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Northern blot技术
核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot ）（一）Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
（二）Northern Blot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
（三）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。
northern blot
目录
简介 流程
材料电泳胶 探针
应用 优缺点
展开
编辑本段简介
Northern blot 是一种通过检测 RNA 的表达水平来检测基因表达的方法，通过
northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特
定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的 RNA 分子依据
编辑本段优缺点
分析基因的表达可以有很多种不同的方法，除 northern blot 外还有 RT-PC
R、基因芯片、RNA 酶保护实验等。基因芯片常和 northern blot 一起使用，但通
常情况下，northernblot 的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于它可
在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化。与定量 PCR 的高灵敏度相
比，northern blot 显然要逊色不少，但 northern blot 较高的特异性可以有效的减
少实验结果的假阳性。Northern blot 实验中一个主要的问题是存在 RNA 的降解，
所以 northern blot 中所有的实验用品都需要经过除去 RNA 酶的过程，如高温烘
烤、DEPC 处理等。同时，norther blot 中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫
其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是 RNA 分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现 在通指整个实验的过程。Northern blot 在1977年由斯坦福大学 James Alwine，David Kemp 和 George Stark 发明。Northern blotting 实际上依照比它更早发明的一项杂交 技术 Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名，Southern blot 主要用来对 DNA 进行分析。
Northern Blot
Northern Blot继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含poly A尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。
(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。
与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。
(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)但与Soughern杂交不同的是，总RNA 不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；（快速毕业，你提供实验材料，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268）此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。
虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。
一、试剂准备（你提供质粒，我给你免费包装成慢病毒Q往圣科技3452125268）1. 0.5M EDTA: EDTA 16.61g加ddH2O至80ml, 调pH至8.0, 定容至100ml。
（你提供质粒和细胞，我给你免费构建稳定表达细胞系Q往圣科技3452125268）2．50mM NaAc: NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml, 加DEPC 0.5ml, 振荡, 37℃过夜，高压灭菌。
Northern印迹杂交技术PPT教案学习
3、探针标记
探针模 模板、随 机引物 、双蒸
水。 冰块
离心、 混匀。 变性
顺序加
随机引
缓冲液
、dNTP 、dUTP
室温
Klenow 3h
酶，混
匀。
75°C 保温10 Min。
加预冷 无水乙 醇、混 匀。
1000r/min 15min、 去上清 、乙醇洗
-20 涤、真 ℃、 空干燥 2 h 、TE溶解
洗膜：在室温下用50mL 2*SSC， 0.1% SDS 溶液洗膜两次以上，每次 5 min。膜即可以立即用于显色检测或 储存备用（干燥环境中）。
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5.酶联免疫染色
室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。
用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。
[4] 魏春红,李毅.现代分子生物学实验技术[M].高等教育出版 社,2006,156-162.
[5] 汪天虹.分子生物学实验[M].北京大学出版社,2009,76-79.
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、-20°C 备用。
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4.杂交
将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按 20mL/100cm2滤膜计算加入预杂交 液、68℃水浴摇床杂交1-2 h。
将标记好的DNA探针煮沸5min，迅 速在冰上冷却。将探针加入预热的杂 交液中，充分混匀。
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倒去预杂交液，按250mL/c㎡滤膜计 算向杂交袋中加入含地高辛标记探针 的杂交液，68℃杂交6 h以上。
Northern-Blot印迹杂交.ppt
⑤ 检查点样孔。
4. RNA样品的制备：在RNA样品中加入 3 倍体积 的formaldehyde load dye和适当的EB。混匀后， 65℃ 15 min。短暂低速离心后，立即放置于冰 上 5 min。
7．打开真空泵，使压强维持在50~58 mbar； 立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10 min在胶上加1 ml transfer buffer，转移2h。
8．转膜后将膜于1× MOPS Gel Running buffer 中轻轻泡洗10 sec（去残余胶和盐）。
9．用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于 UV交联仪中自动交联。
四、实验步骤
1. 用具的准备：180度烤三角锥瓶、量筒、镊子、 刀片等4h；清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸 泡过夜，用DEPC (diethypyrocarbonate，焦碳酸 二乙酯) 水冲洗，干燥备用；处理DEPC水(2 L) 备用
2．RNAZaP去除用具表面的R、刀片等，然后用 DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测 转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)。
11．将膜在-20℃保存。
12. 探针的制备：
① 在1.5ml离心管中配制以下反应液： 模板DNA(25 ng) 1μl；Random Primer 2 μl ； 灭菌水 11 μl ；总体积：14 μl 。
② 95 ℃加热3 min后，迅速放置于冰冷却5 min。
3．制胶：① 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中， 加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖 完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水 补充蒸发的水分)
northern boltting
Northern Blot步骤
3、与探针杂交 探针标记的方法 （1）切口平移法 （2）随机引物法 （3）末端标记法 （4）单链 DNA探针标记 （5）寡核苷酸探针标记法
模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与 模板DNA 退火后由KLENOW 片段从引物3' 端延伸 引物，便可将DIG-11-DUTP 均匀掺入到新合成的 DNA 链中。
Northern Blot步骤
2、转膜 常用膜：硝酸纤维膜 优点：专一性较好 缺点：烘干的后容易碎裂 尼龙膜 优点：韧性好，与核酸结合的能力强
转膜方式：毛细管转移法 电印迹法 真空转移法
Northern Blot步骤
2、转膜 毛细管转移法：借助吸水纸吸收转移缓冲 液时所产生的牵引力量将RNA自洋菜胶体 转移至膜上；要转印完全，需要作用6 h 以上。
Northern Blot步骤
3、与探针杂交 预杂交：用非特异性 RNA 分子及其它高分子化合物（封闭剂）将待杂交膜中的非特异 性位点封闭，从而减少杂交背景。 膜与探针杂交：倒掉预杂交液，加入含探针的杂交液。68℃下杂交6h以上 洗膜：适当洗膜延长时间和洗膜增加次数可减少背景色
Northern Blot步骤
用于检测癌细胞中原癌基因表达量的升高及抑癌基因表达量的下降
器官移植过程中由于免疫排斥反应造成某些基因表达量的上升 检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列
Northern blot
原理
核酸分子杂交：利用不同来源但互不配对的核酸 单链之间能够特异性结合形成杂合双链的特性， 从而对核酸分子进行定性和定量分析的技术。
Northern blot：检测RNA
Northern Blot步骤
电泳
转膜
northern印迹杂交原理
northern印迹杂交原理北方印迹杂交（Northern blot）是一种用于检测和分离特定RNA序列的实验技术。
它是南方印迹技术的衍生物，南方印迹技术是用于检测和分离DNA序列的一种实验技术。
北方印迹技术常用于研究基因的表达调控机制和RNA水平的变化。
北方印迹杂交的原理基本上与南方杂交的原理相似，但有一些具体差异。
北方印迹的主要步骤包括RNA提取、转印到膜上、固定RNA到膜上、杂交和检测。
首先，从细胞或组织中提取总RNA。
通常使用酚-氯仿法或商业RNA 提取试剂盒进行提取。
在提取过程中，应严格遵循消毒和无RNase污染的条件。
接下来，将提取的RNA样品加载到琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
通过电泳可以将RNA按分子大小进行分离，从而得到RNA带。
在电泳结束后，在凝胶上用碱性溶液溶解凝胶，将RNA转移到尼龙或硝酸纤维膜上。
然后，固定RNA到膜上。
这通常是通过使RNA与膜上的阳离子进行静电相互作用来实现的。
可以使用UV交联来增强RNA与膜的结合。
在固定RNA后，开始进行杂交。
杂交是将与目标RNA序列具有互补序列的DNA或RNA探针与膜上的RNA进行配对。
探针可以是标记有荧光物质或放射性同位素的分子探针。
探针的选择应根据研究的具体目的来确定。
杂交的条件包括温度、时间和杂交液的组成。
温度通常选择在50-65摄氏度之间，时间通常在几小时到一夜之间。
杂交液中通常包含盐、DENHART's溶液、聚丙烯醇等。
最后，进行检测。
检测的方法可以是放射自显影、化学发光或荧光检测。
如果使用放射性标记的探针，可以使用放射自显影技术来检测。
如果使用化学发光或荧光标记的探针，可以使用相应的检测仪器进行检测。
北方印迹杂交技术可以用于许多研究领域，例如研究基因表达的调控机制、RNA的稳定性和降解等。
它的优点包括对RNA分子的特异性检测和分离，以及对研究RNA变化的敏感性和定量性。
它的局限性在于需要较长的处理时间和较大的RNA样品量，以及需要较高的实验技术要求。
Northern_blot
Northern blot技术经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。
含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。
尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。
1）在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L乙二醛5.4μlDMSO 16.0μl0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μlRNA（多达10μl）5.4μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。
由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－20℃。
每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。
0.1mol/L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。
每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。
2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于％0℃温育50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。
3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4 ％琼脂糖分析1kb 以下的RNA样品，而用1％琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。
用0mmol/L 磷酸钠（pH7. 0 ）后，降温至70 ℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。
Northern-Blot印迹杂交
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
• 转录水平低：考虑使用其他组织 或细胞类型进行实验，以确定目 标基因是否在所选样本中表达。
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
解决方案
2. 使用更高效的RNA提取方 法，确保获得高质量的RNA 样品。
样本电泳
01
02
03
选择合适的胶浓度
根据RNA的大小选择适合 的琼脂糖凝胶浓度，确保 RNA片段能够充分分离。
点样与电泳
将处理好的RNA样品点在 凝胶上，并进行电泳分离。
检测RNA条带
通过染色或放射自显影等 技术观察电泳结果，确保 RNA片段已成功分离。
样本转移
制备滤纸
选择适合的硝酸纤维素膜 或印迹膜，并将其固定在 滤纸上。
northern-blot印迹杂交
contents
目录
• northern-blot技术概述 • northern-blot实验原理 • northern-blot实验材料与设备 • northern-blot实验步骤 • northern-blot实验结果分析 • northern-blot实验问题与解决方案
01 northern-blot技术概述
定义与特点
定义
Northern-blot印迹杂交是一种用于 检测RNA在样本中的表达水平的分 子生物学技术。
特点
具有高灵敏度、高特异性和高分辨率 ，能够检测出微量的RNA分子，并可 对RNA分子进行定性、定量和定位分 析。
northern-blot技术的应用范围
1. 重新设计探针并进行验证， 确保与目标基因完全匹配。
3. 优化实验条件，如延长杂 交时间和提高探针浓度。
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的杂质影响电泳。 （4）点样时，使样品均匀铺在点样孔底部或者使用
微量进样器直接在靠近点样孔底部的位置点样。 （5）冰浴中，恒压60-80V电泳约1.5h，至溴酚蓝指
示带距底部约3cm处。
1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分离 RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂交 6.显色
步骤3
（1）电泳结束后，取出凝胶，浸入预冷的 0.5XTBE缓冲液中。
（2）转膜所用的膜以及滤纸也需用 0.5XTBE缓冲液浸湿。
（3）组装“三明治”，从负极到正极依次 为：滤纸、胶、膜、滤纸。
（4）组装转膜装置，确保装置所有正负极 都连接正确。
（5）冰浴中，恒压60V转膜约1h。
步骤4
1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分离 RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂交 6.显色
DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II
步骤5
1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分离 RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂交 6.显色
（1）转膜后，用紫外ug RNA + 2X loading buffer Incubated at 65℃ for 10min. On ice for 1min.
Acrylamide Gel
步骤2
（1）配制15%的尿素变性PAGE胶，先用0.5XTBE，
60V预跑30min。 （2）将样品与RNA loading buffer按比例混合，70℃
1. 杂交后的膜用10ml washing buffer在室温漂洗膜。 2. 用10ml blocking solution进行室温封闭1h。 3. 用10ml antibody solution 进行室温孵育2h。 4. 10ml washing buffer漂洗膜次，每次5min。 5. 再用ECL显色法显色。
northern印迹杂交
简介
简介
Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在上样前用甲基氢氧化银、乙 二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤 维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱， 否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶 上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方 法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相 机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。
northern印迹杂交
将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法
01 简介
目录
02
RNA甲醛凝胶电泳和 吸印方法
基本信息
Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA 印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为 Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。
琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用 甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。
原理：
整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达，则转化植株细胞内有其转录产物——特异mRNA的生成。将 提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上；将他们原 位转移到固定膜上；在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交；然后通过探针的标记性质检测出杂交体。
Northern_Blot
• application：To detect whether the transcription product (mRNA) contained in the sample and its content.
2 SDS-PAGE 3 Blot the proteins from the gel to a membrane 4 Blocking 5 first antibody 6 second antibody 7 Detection
Denaturation of protein samples
• 2×SDS-PAGE buffer solution：
3 the tissue localization of target proteins
4 objective to analyze the expretern blot principle
Western Blot process
1 Protein sample preparation
western blot application
1 Objective to analyze the expression characteristics of the target protein.
2 interaction between the target protein and other proteins
Northern blot技术-1
Northern blot技术-1核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot )(一)Southern Blot 原理: 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…(一)Southern Blot原理:将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途:检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
(二)Northern Blot原理:在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。
(三)探针标记技术1 标记物:放射性和非放射性两种放射性:非放射性:生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法(1)切口平移法(2)随机引物法(3)末端标记法(4)单链DNA探针标记(5)寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
northern blot
1.Total RNA isolation：测定OD260，OD280及两者比值，换算出RNA的浓度。
并电泳鉴定。
2.Gel：以80ml的1.5％甲醛琼脂糖凝胶为例：agrose：1.2gdd H2O：57.6ml10×RNB*(RNA buffer)：8ml（RNB具体配方见后，用*表示，下同）甲醛溶液：14.4ml3. Electrophoresis：（1）加样：（以取20μg RNA为例）在0.5ml管中加20 μg RNA＋2－4倍RNA体积的SB溶液* ，votex，65℃热变性10min，立即上冰5min，微离心一下，加相应的10×loading buffer（大连宝生物公司taq酶系列会提供），混匀，准备上样。
（2）预电泳：在正式上样电泳前，在胶点样孔中各加一点10×loading buffer（加的孔数要超过正式电泳所用的点样孔）先看点样孔漏不漏，预电泳15－20min。
此工作可在RNA变性时进行。
这一方面可判断胶漏不漏，另一方面可使胶活化。
（3）正式电泳：将（1）步的混匀样全部加入点样孔，50V电泳4－5小时（电泳时间长短还要依你胶的大小而定，一般要使loading buffer跑到四分之三左右。
电泳最好在4℃冰箱里进行，并且要有循环器在电泳缓冲液两边进行交换，以防两端缓冲液PH 相差过大。
电泳缓冲液用1×RNB。
4.转膜：（1）在转移槽内放好玻璃板，铺好滤纸桥，紧贴玻板。
（2）倒入转移液（20×SSC*），浸透滤纸桥，驱除气泡，同时按胶大小剪好合适的膜（膜为Amersham公司的Hybond－N＋膜）和两张同样大小的滤纸。
（3）将胶从加样孔先接触滤桥面，自一端将胶滑放至滤纸桥上，注意不留气泡。
（4）将膜放在胶上，小心慢速，自一端起紧贴胶面，检查及排除气泡，用一干净玻棒轻缓的在膜上滚几下以排除气泡。
（5）用保鲜膜在四周封边，在尼龙膜上放上两张滤纸片，再堆上5－8cm吸水纸堆，压上重物，10－24hr。
Northern-blotting
（一）RNA的提取及质量检测
RNA的提取 紫外吸收检测RNA的纯度和浓度 1.取RNA样品5ul，用水稀释50-100倍，转入分 光光度计的石英比色杯中。 2.在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据 260nm时RNA浓度=OD260×40ug/ml×稀释 倍数。 3.若OD260/ OD280小于2，说明可能有DNA 片段污染，可用无Rnase的Dnase处理样品。
0d
2d
4d
6d
8d
GAPDH
Northern blot 杂交分析mRNA的表达
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
T4噬菌体多 苷酸激酶催 化
（2）3’端标记法（大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片 段） 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段有5’→3’DNA 聚合酶和微弱的3’→5’外切酶活性，但无5’→3’外 切酶活性。对残缺3’末端可进行标记。
35kD
76kD 5’ 3’聚合酶 3’外切酶 DNA聚合酶I全酶 3’ 5’外切酶
（五）杂交信号的检测
• 放射自显影 曝光：将滤膜用保鲜膜包住，固定在滤纸上 在暗室中在滤膜上覆盖一张X光片，并用两张 增感屏将滤膜和X光片夹住，放在暗盒中， 70℃曝光20min。 显影、定影 • 非放射性杂交分子的检测
应用
DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要 用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小。
2、杂交 将标记好的探针于 100℃煮沸 10～15分钟， 立即放冰浴冷却 10分钟。用杂交液稀释成所 需浓度。 将杂交袋中预杂交液倒出，加入 10ml 新鲜 的 Hyb杂交液（65℃预热，已加入变性的探 针)，小心排尽气泡，封口，放 65℃水浴振荡 杂交过夜。
3、洗脱 杂交完成后，取出杂交膜，放入装有 20mL 的 2×SSC/0.1% SDS 溶液的平皿中，在室温下振 荡洗涤两次，每次 5分钟。 然后放入 0.1×SSC/0.1%SDS溶液(先放 50℃水 浴预热)中，50℃水浴振荡洗涤两次，每次 15 分钟。
Westernblot原理和技术上课PPT课件
Towbin, H., et al. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.
常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原 理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电 场的机械装置不同。
转移膜的选择
最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维 素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也 有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙 膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。
束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有
的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质
分子线性化。
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide， 简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网 状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明 度。是良好的电泳介质。
northern blot
RNA的浓度测定测定提取的总RNA的浓度打开浓度测定仪器，用挡板挡住通光孔获得暗光普，再取1ulRNAse free的水作为空白对照获得空白光谱。
依次取1ul的样品进行测定。
得到RNA的浓度。
（取浓度为2ug-3ug进行变性然后转膜RNA的变性向RNA样品加入变性剂（相当于RNA样品体积的0.5倍～1倍），振荡混匀后稍离心，然后65℃PCR仪器加热10分钟，冰上速冷2分钟后电泳。
（总体积大约30-50ul）RNA电泳分离变性胶的制备称取0.6g琼脂糖用36mlDEPC处理水溶解，在微波炉中加热溶解好，等到60°左右加入9ml的30%的甲醛和6ml 10Xmops溶液。
混匀后制胶。
晾半小时以上电泳分离将稀释好的1Xmops溶液大约500ml倒进电泳槽。
进行电泳。
电压120V，电泳1小时或者1小时30分。
照胶检测将电泳完的胶用用透明EP手套包好，检测RNA的质量，进入转膜转膜准备10Xssc 100ml。
DPEC水200ml。
转膜液200ml（0.4molNaOH-3molNaCl）。
将尼龙膜浸入10Xssc使其充分湿润后方可使用将滤纸先用depc水浸湿，再浸入转膜液中，已备使用将胶从电泳槽中取出来，用DEPC水浸泡胶2min，将表面杂质洗掉。
然后浸入转膜液20min构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。
剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，浸湿滤纸，并向盘中加入足量的转膜液用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。
将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后封口膜凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。
剪一片与凝胶暴露面略大的尼龙膜，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。
膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。
取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用玻棒赶出气泡。
原位杂交Northern_Blotting
原位杂交组织化学技术进展
原位PCR技术 荧光原位杂交技术 胚胎原位杂交技术 双重和多重原位杂交技术 原位杂交结合免疫组织化学技术 电镜原位杂交技术 肽核酸原位杂交
原位PCR技术原理
将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不改 变周围组织的原有位置，直接在组织、细胞或 病原体原位研究基因变化的技术。 根据在扩增反应中所用的dNTP或引物是否 标记，原位PCR可分为： 直接法原位PCR 间接法原位PCR
第三节 核酸分子探针
定义：一种带有标记物的、已知的、仅 与靶分子特异反应的分子。 探针的种类
DNA探针 cRNA探针 寡核苷酸探针
DNA探针
基因组DNA探针
最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链 DNA或 单链DNA探针
cDNA探针
互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的 优点：制备方法简便，不易降解，标记方法较成熟
多色FISH
通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针 结合(直接法)，在一个细胞核中可呈现多种颜色标记，同 时检测多种染色体异常。
Figure 1. Upright optical slice of an intact embryo in blastoderm stage. Double staining for mRNA and protein. Target mRNAs for in situ probes (sog and sna) and protein stained by primary antibody (anti-Dorsal) are indicated in the figure. DAPI was used to label the nuclei. Note that the expression of sog and sna are located apically in the cytoplasm, while the expression of Dorsal is nuclear.
核酸检测篇8-Northern blot
编号：2-8主题：Northern blot概述：Northern blot （诺瑟杂交）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
Northern blot 在1977年由斯坦福大学James Alwine、David Kemp和George Stark发明。
Northern blotting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southern blot（依据生物学家Edwin Southern 名字来命名）来命名，Southern blot主要用来对DNA进行分析。
目的：Northern blot 可用来检测不同组织、器官、生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达模式，还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。
原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而进行转膜和用探针进行杂交检测RNA的表达水平。
步骤：1、总RNA提取；2、变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPC 水12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。
待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min；3、样品制备：取总RNA约20-30μg，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0 μl、37%甲醛3.6 μl、甲酰胺10 μl，65℃温育15min、冰浴5min。
加入EB（1μg/μl）1μl、上样缓冲液2μl。
4、电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2小时左右），电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。
5、将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜；6、使上述RNA转移持续进行15hr左右。
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MicroRNA简介
3
MiRNA的检测方法
northern blot流程
1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分离RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂交 6.显色
•
步骤1
1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分 离RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂 交
2. 用10ml blocking solution进行室温封闭1h。 3. 用10ml antibody solution 进行室温孵育2h。
3.RNA转膜
4.RNA探针制备 5.Northern印记杂 交 6.显色
4. 10ml washing buffer漂洗膜次，每次5min。
5. 再用ECL显色法显色。
3.RNA转膜
4.RNA探针制备 5.Northern印记杂 交 6.显色
步骤5
1.RNA的提ห้องสมุดไป่ตู้ 2.聚丙烯酰胺胶分 离RNA
（1）转膜后，用紫外交联仪 固定膜， 42℃干燥15min。 （2）加入4ml 预热的预杂交 液，42℃旋转30min。 （3）倒掉DIG easy hyb ，加 入含探针杂交液（探针用 预杂交液稀释至 25ng/ml）。
（1）电泳结束后，取出凝胶，浸入预冷的 0.5XTBE缓冲液中。 （2）转膜所用的膜以及滤纸也需用 0.5XTBE缓冲液浸湿。
（3）组装“三明治”，从负极到正极依次 为：滤纸、胶、膜、滤纸。
（4）组装转膜装置，确保装置所有正负极 都连接正确。
（5）冰浴中，恒压60V转膜约1h。
步骤4
1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分 离RNA DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II
3.RNA转膜
4.RNA探针制备 5.Northern印记杂 交 6.显色
（4）在39-42 ℃温度下，杂 交过夜。
（5）杂交后的膜在室温用 washing buffer漂洗2遍。
步骤6
1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分 离RNA
1. 杂交后的膜用10ml washing buffer在室温漂洗膜。
（3）上样前，用缓冲液冲洗点样孔，防止点样孔中 的杂质影响电泳。 （4）点样时，使样品均匀铺在点样孔底部或者使用 微量进样器直接在靠近点样孔底部的位置点样。 （5）冰浴中，恒压60-80V电泳约1.5h，至溴酚蓝指 示带距底部约3cm处。
步骤3
1.RNA的提取
2.聚丙烯酰胺胶分 离RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂 交 6.显色
10 ug RNA + 2X loading buffer Incubated at 65℃ for 10min. On ice for 1min.
Acrylamide Gel
6.显色
步骤2
（1）配制15%的尿素变性PAGE胶，先用0.5XTBE，
60V预跑30min。
（2）将样品与RNA loading buffer按比例混合，70℃ 预热5min，立即放置冰上。
miRNeasy Mini Kit (QIAGEN, Inc)
TRIzol total RNA isolation
6.显色
步骤1
OD (optical density ) OD260 OD280 OD230 OD260/OD280: 1.8-2.0 OD260/230 >2.0
步骤2
1.RNA的提取 2.聚丙烯酰胺胶分 离RNA 3.RNA转膜 4.RNA探针制备 5.Northern印记杂 交