一种分离自苏云金杆菌无性系种群的纯化几丁质酶，它表现出了对6种植物病原真菌细胞壁的溶解活性，并对镰刀菌（Fusarium sp.）等的菌丝生长有抑制作用[3]。
几丁质酶产生菌的筛选及其对小麦根腐病菌的抑制作用
在基 础培养 基 中加入 ２０ ． ％细粉几 丁质 。
１２ ． Ｐ ＴＹ培 养 基 ．． ３ Ｇ ２
ｌ 材 料 与方 法
１１ 试验 材料 ．
土豆浸出物 ２０ ，葡萄糖 ２ ｇ 蛋白胨 ２ ， ０ｇ ０， ｇ 酵
母浸膏 ２ ，琼脂 １ ｇ ２ ００ ，调至 ｐ ． ｇ ７ ，ＨＯ１ ０ ｍＬ Ｈ７ 。 ５
１ ． 培 养基 的制备 ．２ ２
１ ． １ 富集培养基的制备 ．２ ２．
小麦叶部根腐病是黑龙江省春小麦的主要病害
之 一 ，它不 仅使小 麦产 量下 降 ，而且 由于形成 大量 籽 粒黑胚 而影 响小 麦加工 品质 和营养 品质 ，所 以每 年 都造 成 巨大 的经 济损 失［ ２ １ 。本研 究 是 以小 麦 叶部
２０ ・ ｉ ２ ｍ ｎ ｒ 振荡培养 ６ 。将培养液以 ４ ０ ｒｎ ｄ ０ｒａ ０ ・ｉ
离 心 １ ｎ ５ｍｉ。取 上 清 液 加 入 固 体 硫 酸 铵 到 ８ ％ ０
饱 和度 ，４℃下静 置 过夜 ，离心 取沉 淀溶 解 于 ０１ ｏ・ 的氯化钠溶液中即得粗酶液。 ． ｔｌ ５ ｏ Ｌ
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东
北
农 业
大 学
学
报
第３ 卷 ７
水 ，在 ３ ７℃振荡 培养 ４ｄ ，静 置 １ ｉ，取 １ｍ ０ｍｎ Ｌ 上 清 液加 入 ２ ５ｍＬ富集 培 养基 中， ３ ￣ 在 ７Ｃ振荡 培 养 ６ｄ 。从 第 ３天 起 每天 取 样 ，经适 当稀 释 后涂 几 丁
几丁质酶产生 菌的筛选及其对 小麦根腐病菌 的抑 制作用
郭玉莲 ，魏相峰 ，赵伯 福。 ，郑铁 军 ，李宝英
（． １ 黑龙江省农科院农药应用研究中心，黑龙江 哈尔滨 １０ ８ ：２ 肇东市农技推广中心，黑龙江 肇东 ５０６ ． １ １０ ） ５ １０ １ １０ ： ５ １０
微生物几丁质酶的特性及其应用的研究进展
微生物几丁质酶的特性及其应用的研究进展李丽;杨雪松;刘红全【摘要】几丁质酶可以降解几丁质,其降解产物可以用于抗虫、医药、化工、食品等领域.目前已从微生物中获得多种几丁质酶并克隆其几丁质酶基因.本文主要对产几丁质酶微生物的分类及其分布特点、微生物几丁质酶的性质、结构、基因调节及应用等进行综述.【期刊名称】《广西民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(017)001【总页数】5页(P92-96)【关键词】几丁质酶;微生物;分类;特性;应用【作者】李丽;杨雪松;刘红全【作者单位】广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁530006;广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁530006;广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁530006【正文语种】中文【中图分类】Q936几丁质又称为甲壳素，它是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的长链多聚物[1]，也是自然界中第二丰富的多聚糖[2].每年自然界中产生的几丁质数量极其巨大，几丁质及其降解产物作为重要的有机碳源和氮源参与生态系统的物质交换和能量流动[3].几丁质酶能催化分解几丁质，产生几丁寡糖和几丁二糖.几丁质酶的水解产物低聚糖有抗菌作用，可以调节生物体的免疫力，还可以抑制肿瘤细胞的生长等.几丁质酶对植物真菌病害的防治也有作用.因此，几丁质酶在食品、医药、农业以及化妆品等行业具有独特的使用价值[4].目前，在植物、动物和微生物中都发现了几丁质酶.绝大多数高等植物中都可以产生几丁质酶，几丁质酶主要分布于植物根、茎、叶和愈伤组织中[5]，在感染了真菌的时候，这些部位几丁质酶的含量明显增高，从而避免植物遭受某些真菌或害虫的侵害[6].一些细菌和真菌能够利用几丁质，说明在这些细菌和真菌中存在几丁质酶 [7].近年来，微生物几丁质酶的研究受到人们的重视.Cottrell认为至少10%的海洋可培养细菌能水解几丁质，Wang等认为有25%～50%的土壤链霉菌能产几丁质酶[5].现已从多种微生物中分离出了几丁质酶[8]，对微生物几丁质酶的分布、定位、结构、性质、基因克隆、诱导表达以及调控机制等多方面的研究均取得了一定进展.1 产几丁质酶微生物的分类及其分布特点近年来研究发现，产生几丁质酶的微生物主要有细菌、放线菌、真菌和病毒等[9].细菌主要有杆菌属的环状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蓝黑紫色杆菌、巨大芽孢杆菌、成团肠杆菌；沙雷氏菌属的液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌；单胞菌属如嗜水气单胞菌、交替单胞菌属O-7株；弧菌属的哈氏弧菌、弗氏弧菌、创伤弧菌；梭菌属的类腐败梭菌、产气荚膜梭菌、热纤维梭菌；还有蚀几丁质贝内克氏菌、铜绿假单胞、黄单胞菌属、嗜麦芽假单胞菌等.放线菌主要有褶皱链霉菌、灰色链霉菌、天蓝色链霉菌、浅天青链霉菌、热紫链霉菌、浅青紫链霉菌、淡紫灰链霉菌、橄榄绿链霉菌、葱绿毛链霉菌等.真菌主要有白僵菌、构巢曲霉、少孢根霉、木霉属酿酒酵母、白色扁丝霉、白色念珠菌等.病毒类有小球藻病毒PBCV-1、苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV)、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)、苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)、杆状病毒等[8].微生物产生几丁质酶的形式并不是单一的，已发现的几丁质酶产生细菌都可以同时产生几种不同的几丁质酶，并且这些几丁质酶的类别、组成和性质等是不同的[10].例如酿酒酵母能产生2种内切几丁质酶cts1和cts2；粘质沙雷氏菌可以产生相对分子质量为21000～57000不等的5种几丁质酶；交替单胞菌属O-7株能产生chiA、chiB、chiC和chiD四种不同的几丁质酶；所以，微生物产生几丁质酶具有多样性的特点，这也使微生物适应环境的能力有所提高.产几丁质酶的微生物分布很广泛.细菌中G+和G-菌中大部分能产生几丁质酶.自然界中，海洋、河流和土壤中都分布着大量几丁质酶产生菌，其中一些滩、海水、盐碱地、盐场、温泉是碱性几丁质酶产生菌理想的分布场所.几丁质酶产生菌分布广泛这一特点，为研究几丁质酶提供了更广阔的空间[7].2 微生物几丁质酶的分类几丁质酶可以依据它的结构和性质进行分类.根据反应的所需的最适pH值，可分为酸性、中性和碱性几丁质酶.根据底物作用部位和产物的不同，可以分为外切几丁质酶和内切几丁质酶.外切几丁质酶的作用部位是底物寡糖链的非还原性末端，将单糖一次切下来；内切几丁质酶的作用部位是底物寡糖的糖苷键，所获得的水解产物是几丁寡糖和几丁二糖.根据分泌性质的不同，可以分为胞外几丁质酶和胞内几丁质酶，相当部分的微生物能够产生胞外酶.按照国际酶学的标准，根据氨基酸序列的同源性，几丁质酶又可以分为18和19两个家族.微生物几丁质酶主要是18家族，19家族主要是指植物几丁质酶.3 微生物几丁质酶的基本性质微生物几丁质酶的分子量大小有很大的差异性，大小一般在20～100 KD之间[11]，通常放线菌产几丁质酶的分子量多在30 KD[12]，而细菌、真菌所产酶分子量变化较大.一种微生物不只产生一种几丁质酶，可以同时产生几种分子大小的几丁质酶，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens )可以同时产生5种分子大小的几丁质酶，分别为21、36、48、52、57 KD[13].大部分微生物几丁质酶是酸性蛋白，等电点一般是3.6～8.6，最适pH值范围一般为3～11.如红霉素链霉菌(S.erythraeus)产几丁质酶的pI为3.7，而烬灰红链霉菌(S.cinerecruber)产几丁质酶的pI为8.6 [12].微生物几丁质酶对热比较稳定，在4℃～60℃之间都具有酶活性，有些酶的活性温度甚至接近于100℃.例如激烈热球菌的几丁质酶在98℃～100℃仍然有活性，地衣芽孢杆菌的几丁质酶在100℃处理10 min后仍有一半多活性[7].大部分微生物几丁质酶的产生需要在相应几丁质的诱导下产生，通常几丁质、脱乙酰几丁质以及几丁质水解产物对几丁质酶的产生均有诱导作用，但几丁单糖没有诱导作用.微生物几丁质酶的活性，还会受一些金属离子的影响.一些金属离子如K+、Na+、Mg2+、Ca2+等对微生物产几丁质酶活力没有抑制作用，而具有激活作用，例如1～40 mmol/L的Mg2+；Fe3+对Bt几丁质酶有一定的抑制作用，在浓度12 mmol/L时可使酶活力降低54.6 %[14].一些重金属离子如Hg2+、Pb2+、Cu2+等对几丁质酶一般有抑制作用，它们可使酶变性而导致失活[9,11].4 微生物几丁质酶的结构不同几丁质酶差异较大，多数微生物几丁质酶的基因以单拷贝形式存在，包括启动子、SD序列、结构基因和终止子，这与原核生物的基因结构相似.在相应的蛋白结构上从N端到C端依次为信号肽、几丁质酶催化区、几丁质酶结合区和一个C端区域.信号肽在该基因结构中占很大比重，因为大多数微生物几丁质酶是胞外分泌酶，所以信号肽起着很大的作用[15].信号肽的断裂位点通常在两个Ala之间，但是有些微生物几丁质酶基因的表达体发生变化时，其信号肽的断裂位点会发生变化，断裂位点可能在Ala与另一种氨基酸之间发生.有些微生物信号肽可能会出现表达载体中无法进行分泌表达的现象.信号肽的长短因微生物的不同而不同，如果同源性高那么信号肽的相似性就比较高.有些细菌的几丁质酶基因转移到宿主细胞以后，几丁质酶基因的信号肽的断裂位点会发生改变，可能是由于不同的细菌对蛋白的输出机制不同引起的[5].几丁质酶发挥催化作用的关键部位是催化区，这一部分的同源性很高，它们都含有两个高度保守的区段.有的微生物几丁质酶有两个催化区，这样可以增强酶活性.结合区起到识别并结合相应的底物的作用，它不会增加酶催化的效率.结合区具有保守的6个半胱氨酸的结构，结合区对于酶催化不可溶的几丁质是必需的，而对于可溶的几丁质底物，结合区则不是必需的[16].结合区中的6个半胱氨酸是必需基团，任何一个半胱氨酸的缺失都会导致结合功能的丧失[17].N 端和C端合区的结合速度是不同的，一般N端催化底物结合的速度比C端快.N端表现的是外切酶的活性，C端表现的是内切酶的活性，并且有实验证明其内切活性要比外切活性高.目前对于18家族几丁质酶研究发现，催化区都含有2个Asp和1个Glu，可能是18家族几丁质酶发挥活性的关键氨基酸.位于18家族β3和β4链上的两段氨基酸序列是高度保守的.18家族几丁质酶蛋白质的三级结构是相似的，都具有由α螺旋和β折叠构成的圆桶形结构，中心是由平行的β折叠结构组成的内桶.β1～β8依次由α螺旋结构连接，β折叠和α螺旋由一段无规卷曲连接起来.19家族几丁质酶的三级结构和溶菌酶的三级结构比较相似.18和19家族的水解产物有所不同，18家族的水解产物是β异构体，19家族的水解产物是α异构体，催化水解产物的不同是由催化机理的差异产生的[8].5 微生物几丁质酶基因的表达调控微生物几丁质酶基因的表达调控是抑制物/诱导物的双向调控.几丁质或其降解物对表达起到诱导作用，而一些易被利用的碳源如葡萄糖常起到抑制剂的作用.例如在木霉的培养基中加入几丁质发现有高活性的几丁质酶表达，加入纤维素、壳聚糖则不能增加几丁质酶的合成，反而还会阻遏几丁质酶的合成.在这种抑制物/诱导物体系中，N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖的存在都会抑制几丁质酶的高水平表达，但培养基中仍有少量几丁质酶的表达.还有人发现在高诱导物存在的情况下，即使有抑制物的存在仍有少量几丁质酶表达.因此，有人推测产几丁质酶的微生物中有一部分几丁质酶是组成型表达的[8].有研究发现，微生物几丁质酶基因的调控系统对自身可能有一定保护作用.在所有的培养过程中，壳二糖酶的表达总是伴随着几丁质酶的表达，壳二糖酶的作用是对起抑制作用的几丁质酶降解产物-N-乙酰葡萄糖胺进行有效降解.那么具有这种系统的产几丁质酶微生物可能是为了满足自身营养需要，而抑制物/诱导物系统能够防止几丁质酶过量表达对微生物自身伤害[8].由于几丁质的多样性，所以产生的几丁质酶各异，不同几丁质酶可以同工酶的形式分泌并相互有顺序的进行调节，构成了几丁质酶基因调节的多样性[7].对大多数产几丁质酶的微生物来说，葡萄糖能够抑制几丁质酶的高表达.例如18家族和19家族的几丁质酶有相似与葡萄糖有关的调控系统，他们启动子区有一对相似的直接重复序列同几丁质的诱导及葡萄糖的抑制有关.该调控系统和菌体的能量代谢系统有关，且受分解代谢产物的阻遏.6 微生物几丁质酶的应用6.1 微生物几丁质酶基因在植物抗病方面的研究应用病虫害是植物所面临主要病害之一，生物防治可以有效的减少传统农药在农业病害防治中所带来的环境污染等负面影响[18].近年，许多科学家开始关注生物防治农业病害，研究出许多具有强抗虫特性的转基因植物，由于几丁质酶的抗虫特性，利用几丁质酶基因防治植物病虫害也成为人们关注的热点[19-22].昆虫的体表以及部分消化系统的成分含有几丁质，几丁质酶将昆虫的几丁质成分水解，昆虫因无法正常的生长发育而死亡，这种方法高效性强.一些科学家将真菌的几丁质酶基因转入植物增加了植物的抗病虫性，已经获得成功的转基因植物包括烟草、马铃薯、矮牵牛、大豆、棉花、水稻和玉米等[23-26].在害虫防治方面，几丁质酶还具有增效作用.比如几丁质酶对苏云金芽孢杆菌制剂有增效作用.主要原因是许多昆虫围食膜的主要成分是几丁质，围食膜是昆虫防止病原细菌或病毒感染的一道天然屏障.少量几丁质水解昆虫幼虫肠中的几丁质后，对于苏云金芽孢杆菌制剂侵染害虫幼虫起到辅助作用.从而加速幼虫患病，提高幼虫死亡率[27,28].6.2 几丁质酶的水解产物可作为生长促进因子几丁质酶的某些水解产物还是促进生长的生长因子.N-乙酰几丁寡糖可促进肠道内有益菌的增殖，同时可以抑制大肠杆菌及肠道内病原菌是生长[28].对于双歧杆菌促进因子(Bifidus factors, BF)的研究结果显示，几丁寡糖和壳寡糖是BF的重要种类，它们可以促进双歧杆菌的生长，调节动物肠道内微生物的代谢活动，改善肠道内微生物的分布.这些水解产物对于提高动物的免疫系统及营养物质的吸收发挥了重要作用.6.3 在调节生命代谢活动中的应用几丁质酶降解几丁质可获得具有生物活性的寡糖片段-氨基寡糖素.氨基寡糖素在调节植物细胞生命代谢活动中起着重要的作用.作为植物功能调节剂，可以调控植物基因的关闭与开放，还可以诱导植物产生抗性酶，调节植物的生长和增强植物对病原真菌的抗性.6.4 其他方面应用的研究进展现在的环境污染问题是全球关注的焦点问题，将产几丁质酶微生物应用于治理环境污染方面的研究进来有所进展.人们的日常生活会产生很多几丁质废弃物，例如一些蟹壳、虾壳等生活废弃物，以及这些废弃物造成水体污染都会带来很大的环境污染问题[29].当然，除了生活污染还有工业带来的污染问题.为了很好的解决这些环境问题，人们开始大量研究用产几丁质酶微生物处理几丁质来解决它所带来的污染问题.产几丁质酶微生物应用前景是相当广泛的，它们的分布和种类优势是进行相关研究的有利条件.同时，还可以进行于生物制剂生产的研究.目前，很多关于产几丁质酶微生物以几丁质作为碳源的研究有了一定进展，这一研究还可以应用于它们的抑菌研究.7 展望随着几丁质酶基础理论和应用研究日益受到重视，几丁质酶研究已成为几丁质科学中的一个重要分支，其应用前景十分广阔，可应用于医药、化工、功能食品、纺织、印染、造纸及环境保护等诸多工业部门和领域.我国对几丁质酶的研究起步较晚，但近年来国内对几丁质酶基因的研究也日益重视，目前已经分离出了多种几丁质降解菌，并已从多种微生物克隆出了几丁质酶基因.目前，虽然对几丁质酶及其基因的研究报道较多，但由于其多样性、调控机理的复杂性，再加上从自然界中分离到的酶活性不是太高，因此距离工业应用的要求还有一定距离.今后应进一步加强对几丁质酶基础理论的研究，并利用现代生物学技术对现有的几丁质酶进行定向改造或筛选出新的活性更强的几丁质酶，以适应工业化生产的需要.[参考文献]【相关文献】[1]Wen-Teish Chang, San-Lang Wang. 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虾蟹壳中的几丁质
一般而言，虾蟹壳主要是由几丁质（chitin）、蛋白质与矿物质三种成分结合而成，重量大约各占三分之一，但是随着虾蟹的产地不同或是品种不同，其比例会有所改变，其中矿物质的主要成分是钙盐（碳酸钙）。
目前大量生产几丁质（又称甲壳质）的方式，主要是以虾蟹的外壳或乌贼的软骨为原料，首先经洗净、干燥及粉碎，室温下用1当量浓度盐酸处理、离心、水洗后，再用摄氏100 度的一当量浓度氢氧化钠水溶液处理，最后再以乙醇加热环流处理。
其中使用盐酸是为了去除钙盐（或其它矿物质），使用氢氧化钠是为了去除蛋白质，而使用乙醇是为了去除脂质与色素。
所得到的几丁质为白色粉末状，重量约占干虾蟹壳总重的30％。
何谓几丁质、几丁聚糖一、几丁质、几丁聚糖之命名几丁质及几丁聚糖之英文名分别为chitin ，chitosan，是源自希腊字语意为铠甲的chiton(发音为ㄎㄞㄊㄨㄥ)，因而正式之英语发音分别为“ㄎㄞㄊ一ㄥ(chitin)”及“ㄎㄞㄊㄡㄙㄢ(chitosan)”；日本人则依来外语发音方式分别称之为“ㄎ一ㄘ一ㄥ(kichin)”，“ㄎ一ㄊㄡㄕㄢ(kitosan)”；中国则依来自甲壳类动物而将之统称为“甲壳素”或“甲壳质”。
至于我国何以会将chitin称为“几丁质”，而将chitosan称为“几丁聚醣”实难考究，本人推测可能是不知哪位学术界前辈依照传统(标准)的英语发音方式，将chitin发音为“ㄔ一ㄉ一ㄥ”，因而直接将之译为“几丁”，至于“质”则可能是采用蛋白质或脂质等化合物皆有质字结尾，因而于“几丁”后面加上“质”而成了所谓的“几丁质”。
另外有关“几丁聚醣”的译命方面，何以会于“几丁”后面加上“聚醣”，推测可能是与此类物质属于多糖类有关。
二、几丁质、几丁聚糖之分布几丁质在自然界中分布极为广泛，于植物细胞壁的组成分、动物中的上角皮层组织(epithelium cuticle)、海洋无脊椎动物、昆虫的外壳以及真菌菌体的细胞壁中，都可发现几丁质的存在。
微生物几丁质酶研究概况及其在食品工程中的应用
（ 华大学生物工程学院 ， 西 四川 成 都 ，１ ０ ９ ６０ ３ ） 摘 要 ： 丁 质 酶 主要 产 生 于微 生 物 ， 降解 产 物 应 用极 其 广 泛 ， 解 几 丁 质 ， 生 的氨 基 寡 糖 素 可 调 节植 物 细胞 生 几 其 降 产
命代 谢 活 动 ； 生 的 Ｎ一乙酰 几 丁寡 糖 和 壳聚 几 丁寡 糖 可 用作 食 品添 加 剂 和 生 长促 进 因子 。另外 在 抗 病 基 因工 程 中 ， 产
ａ ｏ ｈ ｒｄ ｇ ａ ａ ｏ ｒｄ ｃ， ｏ ｌ ｅ ｕ ｅ ｓｆ ｏ ｄ ｉ ｖ ｒｐ ｓｔ ｅ ｇ ｏ ｈ ｆ ｃｏ ． ｎ ａ ｄ ｔ ｎ ｃ ｉ ｎ ｓ ｓｐ ｐ ｌ ｒ ｎ ｔ ｅ ｅ ｒｄ ｔ ｎ ｐ ｏ ｕ ｔ ｃ ｕ ｄ ｂ ｓ ｄ ａ ｏ ｄ ａ ｄ ｔ ｅ ｏ ｏ ｉ ｖ ｒ ｗｔ ａ ｔｒ Ｉ ｄ ｉ ｏ ， ｈ ｔ ａ ｅｉ ｏ ｕ ａ ｌ ｉ ｉ ｉ ｉ ｉ ｙ ｓｕ ｉｄ ｉ ｉｅ ｓ ｓ— ｓｓａ ｃ ｅ ｅ ｉ ｅ ｇ ｎ ｅ ｎ ｅ ａｅ ｏ ｐ ｅ ｅ ｔ ｅ ｔ Ｔ ｉ ａ ｅ ｅ ｉｗｅ ｆｍｉ ｒｂ ａ ｃ ｉ ｎ ｓ ｔ ｄ ｅ ｎ ｄ ｓ ａ ｅ — ｅ ｉｔｎ ｅ ｇ ｎ ｔ ｎ ｉ ｅ ｒ ｇ ｒ ｌ ｔｄ ｔ ｒｖ ｎ ｓ． ｈ ｓｐ ｐ ｒｒ ｖｅ ｄ ｏ ｃ ｏ ｉｌ ｈ ｆ ａ ｅ ｒ ｃ ｉ ｐ ｉ
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动物营养学 名词解释
1.过瘤胃蛋白：就是将一生蛋白质经过处理，避免在瘤胃内被发酵、降解而直接进入小肠后再被消化吸收，从而达到提高饲料蛋白质利用率的目的。
提高饲料中过瘤胃蛋白质数量、减少饲料蛋白质在瘤胃中的降解率的方法。
：1加热处理蛋白质补充料可降低瘤胃液中氨的生成速度。
2 用甲醛处理蛋白质补充料可降低其在瘤胃的降解率，而对饲料的消化率无影响。
2.尿素循环：即“乌氨酸循环”。
是机体对氨的一种解毒方式。
肝脏是尿素循环的重要器官，这一过程包括三个阶段：1、氨、CO2和乌氨酸缩合成瓜氨酸。
2、瓜氨酸再与氨结合脱去水，生成精氨酸。
3、精氨酸在肝脏精氨酸酶的作用下，水解成尿素和乌氨酸。
每循环一次可将2分子氨和1分子CO2变成1分子尿素和1分子水。
3.体增热：犬采食饲料后伴有热增加现象，这种因采食而增加的产热量称为体增热。
4.基础代谢率：在自然温度环境中，人体在非活动的状态下（包括消化系统，即禁食两小时以上），维持生命所需消耗的最低能量，会随着年龄的增加和体重的降低而降低，而随着肌肉的增加而增加。
而人体在清醒而极端安静的情况下，不受精神紧张、肌肉活动、食物和环境温度等因素影响时的能力代谢率就是基础代谢。
5.脂溶性维生素：由长的碳氢链或稠环组成的聚戊二烯化合物。
脂溶性维生素包括维生素A、D、E和K，它们都含有环结构和长的、脂肪族烃链，这四种维生素尽管每一种都至少有一个极性基团，但都高度疏水的。
某些脂溶性维生素并不是辅酶的前体，而且不用进行化学修饰就可被生物体利用。
这类维生素能被动物贮存。
6.几丁质：节肢动物体表外骨骼的主要成分。
由碳水化合物和氨分子组合而成。
几丁质是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生自然资源，广泛存在于海洋中，其降解产物具有多种用途。
几丁质又称甲壳素或架桥质，是大多数真菌的细胞壁成分，也是真菌病害有效防治的限制因子之一。
由于几丁质酶对真菌细胞壁物质有降解作用，故对于真菌病害的防治具有潜在的应用前景。
几丁质酶的种类有微生物几丁质酶、植3物几丁质酶和动物几丁质酶。
几丁质酶抑制剂筛选模型的建立及应用
活化后的菌株接种于液体培养基细菌３７＂Ｃ振荡培养２ｄ，放线菌２８＂Ｃ振荡培养５ｄ，培养液
５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清检测活性。 ２．５几丁质酶抑制物的检测方法 ２．５．１初筛：平板透明圈法 把酶液与筛选菌株培养液按ｌ：２的比例混合，在几丁质酶抑制化合物筛选平板上打孔，取
混合液３０此加样于孔中，观察平板透明圈的大小。在检测过程中以缓冲液作为空白对照。
剂１２】。到目前为止，比较有效的几丁质酶抑制剂主要还是ａｌｌｏｓａｍｉｄｉｎｔ３Ｊ和环五肽（ａｒｇｉｆｉｎｔ４】和
ａｒｇａｄｉｎＮ）等天然化合物，因为它们都是属于在纳摩尔浓度下就能有效发挥抑制作用的酶抑制剂。 随着组合化学和天然化学的发展，化合物的数量增长巨大。在新药研究发现过程中，筛选越 来越多占有重要地位１６ｊ。建立相应的药物筛选模型是大规模筛选的重要环节。本研究直接从蚕蛹 中提取酶，建立以平板透明圈法为初筛法和ＤＮＳ比色法为复筛方法，从我国丰富的微生物资源中 获得几丁质酶抑制化合物的生产菌株，以其从中发现对几丁质酶具有良好抑制作用的化合物，为 开发具有新型作用点的杀虫抗真菌药物奠定基础。
以Ｎ．乙酰．Ｄ．氨基葡萄糖的生成速度测定酶活性大小。４５＂Ｃ下，以Ｎ乙酰．Ｄ．氨基葡萄糖为
标准，每小时产生Ｉｐ．ｍｏｌＦＬ Ｎ．乙酰．Ｄ．氨基葡萄糖所需的酶量为一个活力单位（ＩＵ）。
胶体几丁质＋几丁质酶＿Ｎ．乙酰．Ｄ．氨基葡萄糖
在装有预热至４５＂Ｃ的０．５ ｍＬ １％胶体几丁质和Ｏ．５
ｍＬ
０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ｐＨ ６．０）比色管
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｅｓａｎｉｔｈＣ（ｉｂｈｎＩＩｎｈｉｂｉｔｏｒ
虾蟹壳中的几丁质
一般而言，虾蟹壳主要是由几丁质（chitin）、蛋白质与矿物质三种成分结合而成，重量大约各占三分之一，但是随着虾蟹的产地不同或是品种不同，其比例会有所改变，其中矿物质的主要成分是钙盐（碳酸钙）。
目前大量生产几丁质（又称甲壳质）的方式，主要是以虾蟹的外壳或乌贼的软骨为原料，首先经洗净、干燥及粉碎，室温下用1当量浓度盐酸处理、离心、水洗后，再用摄氏100度的一当量浓度氢氧化钠水溶液处理，最后再以乙醇加热环流处理。
其中使用盐酸是为了去除钙盐（或其它矿物质），使用氢氧化钠是为了去除蛋白质，而使用乙醇是为了去除脂质与色素。
所得到的几丁质为白色粉末状，重量约占干虾蟹壳总重的30％。
何谓几丁质、几丁聚糖一、几丁质、几丁聚糖之命名几丁质及几丁聚糖之英文名分别为chitin，chitosan,是源自希腊字语意为铠甲的chiton （发音为石万去乂厶），因而正式之英语发音分别为“石万去一厶（chitin）”及“石万去只厶^（chitosan）”；日本人则依来外语发音方式分别称之为“石一专一厶（kichin）”，“石一去只尸马（kitosan）”；中国则依来自甲壳类动物而将之统称为“甲壳素”或“甲壳质”至于我国何以会将chitin称为“几丁质”，而将chitosan称为“几丁聚醣”实难考究，本人推测可能是不知哪位学术界前辈依照传统（标准）的英语发音方式，将chitin发音为“彳一力一ㄥ”，因而直接将之译为“几丁”，至于“质”则可能是采用蛋白质或脂质等化合物皆有质字结尾，因而于“几丁”后面加上“质”而成了所谓的“几丁质”。
另外有关“几丁聚醣”的译命方面，何以会于“几丁”后面加上“聚醣”，推测可能是与此类物质属于多糖类有关。
二、几丁质、几丁聚糖之分布几丁质在自然界中分布极为广泛，于植物细胞壁的组成分、动物中的上角皮层组织（epitheliumcuticle）、海洋无脊椎动物、昆虫的外壳以及真菌菌体的细胞壁中，都可发现几丁质的存在。
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几丁质酶在植物病害生物防治中的应用来源：中国论文下载中心[ 10-12-29 09:49:00 ] 编辑：studa20作者：许梦秋钟增明龚琰谢响明摘要主要对几丁质酶的特性、功能及其在植物真菌病害防治中的应用进行了综合论述。
在此基础上,对几丁质酶在植物病害生物防治中的应用前景进行了展望。
关键词几丁质酶;生物防治;植物病害;应用AbstractIn this paper,characteristic,function and prevent plant diseases of chitinase were summarized. On this basis,the prospects of chitinase applications in biocontrol of plant disease were promised.Key wordschitinase;biocontrol;plant diseases;application几丁质酶广泛存在于各种植物、动物及微生物细胞和组织中,参与多种生理过程[1]。
几丁质酶可以有效降解几丁质,在自然界的物质循环中起着不可替代的作用。
几丁质是构成大多数真菌细胞壁的主要成分,在自然界中存在数量巨大,它能在几丁质酶系作用下被分解成N-乙酰氨基葡萄单糖(NAG)。
在环境保护、医药、食品和基础生命科学研究中具有巨大的潜在应用价值[1]。
在目前的研究中,将细菌及植物几丁质酶基因转入烟草、番茄、大豆、马铃薯、莴苣和甜菜等植物中,获得的转基因植物高效表达几丁质酶的生物活性,可显著抵抗真菌病害[2],此外将几丁质酶基因转入生防真菌中,也能显著提高生防真菌拮抗植物病害的能力[3]。
1几丁质酶性质与特点自从1905年Benecke首次分离报导了几丁质芽孢杆菌(Bacillus chitinovirous)能生产几丁质酶以来,已发现了许多产几丁质酶的微生物,包括细菌、放线菌、真菌等,其中以Serratiu marcescens和Trichoderma harzianum的几丁质酶基因研究最多[4]。
几丁质酶可划分为内切几丁质酶、外切几丁质酶和壳二糖酶。
依据酶反应的最终产物将几丁质酶分为3类:一是内切几丁质酶,该类酶可随意裂解几丁质和几丁质寡聚物并释放出可溶性低分子量混合物,(GlcNAc)2即双乙酰几丁二糖是主要成分;二是壳二糖酶,可从非还原端裂解几丁质和几丁质寡聚物((GlcNAc)n),释放的最终产物主要是(GlcNAc)2;三是β-N-乙酰氨基己糖苷酶,同壳二糖酶一样可从非还原端裂解几丁质和几丁质寡聚物,释放N-乙酰葡糖胺单体(GlcNAc),它也是唯一可水解(GlcNAc)2的酶。
几丁质酶具有以下特点:一是多样性,不同微生物所产生的几丁质酶的类别、组分、性质不尽相同,已发现的产生胞外几丁质酶的微生物约有46属70种。
不同几丁质酶的最适温度、分子量、等电点、影响酶活性的金属离子等均存在明显差异。
二是诱导性,多数微生物只有在含有几丁质等诱导物的培养基中才能产生几丁质酶,也有些微生物在没有诱导物的情况下产生几丁质酶。
几丁质、脱乙酞几丁质、部分水解的几丁质均可以诱导几丁质酶的产生,但几丁单糖(NAG)则不能。
各种诱导物对不同微生物的诱导作用亦有所不同,并且几丁质酶的诱导可被过量的可溶性代谢物所阻遏。
三是分泌性,微生物所产的几丁质酶多是分泌型的,即在诱导物存在的条件下,微生物可以产生并向胞外分泌几丁质酶。
该酶先在微生物的体外将几丁质分解,生成几丁单糖(NAG)或寡糖,然后这些糖再被微生物吸收和利用。
几丁质酶的分子结构主要包括信号肽序列、几丁质酶催化区、几丁质结合区域、C端区域。
其中几丁质酶催化区(具2个高度保守区,Glu(E)和Asp(D)残基高度保守)、几丁质结合区域(植物几丁质酶的几丁质结合区主要含有半胱氨酸残基,微生物几丁质酶的几丁质结合区主要含有色氨酸残基)催化区域相似的几丁质酶,它们的几丁质结合区域并不相类似,但是来源于同一菌株的酶的几丁质结合区域具有相似性,即与菌株的亲缘关系有联系[5]。
2几丁质酶在植物病害生物防治中的作用微生物几丁质酶能够水解植物病原真菌细胞壁的成分几丁质,参与菌寄生菌对寄主真菌的侵染过程,消解寄主真菌细胞壁和杀死寄主真菌,从而获得营养。
一般几丁质酶只对真菌新生细胞如芽管和菌丝顶端细胞壁具有破坏作用。
大多数丝状真菌在生长过程中,菌丝顶端同时合成几丁质和β-1,3-葡聚糖,交联形成几丁质、葡聚糖或其他多糖,菌丝顶端暴露的几丁质链会被几丁质酶所水解。
微生物几丁质酶可通过分解几丁质来抑制真菌菌丝生长,使顶端细胞壁变薄,继而形成球状突起,最后细胞壁降解、原生质膜破裂;几丁质酶破坏菌丝端部生长,使真菌孢子萌发、芽管伸长和菌丝生长受阻,芽管和附着胞解体。
几丁质酶酶解几丁质的产物几丁寡糖,具有抗菌、抑菌性能,可以直接杀死病原真菌,还可以作为植物功能调节剂,促进植物生长发育。
几丁寡糖在调节植物细胞代谢活动、提高植物防御能力等方面具有很好的作用,并且具有较强的抑菌、抗菌作用,能够抑制病原物的侵入或扩展;特别是聚合度较高的几丁寡糖,能够阻碍病原物生长。
几丁寡糖可以作为植物功能调节剂,促进植物蛋白质合成,活化植物细胞,调节植物基因表达,刺激植物生长。
几丁质酶作为激发子启动植物防御反应,使植物产生更多的防御蛋白,增强植物对病原物的抗性。
几丁质酶在植物中也许不是直接参与防御反应,而是通过水解侵入的真菌菌丝细胞壁产生信号因子,启动植物的防御反应,导致植物产生和积累抗病性物质。
几丁寡糖可以作为激发子,在植物防御反应中充当信号因子,迅速启动植物的防御反应,诱导植物细胞对病原菌入侵作出反应,调节与抗病性有关的过氧化物酶(PO)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)及苯丙氨酸解氨酶(PAL)等酶活性变化,产生植保素、酚类化合物等抗菌物质,使植物体内发病相关蛋白(PR蛋白,Pathogenesis Related Protein)含量升高。
几丁寡糖在植物体内可以作为激活植物几丁质酶的诱导物。
3转几丁质酶基因在植物病害生物防治中的应用几丁质酶在真菌的生防过程中具有重要作用这一点已经被广泛证实,在植物与真菌转入几丁质酶基因被认为是提高植物与真菌拮抗病原真菌的重要策略。
利用几丁质酶防治植物真菌病害的策略主要有:一是构建表达几丁质酶的工程菌,释放到土壤防治土传病害;二是构件转基因植物建立植物自身的病害防御系统。
目前研究较多的是从哈茨木霉菌(T.harziarum)纯化的几丁质酶CHIT42(42-kDa),并且对其编码基因ech42进行了克隆。
随着越来越多的几丁质酶基因被克隆,几丁质酶在植保上的应用越来越多。
利用几丁质酶基因培育抗病基因工程植物品种是一条有效的防病途径。
国内外对此做了大量的研究,迄今为止已先后从细菌如S.marcescens、Bacillus circulan等分离到几丁质酶基因,导入植物细胞,获得表达该酶的转基因植物。
主要包括烟草、大豆、番茄、马铃薯等植物,使其获得了对各种病原真菌的抗性[6-8],不但可抑制病原真菌的侵袭,而且对植物线虫、昆虫和其他一些病原生物也有抗性。
与转基因植物相比较,由于生防微生物具有生长周期短、易于研究、便于生产等优点,因此将几丁质酶应用于生防微生物的研究成为植病生防研究的热点。
Baek等对T.virens做了类似研究,发现含有双拷贝正常ech42基因的菌株防治棉花立枯病(R.solani)明显高于含有单拷贝敲除ech42基因的菌株;在木霉T.virens中,cht42基因能明显提高转化菌株的生防能力[9]。
在木霉T.harizanum转几丁质酶基因(chit36)转化子与病原菌R.solani的对峙培养和抗R.solani的盆栽试验中发现转化型与野生株没有分别;而在玻璃纸的转培养试验中发现几丁质酶活性高的转化子对R.solani和Fusarium oxysporum的抑菌效果比野生型好。
但是通过玻璃纸的转培养方法,测定的仅是拮抗真菌的分泌物(包括细胞壁降解酶、抗菌类物质等)对于病原真菌的抑菌效果,不能对其生防效果作出全面评价[10]。
由于各种生防真菌的抗菌机制的侧重点不同,需要利用相应的抗病相关基因才能达到明显的促生防效果,在真菌抗病基因工程中采用的策略也要相应调整。
因此,为了更好地利用抗菌基因和转基因技术,还需要对生防真菌的作用机理作进一步的探索。
4展望植物病原真菌是引起粮食和蔬菜发生病害,造成大量减产的重要原因,它流行广、传播快、危害大,加之没有理想的特效农药,对其中大多数至今仍无有效的防治方法。
而几丁质酶对植物病原真菌的拮抗作用具有广谱性、协同增效作用及降解具有几丁质-葡聚糖复合结构的老熟细胞壁和菌核的特点,有开发应用前景。
我国对几丁质酶的研究起步比较晚,关于几丁质酶在生物防治中的应用在国内的报导很少,因此加强这方面的研究,对于发展我国的农业生产具有重要的意义。
相信随着现代分子生物学和基因工程技术的发展,几丁质酶将会在植物抗病方面发挥更大的作用。
5参考文献[1] 陈三凤,李季伦.几丁质酶研究历史和发展前景[J].微生物学通报,1993,20(3):156-160.[2] 但汉鸿,吴纯仁.植物几丁质酶与病害防治研究进展[J].生物技术通报,1995(2):1-3.[3] BACK J M,HOWELL C R,KENERTEY C M.The role of an extracellular chitinase from Trichoderma virens GV 28-8 in the bioeontrol ofRhi-zoctonia solani[J].Curr Genet,1999(35):41-50.[4] 陈松,黄骏麒.几丁质酶及其在植物抗真菌病中的作用[J].生物学杂志,1997,14(2):1-2.[5] 冯俊丽,朱旭芬.微生物几丁质酶的分子生物学研究[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2004,30(1):102-108.[6] CHEMIN L S.Molecular cloning,structural analysis,and expression in Escheriehia coil ofa ehitinase gene from enterobaeter agglomeram[J].Appl Environ Microbiol,1997,63(3):834-839.[7] ZHU Q,MAHER E A,MASOUD S.Enhanced protection against fungal attack by constitutive co-expression of chitinase and glucanase genes in transgenic tobacco[J].Blotechnology,1994(12):807-812.[8] BOLAR J P,NORELLI J L,WONG K W.Expression of endochitinase from Trichoderma harzinum in ransgenic apple increases resistance to apple scab and reduces vigor[J].Phytopahology,2000(90):72-77.[9] BACK J M,HOWELL C R,KENERTEY C M.The role of anextracellular chitinase from Trichoderma virens GV 28-8 in the bioeontrol of Rhizo-ctonia solani[J].Curr Genet,1999(35):41-50.[10] ELAD Y.Biological control of foliar pathogens by means of Trichoderma harzlartum and potential modes of actin[J].Crop Protection,2000(19):704-709.。