(自然科学)GB4789涉及的微生物常规检测技术
GB 4789.2-94 菌落总数测定
中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验 GB 4789.2-94菌落总数测定代替 GB 4789.2-84Microbiological examination of food hygiene Detectionof aerobic bacterial count───────────────────────────────────────1 主题内容与适用范围本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。
本标准适用于食品中菌落总数的测定。
2 术语菌落总数是指食品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等),所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。
本方法规定的培养条件下所得结果,只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。
菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志,也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
3 引用标准GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂4 设备和材料4.1 温箱：36±1℃。
4.2 冰箱：0～4℃。
4.3 恒温水浴：46±1℃。
4.4 天平。
4.5 电炉。
4.6 吸管。
4.7 广口瓶或三角瓶：容量为500mL。
4.8 玻璃珠：直径约5mm。
4.9 平皿：直径为90mm。
4.10 试管。
4.11 放大镜。
4.12 菌落计数器。
4.13 酒精灯。
4.14 均质器或乳钵。
4.15 试管架。
4.16 灭菌刀或剪子。
4.17 灭菌镊子。
5 培养基和试剂5.1 营养琼脂培养基：按GB 4789.28中4.7规定。
5.2 磷酸盐缓冲稀释液：按GB 4789.28中3.22规定。
5.3 生理盐水。
5.4 75％乙醇。
6 检验程序菌落总数的检验程序如下。
┌─────┐│检样│└─────┘↓┌─────────────┐│做成几个适当倍数的稀释液│└─────────────┘↓┌──────────────┐│选择2～3个适宜稀释度││各以1mL分别加入灭菌平皿内│└──────────────┘↓┌─────────────┐│每皿内加入适量营养琼脂│└─────────────┘36±1℃↓48±2h┌─────┐│菌落计数│└─────┘↓┌──────┐│报告│└──────┘7 操作步骤7.1 检样稀释及培养7.1.1 以无菌操作,将检样25g(或mL)剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。
食品微生物检验-GB4789.1-2010总则
2.人员 (1) 检验人员应具有相应的教育、微生物专业培训经历，具备 相应的资质，能够理解并正确实施检验。 (2) 检验人员应掌握实验室生物检验安全操作知识和消毒知识。 (3) 检验人员应在检验过程中保持个人整洁与卫生，防止人为 污染样品。 (4) 检验人员应在检验过程中遵守相关预防措施的规定，保证 自身安全。 (5) 有颜色视觉障碍的人员不能执行涉及到辨色的实验。 3. 设备 (1) 实验设备应满足检验工作的需要。 (2) 实验设备应放置于适宜的环境条件下，便于维护、清洁、 消毒与校准，并保持整洁与良好的工作状态。 (3) 实验设备应定期进行检查、检定（加贴标识）、维护和保 养，以确保工作性能和操作安全。 (4) 实验设备应有日常性监控记录和使用记录。
4. 采集样品的标记 应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记， 采样人应清晰填写采样单（包括采样人、采样 地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、 保存条件等信息）。 5. 采集样品的贮存和运输 采样后，应将样品在接近原有贮存温度条件下 尽快送往实验室检验。运输时应保持样品完整。 如不能及时运送，应在接近原有贮存温度条件 下贮存。
2. 采样方案 (1) 类型 采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有 n、c和m值，三级采样方案设有n、c、m和M值。 n：同一批次产品应采集的样品件数； c：最大可允许超出m值的样品数； m：微生物指标可接受水平的限量值； M： 微生物指标的最高安全限量值。 注1： 按照二级采样方案设定的指标，在n个样品中， 允许有c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。 注2： 按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中， 允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值； 允许有c个样品其相应微生物指标检验值在m值和M值 之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。
微生物检验总则GB 4789.1
2.4 环境与设施 (1) 实验室环境不应影响检验结果的准确性。 (2)实验区域应与办公区域明显分开。 (3)实验室工作面积和总体布局应能满足从事检验工作的需要,实验 室布局宜采用单方向工作流程,避免交叉污染。 (4) 实验室内环境的温度、湿度、洁净度及照度、噪声等应符合工 作要求。
(5) 食品样品检验应在洁净区域进行,洁净区域应有明显标示。 (6) 病原微生物分离鉴定工作应在二级或以上生物安全实验室进行
主要作用于DNA,使DNA形成胸腺嘧啶二聚体，使微 生物DNA失去转化能力而死亡。
2.3.2湿热灭菌
湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流 通蒸汽进行灭菌的方法。压力蒸汽湿热灭菌法 是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸 汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的 穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死 亡。适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、 胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液的灭菌。
2.2微生物基本操作
30%
梯度稀释
平板倾注
45%
35%
平板划线
斜面穿刺 平板涂布
革兰氏染色
55%
50%
30%
60%
涂片及固定
数量对比
2.2.1梯度稀释
（1）用酒精棉消毒操作台面。 （2）点燃酒精灯，左手于酒精 灯火焰附近打开移液器吸头盒， 右手持移液器取枪头。 （3）用酒精灯火焰灼烧试管口 部，将枪头伸入试管，吸取足量 液体，再次灼烧试管口部，塞上 塞子。 （4）将待接种试管塞打开，用 酒精灯火焰灼烧试管口部，将液 体打入待接种试管，再次灼烧试 管口部，塞上塞子。
2.2.4斜面穿刺
操作时用笔直的接种针，从 长有目标菌的培养基上挑取少量 菌苔，将接种针平稳刺入培养基 ，勿触到管底，也不可碰到试管 内壁，然后沿原穿刺途径慢慢抽 出接种针，最后在斜面上进行“ 之”字划线。
食品微生物检验 GB4789.1-2010总则
2. 检验方法的选择 (1) 应选择现行有效的国家标准方法。 (2) 食品微生物检验方法标准中对同一 检验项目有两个及两个以上定性检验方 法时，应以常规培养方法为基准方法。 (3) 食品微生物检验方法标准中对同一 检验项目有两个及两个以上定量检验方 法时，应以平板计数法为基准方法。
四、生物安全与质量控制
三、样品检验
1. 样品处理 (1) 实验室接到送检样品后应认真核对登记, 确保样 品的相关信息完整并符合检验要求。 (2) 实验室应按要求尽快检验。若不能及时检验， 应采取必要的措施保持样品的原有状态，防止样品 中目标微生物因客观条件的干扰而发生变化。 (3) 冷冻食品应在 45 ℃以下不超过 15 min，或 2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻后进行检验。
5. 培养基和试剂 (1) 培养基 培养基的制备和质量控制按照GB/T 4789.28的规定执行。 (2) 试剂 检验试剂的质量及配制应适用于相关检验。对检验结果有重 要影响的关键试剂应进行适用性验证。 6. 菌株 (1) 应使用微生物菌种保藏专门机构或同行认可机构保存的、 可溯源的标准或参考菌株。 (2) 应对从食品、环境或人体分离、纯化、鉴定的，未在微 生物菌种保藏专门机构登记注册的原始分离菌株（野生菌株） 进行系统、完整的菌株信息记录，包括分离时间、来源，表 型及分子鉴定的主要特征等。 (3) 实验室应保存能满足实验需要的标准或参考菌株，在购 入和传代保藏过程中，应进行验证试验，并进行文件化管理。
采样可分为大样的采集，中样的采集（200g或ml），小样的采集（25g或ml）
采样数量应能反映该食品的卫生质量和满足检验项目对试样量的 需要，一式三份，供检验、复验、备查或仲裁，一般散装样品每 份不少于0.5Kg。 鉴于采样的数量和规则各有不同，一般可按下述方法进行。 （1）液体、半流体饮食品。如植物油、鲜乳、酒或其它饮料，如 用大桶或大罐盛装者，应先行充分混匀后采样。样品应分别盛放 在三个干净的容器中，盛放样品的容器不得含有待测物质及干扰 物质。 （2）粮食及固体食品应自每批食品的上、中、下三层中的不同部 位分别采取部分样品混合后按四分法对角取样，再进行几次混合， 最后取有代表性样品。 （3）肉类、水产等食品应按分析项目要求分别采取不同部位的样 品或混合后采样。 （4）罐头、瓶装食品或其它小包装食品，应根据批号随机取样。 同一批号取样件数，250g以上的包装不得少于6个，250g以下的 包装不得少于10个。掺伪食品和食物中毒的样品采集，要具有典 型性。
GB4789.15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》标准解读
品稀 释 液 的混 匀 ，否 则 在小 试 管里 面 很难 充 分混 匀 。增 加 了 微量 移 液 器及 吸头 １．０ ｍＬ（２．１１），这是 为 了兼 容 检验机 构实 际工 作 中
ａｎａｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｅｄ．Ｂｙ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｃｏｐｅ，ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ａｎ ｄ ｍａｔｅｒｉａｌ， ｍ ｅｄｉｕｍ ａｎ ｄ ｒｅａｇｅｎｔ，ｔｅｓｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ｒｅｓｕｌｔ ａｎｄ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｍ ｅｔｈｏｄ，ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｒｅａｇｅｎｔ ｏｆ
版 标 准 ）实 施 日期 为 ２０１７年 ４月 １９日 。这 个 标 准 方 法 在 目前
３ 培 养基 和试 剂
各个 食 品 检验 机 构 和企业 微 生 物实 验 室使 用 频率 比较高 。在 ２０１６
２０１６版 标准 中增 加 了生 理 盐水 和 磷 酸盐 缓 冲液 ，保 留无 菌蒸
ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１６７４－９３１６ ２０１８．０５．００１
冲洗 ，均 质程 度不 足 。另外 有些 检验 机构 ，使 用旋 转刀 片均质 器 ，
ＩｎｔｅｒＤｒｅｔａｔｉＯｎ ｆ０ｒ Ｇ Ｂ ４７８９．１５—２０ｌ６ Ⅳ ａｔｉｏｎａｌ Ｆｏ０ｄ Ｓａｆｅｔｙ 可能 会 把霉 菌 的菌 丝 切 断 ，导致 检验 结 果偏 高 。所 以，２０１６版标
撼准研兜芍麓墉
国 生耘 准 ￣ ＣＨＳＭ ０５ １
ＧＢ ４７８９．１ ５—２０１ ６《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数 标准解读
马群飞
食品微生物检验技术GB4789.2-2010 菌落总数测定
(4) 按 (3) 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀 液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管 或吸头。 (5) 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个～3 个 适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）， 在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液 于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时， 分别吸 取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内 作空白对照。 (6) 及时将 15 mL～20 mL 冷却至 46 ℃的平板计 数琼脂培养基（可放置于 46 ℃±1 ℃恒温水浴 箱中 保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
2. 培养 (1) 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h。水产品 30 ℃±1 ℃培养 72 h±3 h。 (2) 如果样品中可能含有在琼脂培养基表 面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂 表面覆盖一薄层 琼脂培养基（约 4 mL）， 凝固后翻转平板，按 36 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h（水产品 30 ℃±1 ℃培养 72 h±3 h）条件进行培养。
GB 4789.2-2010 食品安全国家标 准 食品微生物学检验 菌落总数测定
一、设备和材料 二、培养基和试剂 三、检验程序 四、操作步骤 五、结果与报告
一、设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和 材料如下： (1) 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。 (2) 冰箱：2 ℃～5 ℃。 (3) 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 (4) 天平：感量为 0.1 g。 (5) 均质器。 (6) 振荡器。 (7) 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 (8) 无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL。 (9) 无菌培养皿：直径 90 mm。 (10) pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 (11) 放大镜或/和菌落计数器。
浅析食品微生物学检验GB4789.系列致病菌标准解读技巧
浅析食品微生物学检验GB 4789.系列致病菌标准解读技巧发布时间：2021-09-22T04:22:05.166Z 来源：《教学与研究》2021年9月下作者：吴九玲[导读] GB 4789.系列致病菌标准解读是从事食品微生物学检验岗位必备的专业能力。
GB 4789.系列致病菌标准的学习重点及难点包括：检验意义、检验程序、致病菌的生物学特性、检验步骤解析、检验报告五个方面。
熟练解读致病菌标准可以使得致病菌检验工作事半功倍。
深圳技师学院吴九玲深圳 518026摘要：GB 4789.系列致病菌标准解读是从事食品微生物学检验岗位必备的专业能力。
GB 4789.系列致病菌标准的学习重点及难点包括：检验意义、检验程序、致病菌的生物学特性、检验步骤解析、检验报告五个方面。
熟练解读致病菌标准可以使得致病菌检验工作事半功倍。
关键词：GB 4789 致病菌标准解读食品种类繁多，食品安全国家标准数量多，随着检验技术和手段的不断发展和进步，标准更新的也比较快。
因课时及教学资源所限，职业院校有关食品微生物检验的课程内容无法涵盖所有的食品微生物检验GB 4789.系列致病菌标准。
一般教学内容宜选取比较有代表性或常见的几个致病菌检验标准学习。
学生在食品微生物检验岗位实习或在真正的工作场景需要进一步的学习。
因此教会学生学会独立解读标准非常重要。
学生具备解读GB 4789.系列致病菌标准的学习能力，可以很快地适应食品微生物检验新岗位、新的工作要求，快速地提升职业技能。
因此学会快速地学习GB 4789.系列致病菌标准对于今后需要从事食品微生物学检验的学生来说是非常必要的。
GB 4789.系列致病菌标准的学习重点及难点包括：检验意义、检验程序、致病菌的生物学特性、检验步骤解析、检验报告五个方面。
对致病菌标准的五个方面解读到位是快速掌握GB 4789.系列致病菌标准的关键。
一、了解致病菌的相关食品中毒事件，明确致病菌的检验意义和致病性。
微生物检验国家新标准
GB/T 4789.1—1994食品卫生微生物学检验总则1 主题内容与适用范围本标准规定了食品卫生微生物学检验总则。
本标准适用于样品的采样、送检、检验及报告。
2 引用标准GB 4789.23 食品卫生微生物学检验冷食菜、豆制品检验3 设备和材料探子、铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子、开罐器等。
4 样品的采集在食品检验中，所采集的样品必须有代表性。
食品因其加工批号、原料情况(来源、种类、地区、季节等)、加工方法、运输、保藏条件、销售中的各个环节(例如有无防蝇、防污染、防蟑螂及防鼠等设备)及销售人员的责任心和卫生认识水平等无不影响着食品卫生质量，因此必须考虑周密。
4.1 样品种类样品种类可分为大样、中样、小样三种。
大样系指一整批，中样是从样品各部分取得的混合样品，小样系指做分析用，称为检样。
检样一般以25g为准，中样以200g为准。
4.2 采样方法4.2.1 采样必须在无菌操作下进行。
4.2.2 采样用具：如探子、铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子和开罐器等，必须是灭菌的。
4.2.3 根据样品种类如袋、瓶和罐装者，应取完整的未开封的。
如果样品很大，则需用无菌采样器取样；样品是固体粉末，应边取边混合；样品是液体的，通过振摇即可混匀；检样是冷冻食品，应保持在冷冻状态(可放在冰内、冰箱的冰盒内或低温冰箱内保存)，非冷冻食品需保持在0～5℃中保存。
4.3 采样数量根据不同种类，采样数量有所不同，见下表。
各种样品采样数量（图略）续表（图略）4.4 采样标签采样前或后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚(如品名、来源、数量、采样地点、采样人及采样年、月、日)。
5 送检5.1 样品送到食品卫生微生物检验室应越快越好，一般应不超过3h。
如果路途遥远，可将不需冷冻样品保持在1～5℃环境中(如冰壶)。
如需保持冷冻状态，则需保存在泡沫塑料隔热箱内(箱内有干冰可维持在0℃以下)。
5.2 送检时，必须认真填写申请单，以供检验人员参考。
GB4789系列食品微生物学检验标准汇总
GB/T 5750.12-2006
生活饮用水标准检验方法微生物指标
45
SN/T 4091-2015
食品微生物学测量不确定度评估指南
46
SN/T 3266-2012
食品微生物检验方法确认技术规范
47
SN/T 3141-2012
出口食品包装物微生物检测指南
48
SN/T 2376-2009
番茄酱中主要腐败微生物的检验方法
28
GB 4789.28-2013
食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求
29
GB 4789.29-2020
食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验
30
GB 4789.30-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验
31
GB 4789.31-2013
食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验
食品卫生微生物学检验冷食菜、豆制品检验
24
GB/T 4789.24-2003
食品卫生微生物学检验糖果、糕点、蜜饯检验
25
GB/T 4789.25-2003
食品卫生微生物学检验酒类检验
26
GB 4789.26-2013
食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验
27
GB/T 4789.27-2008
食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验
19
GB/T 4789.19-2003
食品卫生微生物学检验蛋与蛋制品检验
20
GB/T 4789.20-2003
食品卫生微生物学检验水产食品检验
21
GB/T 4789.21-2003
GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
中华人民共和国国家标准G B4789.10 2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会前言本标准代替G B4789.10 2010‘食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验“㊁S N/T0172 2010‘进出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法“㊁S N/T2154 2008‘进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术“㊂本标准与G B4789.10 2010相比,主要变化如下:试验用增菌液统一为7.5%氯化钠肉汤㊂食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验1范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)的检验方法㊂本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品中金黄色葡萄球菌的计数㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂2.2冰箱:2ħ~5ħ㊂2.3恒温水浴箱:36ħ~56ħ㊂2.4天平:感量0.1g㊂2.5均质器㊂2.6振荡器㊂2.7无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂2.8无菌锥形瓶:容量100m L㊁500m L㊂2.9无菌培养皿:直径90mm㊂2.10涂布棒㊂2.11p H计或p H比色管或精密p H试纸㊂3培养基和试剂3.17.5%氯化钠肉汤:见A.1㊂3.2血琼脂平板:见A.2㊂3.3 B a i r d-P a r k e r琼脂平板:见A.3㊂3.4脑心浸出液肉汤(B H I):见A.4㊂3.5兔血浆:见A.5㊂3.6稀释液:磷酸盐缓冲液:见A.6㊂3.7营养琼脂小斜面:见A.7㊂3.8革兰氏染色液:见A.8㊂3.9无菌生理盐水:见A.9㊂第一法金黄色葡萄球菌定性检验4检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1㊂图1金黄色葡萄球菌检验程序5操作步骤5.1样品的处理称取25g样品至盛有225m L7.5%氯化钠肉汤的无菌均质杯内,8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或放入盛有225m L7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~ 2m i n㊂若样品为液态,吸取25m L样品至盛有225m L7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀㊂5.2增菌将上述样品匀液于36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长㊂5.3分离将增菌后的培养物,分别划线接种到B a i r d-P a r k e r平板和血平板,血平板36ħʃ1ħ培养18h~ 24h㊂B a i r d-P a r k e r平板36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂5.4初步鉴定金黄色葡萄球菌在B a i r d-P a r k e r平板上呈圆形,表面光滑㊁凸起㊁湿润㊁菌落直径为2mm~3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带㊂当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感㊂有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同㊂从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥㊂在血平板上,形成菌落较大,圆形㊁光滑凸起㊁湿润㊁金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈㊂挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验㊂5.5确证鉴定5.5.1染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为0.5μm~1μm㊂5.5.2血浆凝固酶试验:挑取B a i r d-P a r k e r平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选),分别接种到5m LB H I和营养琼脂小斜面,36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂取新鲜配制兔血浆0.5m L,放入小试管中,再加入B H I培养物0.2m L~0.3m L,振荡摇匀,置36ħʃ1ħ温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果㊂同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照㊂也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验㊂结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到5m LB H I,36ħʃ1ħ培养18h~48h,重复试验㊂5.6葡萄球菌肠毒素的检验(选做)可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定,应按附录B检测葡萄球菌肠毒素㊂6结果与报告6.1结果判定:符合5.4㊁5.5,可判定为金黄色葡萄球菌㊂6.2结果报告:在25g(m L)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌㊂第二法金黄色葡萄球菌平板计数法7检验程序金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序见图2㊂图2金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序8操作步骤8.1样品的稀释8.1.1固体和半固体样品:称取25g样品置于盛有225m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或置于盛有225m L稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ10的样品匀液㊂8.1.2液体样品:以无菌吸管吸取25m L样品置于盛有225m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1ʒ10的样品匀液㊂8.1.3用1m L无菌吸管或微量移液器吸取1ʒ10样品匀液1m L,沿管壁缓慢注于盛有9m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1m L 无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1ʒ100的样品匀液㊂8.1.4按8.1.3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液㊂每递增稀释一次,换用1次1m L无菌吸管或吸头㊂8.2样品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1m L样品匀液以0.3m L㊁0.3m L㊁0.4m L接种量分别加入三块B a i r d-P a r k e r平板,然后用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘㊂使用前,如B a i r d-P a r k e r平板表面有水珠,可放在25ħ~50ħ的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失㊂8.3培养在通常情况下,涂布后,将平板静置10m i n,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36ħʃ1ħ培养1h;等样品匀液吸收后翻转平板,倒置后于36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂8.4典型菌落计数和确认8.4.1金黄色葡萄球菌在B a i r d-P a r k e r平板上呈圆形,表面光滑㊁凸起㊁湿润㊁菌落直径为2mm~ 3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带㊂当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感㊂有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同㊂从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥㊂8.4.2选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20C F U~ 200C F U之间的平板,计数典型菌落数㊂8.4.3从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验㊂分别做染色镜检,血浆凝固酶试验(见5.5);同时划线接种到血平板36ħʃ1ħ培养18h~24h后观察菌落形态,金黄色葡萄球菌菌落较大,圆形㊁光滑凸起㊁湿润㊁金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈㊂9结果计算9.1若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20C F U~200C F U之间,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.2 若最低稀释度平板的典型菌落数小于20C F U ,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.3 若某一稀释度平板的典型菌落数大于200C F U ,但下一稀释度平板上没有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.4 若某一稀释度平板的典型菌落数大于200C F U ,而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在20C F U~200C F U 范围内,应计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.5 若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20C F U~200C F U 之间,按式(2)计算㊂9.6 计算公式式(1):T =A BC d(1)式中:T样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A某一稀释度典型菌落的总数;B某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;C某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;d 稀释因子㊂式(2):T =A 1B 1/C 1+A 2B 2/C 21.1d(2)式中:T样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A 1第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B 1第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C 1第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;A 2第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;B 2第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C 2第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;1.1计算系数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂10 报告根据9中公式计算结果,报告每g (m L )样品中金黄色葡萄球菌数,以C F U /g(m L )表示;如T 值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告㊂第三法 金黄色葡萄球菌M P N 计数11 检验程序金黄色葡萄球菌M P N 计数检验程序见图3㊂图3金黄色葡萄球菌M P N法检验程序12操作步骤12.1样品的稀释按8.1进行㊂12.2接种和培养12.2.1根据对样品污染状况的估计,选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别接种1m L样品匀液至7.5%氯化钠肉汤管(如接种量超过1m L,则用双料7.5%氯化钠肉汤),每个稀释度接种3管,将上述接种物36ħʃ1ħ培养,18h~24h㊂12.2.2用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环,移种于B a i r d-P a r k e r平板36ħʃ1ħ培养,24h~48h㊂12.3典型菌落确认按8.4.1㊁8.4.3进行㊂13结果与报告根据证实为金黄色葡萄球菌阳性的试管管数,查M P N检索表(见附录C),报告每g(m L)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数,以M P N/g(m L)表示㊂附录A培养基和试剂A.17.5%氯化钠肉汤A.1.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠75g蒸馏水1000m LA.1.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.4ʃ0.2,分装,每瓶225m L,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.2血琼脂平板A.2.1成分豆粉琼脂(p H7.5ʃ0.2)100m L脱纤维羊血(或兔血)5m L~10m LA.2.2制法加热溶化琼脂,冷却至50ħ,以无菌操作加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板㊂A.3B a i r d-P a r k e r琼脂平板A.3.1成分胰蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g酵母膏1.0g丙酮酸钠10.0g甘氨酸12.0g氯化锂(L i C l㊃6H2O)5.0g琼脂20.0g蒸馏水950m LA.3.2增菌剂的配法30%卵黄盐水50m L与通过0.22μm孔径滤膜进行过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液10m L混合,保存于冰箱内㊂A.3.3制法将各成分加到蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,调节p H至7.0ʃ0.2㊂分装每瓶95m L,121ħ高压灭菌15m i n㊂临用时加热溶化琼脂,冷至50ħ,每95m L加入预热至50ħ的卵黄亚碲酸钾增菌剂5m L摇匀后倾注平板㊂培养基应是致密不透明的㊂使用前在冰箱储存不得超过48h㊂A.4脑心浸出液肉汤(B H I)A.4.1成分胰蛋白质胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠(12H2O)2.5g葡萄糖2.0g牛心浸出液500m LA.4.2制法加热溶解,调节p H至7.4ʃ0.2,分装16mmˑ160mm试管,每管5m L置121ħ,15m i n灭菌㊂A.5兔血浆取柠檬酸钠3.8g,加蒸馏水100m L,溶解后过滤,装瓶,121ħ高压灭菌15m i n㊂兔血浆制备:取3.8%柠檬酸钠溶液一份,加兔全血4份,混好静置(或以3000r/m i n离心30m i n),使血液细胞下降,即可得血浆㊂A.6磷酸盐缓冲液A.6.1成分磷酸二氢钾(K H2P O4)34.0g蒸馏水500m LA.6.2制法贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500m L蒸馏水中,用大约175m L的1m o l/L氢氧化钠溶液调节p H至7.2,用蒸馏水稀释至1000m L后贮存于冰箱㊂稀释液:取贮存液1.25m L,用蒸馏水稀释至1000m L,分装于适宜容器中,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.7营养琼脂小斜面A.7.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g~20.0g蒸馏水1000m LA.7.2制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2m L调节p H至7.3ʃ0.2㊂加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化,分装13mmˑ130mm试管,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.8革兰氏染色液A.8.1结晶紫染色液A.8.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20.0m L1%草酸铵水溶液80.0m LA.8.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.8.2革兰氏碘液A.8.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.8.2.2制法将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.8.3沙黄复染液A.8.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0m L蒸馏水90.0m LA.8.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A.8.4染色法a)涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1m i n,水洗㊂b)滴加革兰氏碘液,作用1m i n,水洗㊂c)滴加95%乙醇脱色约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂d)滴加复染液,复染1m i n,水洗㊁待干㊁镜检㊂A.9无菌生理盐水A.9.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000m LA.9.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000m L蒸馏水中,121ħ高压灭菌15m i n㊂附录B葡萄球菌肠毒素检验B.1试剂和材料除另有规定外,所用试剂均为分析纯,试验用水应符合G B/T6682对一级水的规定㊂B.1.1 A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型E L I S A检测试剂盒㊂B.1.2p H试纸,范围在3.5~8.0,精度0.1㊂B.1.30.25m o l/L㊁p H8.0的T r i s缓冲液:将121.1g的T r i s溶解到800m L的去离子水中,待温度冷至室温后,加42m L浓H C L,调p H至8.0㊂B.1.4p H7.4的磷酸盐缓冲液:称取N a H2P O4㊃H2O0.55g(或N a H2P O4㊃2H2O0.62g)㊁N a2H P O4㊃2H2O2.85g(或N a2H P O4㊃12H2O5.73g)㊁N a C l8.7g溶于1000m L蒸馏水中,充分混匀即可㊂B.1.5庚烷㊂B.1.610%次氯酸钠溶液㊂B.1.7肠毒素产毒培养基B.1.7.1成分蛋白胨20.0g胰消化酪蛋白200m g(氨基酸)氯化钠5.0g磷酸氢二钾1.0g磷酸二氢钾1.0g氯化钙0.1g硫酸镁0.2g菸酸0.01g蒸馏水1000m Lp H7.3ʃ0.2B.1.7.2制法将所有成分混于水中,溶解后调节p H,121ħ高压灭菌30m i n㊂B.1.8营养琼脂B.1.8.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g~20.0g蒸馏水1000m LB.1.8.2制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2m L校正p H至7.3ʃ0.2㊂加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化㊂分装烧瓶,121ħ高压灭菌15m i n㊂B.2仪器和设备B.2.1电子天平:感量0.01g㊂B.2.2均质器㊂B.2.3离心机:转速3000g~5000g㊂B.2.4离心管:50m L㊂B.2.5滤器:滤膜孔径0.2μm㊂B.2.6微量加样器:20μL~200μL㊁200μL~1000μL㊂B.2.7微量多通道加样器:50μL~300μL㊂B.2.8自动洗板机(可选择使用)㊂B.2.9酶标仪:波长450n m㊂B.3原理本方法可用A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型酶联免疫吸附试剂盒完成㊂本方法测定的基础是酶联免疫吸附反应(E L I S A)㊂96孔酶标板的每一个微孔条的A~E孔分别包被了A㊁B㊁C㊁D㊁E 型葡萄球菌肠毒素抗体,H孔为阳性质控,已包被混合型葡萄球菌肠毒素抗体,F和G孔为阴性质控,包被了非免疫动物的抗体㊂样品中如果有葡萄球菌肠毒素,游离的葡萄球菌肠毒素则与各微孔中包被的特定抗体结合,形成抗原抗体复合物,其余未结合的成分在洗板过程中被洗掉;抗原抗体复合物再与过氧化物酶标记物(二抗)结合,未结合上的酶标记物在洗板过程中被洗掉;加入酶底物和显色剂并孵育,酶标记物上的酶催化底物分解,使无色的显色剂变为蓝色;加入反应终止液可使颜色由蓝变黄,并终止了酶反应;以450n m波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值,样品中的葡萄球菌肠毒素与吸光度值成正比㊂B.4检测步骤B.4.1从分离菌株培养物中检测葡萄球菌肠毒素方法待测菌株接种营养琼脂斜面(试管18mmˑ180mm)36ħ培养24h,用5m L生理盐水洗下菌落,倾入60m L产毒培养基中,36ħ振荡培养48h,振速为100次/m i n,吸出菌液离心,8000r/m i n 20m i n,加热100ħ,10m i n,取上清液,取100μL稀释后的样液进行试验㊂B.4.2从食品中提取和检测葡萄球菌毒素方法B.4.2.1牛奶和奶粉将25g奶粉溶解到125m L㊁0.25M㊁p H8.0的T r i s缓冲液中,混匀后同液体牛奶一样按以下步骤制备㊂将牛奶于15ħ,3500g离心10m i n㊂将表面形成的一层脂肪层移走,变成脱脂牛奶㊂用蒸馏水对其进行稀释(1ʒ20)㊂取100μL稀释后的样液进行试验㊂B.4.2.2脂肪含量不超过40%的食品称取10g样品绞碎,加入p H7.4的P B S液15m L进行均质㊂振摇15m i n㊂于15ħ,3500g离心10m i n㊂必要时,移去上面脂肪层㊂取上清液进行过滤除菌㊂取100μL的滤出液进行试验㊂B.4.2.3脂肪含量超过40%的食品称取10g样品绞碎,加入p H7.4的P B S液15m L进行均质㊂振摇15m i n㊂于15ħ,3500g离心10m i n㊂吸取5m L上层悬浮液,转移到另外一个离心管中,再加入5m L的庚烷,充分混匀5m i n㊂于15ħ,3500g离心5m i n㊂将上部有机相(庚烷层)全部弃去,注意该过程中不要残留庚烷㊂将下部水相层进行过滤除菌㊂取100μL的滤出液进行试验㊂B.4.2.4其他食品可酌情参考上述食品处理方法㊂B.4.3检测B.4.3.1所有操作均应在室温(20ħ~25ħ)下进行,A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型E L I S A检测试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温方可使用㊂测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头,用过的吸头以及废液处理前要浸泡到10%次氯酸钠溶液中过夜㊂B.4.3.2将所需数量的微孔条插入框架中(一个样品需要一个微孔条)㊂将样品液加入微孔条的A~G 孔,每孔100μL㊂H孔加100μL的阳性对照,用手轻拍微孔板充分混匀,用黏胶纸封住微孔以防溶液挥发,置室温下孵育1h㊂B.4.3.3将孔中液体倾倒至含10%次氯酸钠溶液的容器中,并在吸水纸上拍打几次以确保孔内不残留液体㊂每孔用多通道加样器注入250μL的洗液,再倾倒掉并在吸水纸上拍干㊂重复以上洗板操作4次㊂本步骤也可由自动洗板机完成㊂B.4.3.4每孔加入100μL的酶标抗体,用手轻拍微孔板充分混匀,置室温下孵育1h㊂B.4.3.5重复B.4.3.3的洗板程序㊂B.4.3.6加50μL的TM B底物和50μL的发色剂至每个微孔中,轻拍混匀,室温黑暗避光处孵育30m i n㊂B.4.3.7加入100μL的2m o l/L硫酸终止液,轻拍混匀,30m i n内用酶标仪在450n m波长条件下测量每个微孔溶液的O D值㊂B.4.4结果的计算和表述B.4.4.1质量控制测试结果阳性质控的O D值要大于0.5,阴性质控的O D值要小于0.3,如果不能同时满足以上要求,测试的结果不被认可㊂对阳性结果要排除内源性过氧化物酶的干扰㊂B.4.4.2临界值的计算每一个微孔条的F孔和G孔为阴性质控,两个阴性质控O D值的平均值加上0.15为临界值㊂示例:阴性质控1=0.08阴性质控2=0.10平均值=0.09临界值=0.09+0.15=0.24B.4.4.3结果表述O D值小于临界值的样品孔判为阴性,表述为样品中未检出某型金黄色葡萄球菌肠毒素;O D值大于或等于临界值的样品孔判为阳性,表述为样品中检出某型金黄色葡萄球菌肠毒素㊂B.5生物安全因样品中不排除有其他潜在的传染性物质存在,所以要严格按照G B19489‘实验室生物安全通用要求“对废弃物进行处理㊂附录C金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)检索表每g(m L)检样中金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)的检索见表C.1㊂表C.1金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)检索表阳性管数0.100.010.001M P N 95%置信区间下限上限000<3.0 9.5 0013.00.159.6 0103.00.1511 0116.11.218 0206.21.218 0309.43.638 1003.60.1718 1017.21.318 102113.638 1107.41.320 111113.638 120113.642 121154.542 130164.542 2009.21.438 201143.642 202204.542 210153.742 211204.542 212278.794阳性管数0.100.010.001M P N95%置信区间下限上限220214.542 221288.794 222358.794 230298.794 231368.794 300234.694 301388.7110 3026417180 310439180 3117517200 31212037420 31316040420 3209318420 32115037420 32221040430 323290901000 330240421000 331460902000 33211001804100 333>1100420注1:本表采用3个稀释度[0.1g(m L)㊁0.01g(m L)和0.001g(m L)]㊁每个稀释度接种3管㊂注2:表内所列检样量如改用1g(m L)㊁0.1g(m L)和0.01g(m L)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g (m L)㊁0.001g(m L)㊁0.0001g(m L)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推㊂。
GB 4789.28-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质
1中国卫生标准管理CHSM 16标准宣贯与执行马群飞中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2013年11月29日发布、2014年6月1日正式实施的GB 4789.28－2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》（以下简称2013版标准）至今已经实施了5年[1]。
这个标准方法可以说是目前所有食品检验机构和食品生产企业微生物学实验室质量控制的基础。
虽然篇幅大、规定多，但是标准各章节的描述都不够详尽，在具体操作细节方面更是存在各种疏漏，检验机构困惑较多，理解应用时也常常出现偏差，影响了标准的实施效果。
检验机构接受现场评审时，在培养基和试剂质量控制环节被开不符合项的情作者单位：福建省疾病预防控制中心卫生微生物检验科，福建 福州 350001GB 4789.28－2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》应用现状【摘要】针对2014年6月1日起正式实施的GB 4789.28－2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》，结合现行的实验室质量管理规范，分别从微生物学检验培养基质量控制的意义、培养基和试剂质量控制的要求、GB 4789.28－2013的具体要求和存在问题等方面分析了标准的应用现状。
通过探讨标准中各章节不够详尽的描述、具体操作细节存在的各种疏漏，包括与其他相关标准规定的不配套之处等问题，期望有助于检验人员更好地理解和应用标准，增加标准应用的可操作性。
【关键词】培养基；试剂；食品安全；国家标准；微生物；检验【中图分类号】R197 【文献标识码】A 【文章编号】1674-9316（2019）16-0001-03doi:10.3969/j.issn.1674-9316.2019.16.001Application Status of GB 4789.28-2013 “National Food Safety Standards -Food Microbiological Examination: Quality Requirements for Culture Mediums and Reagents”MA Qunfei Health Microbiology Laboratory, Fujian Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou Fujian 350001, China[Abstract] In accordance with GB 4789.28-2013“National Food Safety Standards-Food Microbiological Examination: Quality Requirements for Culture Mediums and Reagents”, which was formally implemented on June 1, 2014, and combined with the existing laboratory quality management standards, the significance of quality control of culture medium and reagent for microbiological examination, the requirements for quality control of culture medium and reagent, and the specific requirements and existing problems of GB 4789.28-2013 were discussed respectively. The application status of the standard is analyzed in the aspects of questions and so on. By discussing the inadequate description of each chapter in the standard and various omissions in the specific operation details, including the incompatibility with other relevant standards, it is expected to help inspectors better understand and apply the standard and increase the operability of the standard application.[Keywords] culture medium; reagent; food safety; national standard; microbiology; examination况极为常见。
微生物学检验标准-4789
食品卫生微生物学检验标准-4789名称∙12/08GB 4789.9-2014 食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验∙12/08GB 4789.11-2014 食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验∙12/08GB 4789.14-2014 食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验∙12/13GB 4789.7-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验∙12/13GB 4789.26-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验∙12/13GB 4789.28-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求∙12/13GB 4789.31-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验∙12/13GB 4789.39-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数∙06/12GB 4789.38-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数∙06/12GB 4789.34-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定∙06/12GB 4789.13-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验∙06/12GB 4789.5-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验∙06/11现行有效的4789系列食品微生物学检验标准汇编（2012年7月更新）∙04/23食品安全国家标准食品微生物学检验标准汇编 GB4789系列（2010版，已根据卫生部2010年5月26日的勘误公告进行更新）∙04/22GB 4789.40-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验∙04/22GB 4789.35-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验∙04/22GB 4789.30-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验∙04/22GB 4789.18-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验∙04/22GB 4789.15-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数∙04/22GB 4789.10-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验∙04/22GB 4789.4-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验∙04/22GB 4789.3-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数∙04/22GB 4789.2-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定∙04/22GB 4789.1-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验总则∙03/19GB/T 4789.39-2008 食品卫生微生物学检验粪大肠菌群计数∙03/19GB/T 4789.38-2008 食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数∙03/19GB/T 4789.34-2008 食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验∙03/19GB/T 4789.30-2008 食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验∙03/19GB/T 4789.27-2008 食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验∙03/19GB/T 4789.10-2008 食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验∙03/19GB/T 4789.9-2008 食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验∙03/19GB/T 4789.8-2008 食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验∙03/19GB/T 4789.2-2008 食品卫生微生物学检验菌落总数测定∙03/19GB/T 4789.1-2008 食品卫生微生物学检验总则∙09/28GB/T 4789.36-2008 食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验∙09/28GB/T 4789.4-2008 食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验∙09/24GB/T 4789.7-2008 食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验∙04/11食品卫生微生物学检验标准汇编 GB/T4789系列（2003-2008版）∙04/07GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验大肠菌群测定∙06/21GB/T 4789.32-2002 食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测∙05/09GB/T 4789.33-2003 食品卫生微生物学检验粮谷、果蔬类食品检验∙05/09GB/T 4789.31-2003 食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬体检验方法∙05/09GB/T 4789.30-2003 食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验∙05/09GB/T 4789.29-2003 食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验∙05/09GB/T 4789.28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂∙05/09GB/T 4789.27-2003 食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留量检验∙05/09GB/T 4789.16-2003 食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定∙05/09GB/T 4789.26-2003 食品卫生微生物学检验罐头食品商业无菌的检验∙05/09GB/T 4789.25-2003 食品卫生微生物学检验酒类检验∙05/09GB/T 4789.24-2003 食品卫生微生物学检验糖果、糕点、蜜饯检验∙05/09GB/T 4789.23-2003 食品卫生微生物学检验冷食菜、豆制品检验∙05/09GB/T 4789.22-2003 食品卫生微生物学检验调味品检验∙05/09GB/T 4789.21-2003 食品卫生微生物学检验冷冻饮品、饮料检验∙05/09GB/T 4789.20-2003 食品卫生微生物学检验水产食品检验∙05/09GB/T 4789.19-2003 食品卫生微生物学检验蛋与蛋制品检验∙05/09GB/T 4789.18-2003 食品卫生微生物学检验乳与乳制品检验∙05/09GB/T 4789.17-2003 食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验∙05/09GB/T 4789.15-2003 食品卫生微生物学检验霉菌和酵母计数∙05/09GB/T 4789.14-2003 食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验∙05/09GB/T 4789.13-2003 食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验∙05/09GB/T 4789.12-2003 食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验∙05/09GB/T 4789.11-2003 食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验∙05/09GB/T 4789.10-2003 食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验∙05/08GB/T 4789.4-2003 食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验∙05/08GB/T 4789.2-2003 食品卫生微生物学检验菌落总数测定∙05/08GB/T 4789.1-2003 食品卫生微生物学检验总则∙05/08GB/T 4789.9-2003 食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验∙05/08GB/T 4789.7-2003 食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验∙05/08GB/T 4789.6-2003 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验∙05/08GB/T 4789.5-2003 食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验。
(自然科学)GB4789涉及的微生物常规检测技术
试验器材准备
• 过滤除菌：滤器—适用于对温度不耐受 的某些添加物
• 紫外线：200-275nm，250-270nm； 10m2无菌室需装30w紫外灯1只（距台 面1m）
试验器材准备
高压蒸汽灭菌效果测定：
• 留点温度计测试法：160℃，50℃ • 化学指示剂测试法：OK试纸 • 微生物学测试法：可直接取得灭菌效果的数据，
菌落总数测定
• 计算公式：N=∑C/（n1+0.1n2）d
N-样品中菌落数； ∑C-平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之
和；
n1-第一个适宜稀释度平板上的菌落数； n2-第二个适宜稀释度平板上的菌落数； d-稀释因子（第一稀释度）
菌落总数测定-涂布法
大肠菌群计数
定义 • 大肠菌群：一群在36℃条件下培养48h
能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌 氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 • 最可能数（MPN）：基于泊松分布的一 种间接计数方法
埃希菌属 柠檬酸杆菌属 肠杆菌属
克雷伯菌属
大肠菌群计数
☺MPN检索表 • MPN值：表示样品中活菌密度的估测数，
是细菌密度的估计值 • MPN测定的最理想结果应是最低稀释度的
全部管为阳性，最高稀释度的全部管为 阴性
• 大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养 基上形成的菌落和细菌的很相似，只是 比细菌菌落大且厚
• 液体培养也和细菌相似，有均匀生长、 沉淀或在液面形成菌膜
肠杆菌科、弧菌科及金葡菌检测
培养特性观察 形态结构观察 生理生化试验 血清学试验
平板划线分离
固体培养基
培养特性观察
液体培养基
半固体培养基
大肠菌群计数
• 检索表为10倍稀释，设3个稀释度：当按 10倍加大或减少接种量时，所得结果按 表内数值相应降低或增加10倍
图解GB 4789.15霉菌和酵母计数
GB 4789.15－2016霉菌和酵母计数野兽食品伙伴网应用概况1标准修订2标准详解3质控要求4CONTENTSPART 1霉菌和酵母概况Overview of mould and yeastNational Food Safety Standard Food Microbiological Examination病毒原核生物原生生物真菌植物动物生物六界分类法真菌（菌物）已发现七万多种大型真菌是各类蕈类，小型真菌包括霉菌和酵母。
与动物、植物主要的区别是，真菌有细胞壁，主要成分为甲壳素（几丁质）。
相对于低等的细菌来说，霉菌和酵母生长缓慢，竞争力较弱，故只能在不利于细菌的环境中形成优势。
霉菌和酵母基本特性少数对人类有益，绝大多数不造成直接危害，但可导致食品的腐败变质，极少数能够致病或产生真菌毒素，危害极大。
细胞较大，代谢能力比细菌强100倍以上，故标准限量更严格。
危害生长水活度细菌0.90酵母0.87霉菌0.70卫生学意义霉菌和酵母计数主要用于判定样品被真菌污染程度，也可用于监测样品中真菌的性质和繁殖动态，进行样品的卫生学综合评价。
Mould and YeastPART 2检验方法标准修订Revision of Inspection Method Standard National Food Safety Standard Food Microbiological ExaminationGB 4789.15－84卫生部食品卫生监督检验所归口并负责起草。
主要起草人：罗雪云GB/T 4789.15－2003起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。
主要起草人：罗雪云、李风琴、李玉伟GB 4789.15－94卫生部食品卫生监督检验所归口并负责起草。
主要起草人：罗雪云GB 4789.15－2010未公布检验方法标准制修订GB 4789.15－2016起草单位：国家食品安全风险评估中心。
主要起草人：李凤琴、韩小敏、江涛、赵熙等参考国内外标准情况GB 4789.15－2010主要的技术性变化，就是培养温度从25℃～27℃修改为28℃。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
霉菌和酵母菌计数
• 霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都 常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心， 正面和背面颜色常常不同，如青霉菌： 孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝 褐色
霉菌和酵母菌计数
• 霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状 和蜘蛛网状菌落
霉菌和酵母菌计数
GB/T 4789.4-2008食品卫生微生物学检 验 沙门氏菌检验
GB/T 4789.7-2008食品卫生微生物学检 验 副溶血性弧菌检验
GB/T 4789.8-2008食品卫生微生物学检 验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验
GB/T 4789.9-2008食品卫生微生物学检 验 空肠弯曲菌检验
选择编码
5×0.01ml 5×0.001ml 5×0.0001ml 结果
确定MPN 乘积倍数
1
5
5
2
0
0
5-2-0
100
25
5
4
1
0
5-4-1
100
35
3
0
0
45
5
5
3
0
5-3-0
10
1
5-3-1
1000
50
1
0
0
0
0-1-0
10
大肠菌群计数
• 当从表上查不到所得到的阳性管组合时，最 好是重新检测或查阅更完整的MPN检索表—表 内所列阳性管组合是最为常见的，出现机率 为99%以上，未列出的阳性组合，其总数不到 1%
GB/T 4789.35-2008食品卫生微生物学 检验 食品中乳酸菌检验
GB/T 4789.36-2008食品卫生微生物学检验 大肠埃希 氏菌O157:H7/NM检验
GB/T 4789.37-2008食品卫生微生物学检验 金黄色葡 萄球菌计数
GB/T 4789.38-2008食品卫生微生物学检验 大肠杆菌 计数
大肠菌群计数
• MPN法还可用于测定食品中其它细菌，如 沙门菌、粪链球菌、亚硫酸盐还原菌 等—须选用适合其生物特性的选择性培 养基
霉菌和酵母菌计数
培养时间：3d开始，5d结束 培养温度：25℃～28℃ 计数方法：选择菌落数在10～150之间
的平皿计数
霉菌和酵母菌计数
生长特征 • 霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条
菌落总数测定
定义：食品检样经过处理，在一定条件 下培养后（如培养基成分、培养温度和 时间、pH、需氧性质等），所得1mL（或 1g）检样中形成菌落的总数
菌落总数测定
• 只包括一群在平板计数琼脂上生长发育 的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总 数
• 不包括厌氧菌、微需氧菌和嗜冷菌及有 特殊营养要求的菌
是最可靠的方法—嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞菌片 （每片含1-5×106），溴甲酚紫葡萄糖蛋白 胨水
试验器材准备
紫外线消毒要求： • 保持灯管无尘—定期用酒精棉球擦拭紫外线辐
射强度不低于70µw/cm2，照射时间 ≥25min —经常检测紫外线强度。紫外线强度 仪 • 使用时间>1000h时—定期更换灯管
GB/T 4789.39-2008食品卫生微生物学检验 粪大肠菌 群计数
GB/T 4789.40-2008食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆 菌检验
菌落总数测定 大肠菌群计数 霉菌和酵母菌计数
沙门氏菌检验 志贺氏菌检验 副溶血弧菌检验 金黄色葡萄球菌检验
试验器材准备 样品处理和接种 增菌培养 选择性分离平板分离培养 挑选菌落并进行生化试验 生化结果及血清学试验 初步判断
菌落总数测定
• 计算公式：N=∑C/（n1+0.1n2）d
N-样品中菌落数； ∑C-平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之
和；
n1-பைடு நூலகம்一个适宜稀释度平板上的菌落数； n2-第二个适宜稀释度平板上的菌落数； d-稀释因子（第一稀释度）
菌落总数测定-涂布法
大肠菌群计数
定义 • 大肠菌群：一群在36℃条件下培养48h
GB4789-2003 • 34项 GB4789-2008 • 39项 方法改变12项，新增5项
GB/T 4789.1-2008食品卫生微生物学检 验 总则
GB/T 4789.2-2008食品卫生微生物学检 验 菌落总数测定
GB/T 4789.3-2008食品卫生微生物学检 验 大肠菌群计数
大肠菌群计数
• 检索表为10倍稀释，设3个稀释度：当按 10倍加大或减少接种量时，所得结果按 表内数值相应降低或增加10倍
• 当怀疑水样有严重污染时，可用10倍稀 释系列接种3个以上稀释度—应做到最高 稀释度至少有1管阴性
表:不同稀释样品确定MPN所需乘积倍数举例
实 例
5×1ml
5×0.1ml
阳性反应管数
GB/T 4789.10-2008食品卫生微生物学 检验 金黄色葡萄球菌检验
GB/T 4789.27-2008食品卫生微生物学 检验 鲜乳中抗生素残留检验
GB/T 4789.30-2008食品卫生微生物学 检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验
GB/T 4789.34-2008食品卫生微生物学 检验 双歧杆菌检验
试验器材准备
• 过滤除菌：滤器—适用于对温度不耐受 的某些添加物
• 紫外线：200-275nm，250-270nm； 10m2无菌室需装30w紫外灯1只（距台 面1m）
试验器材准备
高压蒸汽灭菌效果测定：
• 留点温度计测试法：160℃，50℃ • 化学指示剂测试法：OK试纸 • 微生物学测试法：可直接取得灭菌效果的数据，
试验器材准备
玻璃器皿清洁 • 新购的器皿：流水冲洗→1～2%（工业用）
盐酸浸泡2～6h →流水冲洗 • 用过的器皿：直接清洗；高压灭菌后清
洗
试验器材准备
消毒和灭菌 • 湿热灭菌：高压蒸汽灭菌法—适用于耐
热的物品 • 干热灭菌：干烤箱—适用于在高温下不
损坏、不变质、不蒸发的物品（160～ 170℃持续2h）
能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌 氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 • 最可能数（MPN）：基于泊松分布的一 种间接计数方法
埃希菌属 柠檬酸杆菌属 肠杆菌属
克雷伯菌属
大肠菌群计数
☺MPN检索表 • MPN值：表示样品中活菌密度的估测数，
是细菌密度的估计值 • MPN测定的最理想结果应是最低稀释度的
全部管为阳性，最高稀释度的全部管为 阴性