实验一、骨髓瘤细胞的培养
细胞为骨髓瘤细胞SP20
聚乙二醇介导的细胞融合
（四）融合后混合细胞的培养
随机融合后的细胞类型
细胞类型
淋巴细胞+骨髓瘤细胞 淋巴细胞+淋巴细胞 骨髓瘤细胞+骨髓瘤细胞 未融合淋巴细胞 未融合骨髓瘤细胞
HGPRT
+ + + -
生长状态
长期生长 短期生长 不能生长 短期生长 不能生长
采用HAT培养液选择培养 1.换液（半量换液）2.观察
DNA，必然死亡。 B淋巴细胞在一般培养基中 不能长期生长，一般于2周内死亡。 融合的杂交瘤细胞由于淋 巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化 酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA， 克服氨基蝶呤的阻断，因此可以大 量繁殖而被筛选出来
实验材料
实验动物为纯系Balb/c小鼠，细胞为骨髓瘤细胞SP2/0; 含有一定表位的抗原； 10%DMEM培养液； HAT选择性培养基； HT选择性培养基； 融合剂为PEG2000； 兔抗鼠IgG酶标抗体； 台盼蓝溶液； 细胞培养板及常规细胞培养用试剂和器材。
（五）阳性杂交瘤细胞的克隆筛选
杂交瘤细胞在HAT培养液中生长形成克隆后，其中仅少 数是分泌预定特异性McAb的细胞，而且多数培养孔中有 多个克隆生长，分泌的抗体也可能不同，因此必须进行 筛选和克隆化。 克隆化可选择的方法有液相有限稀释法、软琼脂平板法 、显微镜操作法及应用荧光激活细胞分离仪等，其中最 常用的是液相有限稀释法及软琼脂平板法。
免疫沉淀法、ELISA方法、RIA方法、免疫荧光法
McAb识别抗原表位的测定
竞争抑制试验、相加指数法、微机集群分析、免疫印迹及基因工程技术
注意事项
免疫动物的选择 免疫方案的合理制定 骨髓瘤细胞株的选择 融合剂聚乙二醇的使用 避免操作中的污染 融合后的克隆株不生长原因分析 用液氮冻存的脾细胞进行细胞融合问题
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
.1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／ ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／ ip↓3周后\加强免疫(融合前三天) 1×10７／ ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般～1ml ／点)^↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip}│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
细胞培养实验集合
实验一培养基的配制及细胞培养的条件一、培养基的特性－细胞生存的环境与条件1、温度条件（37 ＋0.5）2、pH条件（7.2-7.4）3、气体条件4、水的质量（三蒸）5、渗透压6、营养条件7、无菌条件℃二、培养基的分类1、平衡盐液2、天然培养基（小牛血清、胚胎液）3、合成培养基（化学成分清楚）三、RPMI1640培养基的配制1、RPMI1640 10 g2、丙酮酸钠 .0.11 g3、Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸） 5.925 g4、NaHCO3 2 g5、三蒸水 1000 mL四、过滤出菌电磁搅仪器：不锈钢正压滤器材料：纤维素微孔虑膜（0.22 mm 孔径）装好后消毒五、完全培养基的配制RPMI 1640 培养液 85 mL小牛血清 10 mL谷氨酰氨 1 mL抗菌素（青、链霉素） 1万单位 1 mL实验二动物细胞培养细胞培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。
由于体外培养的细胞其结构和功能接近体内情况，便于使用各种技术和方法进行研究，并能在较长时间内直接观察细胞生长、发育、分化过程中的形态和功能变化，而且可同时提供大量生物学性状相似的细胞作为研究对象。
所以细胞培养已经成为现代医学研究中一项非常重要的技术。
细胞培养不但是一门技术，也是一门科学，有它的基本理论、基本知识、和基本方法。
一、实验目的1. 使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程；2. 学习动物细胞原代培养和传代培养的基本方法，掌握动物细胞培养中的无菌操作技术，以及培养细胞的形态分类特点；3. 以所培养细胞为材料，了解细胞冻存的几种简易方法并通过实验掌握其中的一种方法；4. 以所培养细胞为材料，学习动物细胞融合的几种方法并掌握其中的一种方法。
二、实验条件本实验在细胞工程实验室完成。
1、需要提供CO2培养箱，细胞融合仪，冷冻仪，研究用成像显微镜，体视成像显微镜，普通显微镜，生化培养箱，全自动高压灭菌锅，水浴锅，超声波清洗仪，超净工作台，真空泵，冷冻离心机，干燥箱，剪刀，镊子，液氮罐，纯水器，低温冰箱，普通冰箱等。
生物技术制药试题及答案(三)
生物技术制药试题(单选题) 1: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 2: 进行动物细胞培养时，最好选用的培养材料是( )A: 衰老退化的动物组织细胞B: 成熟动物个体的体细胞C: 动物的受精卵细胞D: 健康动物、胚胎或幼龄动物个体的体细胞正确答案:(单选题) 3: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 4: 在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是（）。
A: 用mRNA为模板逆转录合成DNAB: 以4种脱氧核苷酸为原料人工合成C: 将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选D: 由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA正确答案:(单选题) 5: 关于基因治疗的叙述，不正确的是（）A: 基因治疗可以有效地改善患者的生理状况，其操作对象是基因B: 进行基因治疗时，基因的受体细胞是受精卵C: 基因治疗并不是对患者体内细胞的缺陷基因进行改造D: 基因治疗时可只对患者部分细胞输入正常基因正确答案:(单选题) 6: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 7: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 8: 人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成。
通过转基因技术，可以获得人的糖蛋白的受体细胞是( )A: 大肠杆菌B: 酵母菌C: 噬菌体D: 肺炎球菌正确答案:(单选题) 9: 对致病基因的异常碱基进行纠正，保留正常部分的技术方法是（）A: 基因矫正B: 基因替代C: 基因置换D: 反义核酸技术E: 基因敲除正确答案:(单选题) 10: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 11: 基因工程中，切割目的基因和载体所用的限制酶及切口必备的特点是（）。
A: 可用不同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同B: 必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端可不相同C: 必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同D: 可用不同的限制性内切酶，露出不同的黏性末端正确答案:(单选题) 12: 下列关于基因表达载体的构建，叙述不正确的是( )A: 目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传和表达发挥作用B: 一个基因表达载体的组成含有目的基因、标记基因、启动子、终止子等C: 终止子位于mRNA的尾端，使转录在所需要的地方停止下来D: 由于不同的受体细胞及目的基因导入的方法不同，基因表达载体的构建也有所差别正确答案:(单选题) 13: 下列有关“基因探针”的叙述，不正确的是( )A: 基因探针的工作原理是碱基互补配对B: 待测的DNA分子首先要解旋变为单链，才可用基因探针测序C: 待测的DNA分子可以直接用基因探针测序D: 基因探针技术可用于疾病诊断和环境监测正确答案:(单选题) 14: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 15: 在基因治疗时，目前哪一种细胞不能作为靶细胞（）A: 淋巴细胞B: 肿瘤细胞C: 生殖细胞D: 肝细胞E: 造血细胞正确答案:(多选题) 1: 基因失活的技术包括（）A: 反义RNAB: 核酶C: RNA干扰D: 抗体正确答案:(多选题) 2: 控制潜在RNA酶活性的因素有（）。
_细胞工程试题(卷)答案
2014---2015年第二学期细胞工程试卷答案一、填空题1、目前，体外受精成功的标志至少是看受精卵可以发育至囊胚期阶段。
2、动物细胞培养需要防止污染问题，显著污染的标志是PH显著改变，细胞外形模糊，甚至出现漂浮的集落。
3、超数排卵是向动物体注射某些促性腺激素，对卵巢产生作用促进排卵。
4、动物细胞培养时，细胞主要以聚集体形式存在。
5、细胞融合实验最常用的生物促融剂是仙台病毒（HVJ）。
6、胚胎工程中最关键的技术是体外受精和胚胎移植。
7、克隆动物制备主要是通过不同来源的细胞核移植实现的。
8、动物细胞体外培养的培养基包括：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。
9、动物细胞培养一般经过：原代培养、传代培养和衰退期三个阶段。
消化法传代是实验室动物细胞培养的传代方法。
10、干细胞从来源上可分为胚胎干细胞和成体干细胞两种。
从功能上可分为单能干细胞、多能干细胞和全能干细胞。
11、HAT选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T）。
12、影响超数排卵效果的因素包括供体年龄、供体品种差异、激素剂量、卵巢状况等。
13、动物多倍体培育常用的物理方法包括：温度激变（温度休克法）、水静压法、机械损伤、辐射高盐碱法等。
14、女性细胞在间期出现的三角形或半月状的染色体，称为Barr's小体。
15、哺乳动物的Y染色体上有一个性别遗传控制因子，称为睾丸决定因子。
16、大量产生单克隆抗体的方法主要有杂交瘤细胞体接种法和体外培养法。
—17、卵母细胞成熟的一些标志包括发生泡破裂、染色体凝集、纺锤体形成、极体排出、透明带软化、卵丘细胞扩散。
18、灭菌方法有高压蒸汽灭菌、干热灭菌、燃烧灭菌、射线灭菌。
19、细胞超低温储贮存分快速冷冻法和逐步冷冻法。
20、组织培养细胞一代生长过程潜伏期、指数增长期、停止期三阶段。
二、名词解释1、细胞工程：应用细胞生物学和分子生物需的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的综合性科学技术。
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。
上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。
PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。
二、细胞融合（Cell fusion）【材料和试剂】（1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
（2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，•分离血清冻存备用。
拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。
无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。
将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min 离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。
然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。
（3）饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。
用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。
医学实验中细胞培养的基本操作教程
医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。
本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。
一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。
2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。
3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。
4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。
5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。
二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。
2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。
3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。
4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。
5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。
三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。
3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。
4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。
5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。
以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。
动物细胞融合实验报告
一、实验目的1. 理解动物细胞融合的基本原理和常用方法。
2. 掌握化学融合和电融合的基本操作步骤。
3. 观察动物细胞融合过程中的行为和变化。
4. 通过实验验证细胞融合技术的有效性。
二、实验原理细胞融合是指两个或两个以上的细胞在自发或诱导条件下，合并成为双核或多核细胞的过程。
动物细胞融合技术广泛应用于生物医学、细胞工程等领域。
目前，常见的诱导细胞融合的方法包括病毒诱导融合、化学融合、电融合等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 小鼠脾细胞- 小鼠骨髓瘤细胞- 聚乙二醇（PEG）- 灭活仙台病毒- 电融合仪- 液体培养基- 洗涤缓冲液- 倒置显微镜2. 实验仪器：- 倒置显微镜- 低温冰箱- 恒温培养箱- 超净工作台- 电子天平- 移液器四、实验步骤1. 细胞培养：将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞分别培养在含有10%胎牛血清的液体培养基中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。
2. 细胞收获：将培养至对数生长期的细胞用胰酶消化，收集细胞，用洗涤缓冲液洗涤，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
3. 化学融合：- 将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合，加入适量PEG，充分混合后静置5分钟。
- 加入洗涤缓冲液，终止反应，洗涤细胞。
4. 电融合：- 将混合后的细胞放入电融合仪的电极槽中，设定电压和时间参数。
- 启动电融合仪，进行电融合实验。
5. 细胞培养：将融合后的细胞接种于含有10%胎牛血清的液体培养基中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。
6. 细胞观察：利用倒置显微镜观察融合细胞的形态和细胞核的变化。
五、实验结果与分析1. 在化学融合实验中，观察到部分细胞发生融合，形成双核或多核细胞。
2. 在电融合实验中，观察到部分细胞发生融合，形成双核或多核细胞。
3. 融合细胞的细胞核呈现明显的核仁，且核膜清晰。
六、实验结论本实验成功实现了小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合，验证了细胞融合技术的有效性。
细胞工程实验报告
细胞工程实验报告专业：生物技术班级：0801 姓名：励丹学号：30804305一、实验目的1、了解动物细胞培养的相关实验器材以及实验前器材的清洗与消毒、无菌室灭菌与消毒等基本方法，以建立起无菌操作的概念。
2、了解和掌握动物细胞原代培养的基本方法，熟悉组织块法和消化法培养的基本操作过程。
初步掌握无菌操作技术。
3、学习与了解细胞超低温冻存于复苏的基本原理，初步掌握培养细胞常规超低温冻存于复苏以及玻璃化超低温冻存于复苏的方法。
4、掌握ELISA测定抗体效价的方法，细胞的超低温冻存和复苏，及MTT法测定细胞活性的方法。
5、学习和掌握制备饲养层细胞的方法，为杂交瘤细胞的制备做准备。
6、学习从脾脏组织制备免疫细胞的方法，从免疫脾脏中制备免疫细胞悬液，用于杂交瘤细胞的融合。
7、学习和掌握动物细胞融合的基本方法，通过免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，并进行选择。
8、学会细胞形态的观察和分析，细胞技术等细胞培养中常见的问题。
二、实验原理1、原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后直到第一次传代为止。
原代培养首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织或器官，切成一定大小的组织块，直接或经消化分散成单个游离的细胞，在人工培养条件下，使其不断地生长、繁殖。
2、细胞活性测定——MTT法MTT法是利用细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶四氮唑蓝还原成难溶的蓝紫色结晶——甲瓒，经二甲基亚砜（DMSO）溶解后，在490nm处测吸收值，其吸收值可间接反映细胞的活性状态及活细胞数量。
3、培养细胞的超低温冻存于复苏为了保持细胞株（系）遗传的稳定性以及非连续使用细胞的长期保存，建立了细胞超低温冻存于复苏技术。
目前细胞超低温冻存技术主要有两种方法，即常规超低温冻存和玻璃化超低温冻存。
活细胞在超低温下克服了分子间的热运动，因而可长期保存而不影响活力。
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。
单克隆抗体制备实验报告
一、实验目的1. 了解单克隆抗体制备的基本原理和实验流程；2. 掌握单克隆抗体制备过程中各步骤的操作方法；3. 通过实验，获得特异性单克隆抗体。
二、实验原理单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
制备单克隆抗体的基本原理是杂交瘤技术，即将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而培养出单克隆细胞，最终获得单克隆抗体。
三、实验材料1. 实验动物：Balb/c小鼠；2. 细胞：SP2/0骨髓瘤细胞；3. 抗原：待筛选的抗原；4. 试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝佐剂、细胞培养液、抗生素、无菌操作器具等。
四、实验步骤1. 动物免疫（1）首免：将抗原与弗氏完全佐剂混合，通过多点注射法注射给Balb/c小鼠，剂量为150-200g/只。
（2）加强免疫：在首免后2-3周，重复首免过程。
2. B细胞提取（1）无菌操作，处死小鼠，取脾脏，制成单细胞悬液。
（2）用细胞分离液分离B细胞。
（3）洗涤、计数，调整细胞浓度。
3. 细胞融合（1）将B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合。
（2）将融合细胞在含有抗生素的细胞培养液中培养。
4. 杂交瘤细胞筛选（1）在培养液中加入抗原，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
（2）将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，获得单克隆细胞。
5. 单克隆抗体制备（1）将单克隆细胞在培养液中扩大培养，收集上清液。
（2）对上清液进行抗体检测，鉴定抗体特异性。
（3）采用适当方法纯化抗体，如亲和层析、离子交换层析等。
五、实验结果1. 成功获得特异性单克隆抗体。
2. 抗体特异性经ELISA等方法验证，与待筛选抗原具有高度特异性。
3. 抗体亲和力良好，可用于后续实验。
六、实验总结本次实验成功制备了特异性单克隆抗体，掌握了单克隆抗体制备的基本原理和实验流程。
在实验过程中，应注意以下几点：1. 动物免疫时，抗原与佐剂的混合比例、注射剂量、注射次数等要严格控制。
单克隆抗体的实验流程
单克隆抗体的实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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骨髓瘤细胞SP20 培养过程中遇到的问题及对策
骨髓瘤细胞SP2/0 培养过程中遇到的问题及对策
1，细胞长的慢或细胞死亡
正常生长情况下，细胞一天传代一次，生长越好，贴壁越多
对策：①培养基配方不对；②接种密度太低，低于10的4次方；③污染了支原体或者其他不明细菌，支原体的现状是出现小黑点；细菌污染是浑浊；霉菌污染是出现白色肉眼可见菌落；不明细菌污染出现砂状平铺背景，视野发暗。
④细胞瓶刷洗不干净
2，细胞形态异常
正常生长情况下，细胞浑圆，透亮，成对数生长，生长越好，贴壁多，悬浮少
对策：①培养基配方不对；②接种密度太低，低于10的4次方；③污染了支原体或者其他不明细菌，支原体的现状是出现小黑点；细菌污染是浑浊；霉菌污染是出现白色肉眼可见菌落；不明细菌污染出现砂状平铺背景，视野发暗。
④细胞瓶刷洗不干净。
杂交瘤细胞筛选实验报告
一、实验目的本实验旨在通过细胞融合技术，获得具有无限增殖能力和特异性抗体分泌能力的杂交瘤细胞。
通过筛选和克隆化，最终获得纯化的单克隆抗体。
二、实验原理杂交瘤细胞筛选技术是利用细胞融合技术，将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的淋巴细胞融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限增殖的特性，同时保留淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。
通过筛选和克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
三、实验材料1. 试剂：聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、抗原、酶联免疫吸附剂（ELISA）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG抗体、包被液、脱脂奶粉、洗涤液、底物显色液、终止液等。
2. 仪器：倒置显微镜、细胞培养箱、超净工作台、冰箱、酶标仪、微量移液器、恒温箱、96孔板等。
3. 实验动物：小鼠。
四、实验步骤1. 细胞融合：将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞按照一定比例混合，加入PEG诱导细胞融合。
2. 细胞培养：将融合后的细胞接种于含有HAT培养基的培养瓶中，在细胞培养箱中培养。
3. 细胞筛选：经过1-2周的培养，筛选出能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：采用ELISA方法，将抗原固相在微孔板上，将杂交瘤细胞培养上清加入微孔板中，检测抗体与抗原的结合情况。
5. 克隆化：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，确保获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：利用间接ELISA方法，检测克隆化后的杂交瘤细胞是否产生特异性抗体。
五、实验结果1. 细胞融合：成功将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞融合。
2. 细胞培养：在HAT培养基中，杂交瘤细胞能够存活并无限增殖。
3. 细胞筛选：经过筛选，获得能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：ELISA结果显示，部分杂交瘤细胞能够产生特异性抗体。
5. 克隆化：对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：间接ELISA结果显示，克隆化后的杂交瘤细胞均能产生特异性抗体。
小鼠骨髓瘤细胞染色体标本的制备实验目的：实验原理：
2．试剂 0.1%秋水仙素溶液、Carnoy’s固定液 （甲醇：冰醋酸＝3：1）、0.075 mol / L KCI溶 液、Giemsa染液等。
3．材料：小鼠
方法与步骤：
1.取材前3～4 h，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动 物种类不同而异。秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断 在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。
2.腹腔内注射秋水仙素3～4小时后，断头处死小鼠。 3.取出小鼠的后肢骨，注意不要将股骨剪断，否则容易造
成骨髓细胞的流失。Fra bibliotek 4.滴加适量生理盐水进行冲洗，并仔细地将皮肤、肌肉等 组织清除干净。
5.加入适量低渗液，用剪刀将骨充分剪碎，并用吸管吹 打，使骨髓细胞全部释放出来。
6.用滤网将获得的液体过滤到离心管中，加低渗液至8ml 左右，室温下静置20～30分钟，进行低渗。低渗结束后， 加入1ml左右的Carnoy’s 固定液进行预固定，轻轻混匀 后，离心。
15分钟，弃去染液，水洗，镜检。
结果：
作业:
绘图表示动物染色体的典型形态。 说明在小鼠骨髓染色体的制备过程中的关键步
骤。
7. 1200转/分，离心5分钟，弃上清，加入固定液，混匀 后，室温放置30分钟，再次离心去上清，重复固定一次， 离心后，向沉淀中加入1ml预冷的固定液，将细胞重悬。
8.取洁净冰水中预冷的载玻片，稍作倾斜，用吸管吸取一 滴上述细胞悬浮液，于载玻片上方适当高度滴在载玻片 上；
9.滴片后，将片子晾干，滴加适量Giemsa染液染色10～
小鼠骨髓瘤细胞染色体标本的制备
实验目的：
掌握小鼠骨髓细胞染色体的原理和制备方法，识别小鼠染 色体的数目及特点。
淋巴细胞杂交瘤(hybridoma)单克隆抗体技术 2
淋巴细胞杂交瘤(hybridoma)单克隆抗体技术 2(三) 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653 等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超 10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用 8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于9 5％，也是决定细胞融合的关键。
(四) 免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞��浆母细胞。
一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。
一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。
二、细胞融合，选择杂交瘤(一) 细胞融合流程(1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
(2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
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实验一、骨髓瘤细胞的培养
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1∶2稀释传代，每2～3天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
二材料：
1.试剂：
（1）培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um滤膜），分装，4℃保存。
不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml,100×L.G.溶液1ml，双抗溶液1ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，HEPES溶液1ml。
不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml，NaHCO3 3.7g，100×L.G.溶液10ml，双抗溶液10ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。
完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml，灭活小牛血清15-20ml，用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后杂交瘤细胞培养。
（2）小牛血清灭活：从-20℃冰箱取出小牛血清，室温自然融化，56℃ 30min即可充分灭活，分装小瓶（5ml/瓶），-20℃冻存备用，尽量避免反复冻融。
（3）青、链霉素（双抗）溶液（100×）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。
2.器材：
超净工作台、CO2恒温培养箱、普通冰箱、电子天平，药物天平、巴氏吸管、10ml吸管、100ml细胞培养瓶、滴管、灭菌小瓶等
三方法：
细胞冻存及复苏
先用24孔细胞培养板扩大骨髓瘤细胞或单克隆抗体细胞株，当长满时，再扩大到100ml 细胞瓶。
当其处于对数生长期时，将细胞洗下，用细胞冻存液（含10﹪DMSO，40﹪FCS的DMEM培养基）将细胞悬浮，调配成1-3×106个/ml,每个细胞冻存管分装1ml，移至液氮罐口悬吊2小时或-70℃冰箱过夜，然后沉入液氮中。
复苏时，从液氮中取出冻存管后迅速置入40℃水浴中，在1min内融化，1500rpm离心5min，弃上清，用少量完全培养基轻轻悬浮细胞，移入24孔板中培养。
四、细胞培养应注意事项
1. 细胞培养瓶、吸管：使用前要严格消毒，对于新购置或已经使用的玻璃器皿，一般先用先用0.1%新洁而灭浸泡24小时，再用自来水清洗，晾干，然后放置酸缸浸泡24小时，带胶手套，捞起，用自来水将酸液冲洗干净（一般冲洗8-10次），用去离子水浸泡12小时，
再用超纯水浸泡12小时，捞起烘干，细胞瓶用锡铂纸包扎瓶口，吸管塞上绵花，装入吸管桶内，165.5℃干热灭菌2-3小时，待冷却后，转入消毒柜里备用。
2. 培养基：大多数实验室采用的基础培养基是DMEM或RPMI-1640，按厂家规定的方法配制一般不会出问题。
但是配制培养基的水的质量和血清添加成分是影响融合最重要的培养基素因各地水质差异很大，所以至少应用三蒸水或四蒸水，并定期检查制成的纯水质量。
国内实验室大多采用新生犊牛血清配制培养基，不同来源和不同批次的血清支持杂交瘤生长的差异很大，应筛选出好的血清供作配制融合后选择性培养的HAT培养基。
准备重组药物的实验：
1、配制AMP+ LB固体培养基600ml，倒AMP+ LB平皿20个
2、AMP+ LB液体培养基400ml
3、空的试管20支
4、1.5ml EP管1盒
将以上灭菌。
附：LB培养基配方：
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 10g/L
另外根据经验值用5mol/LNaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4。
LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。
LB固体培养基倒板
①配制：100ml LB培养基加入1.5g琼脂粉
②抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
③倒板：一般20ml倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
④保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
抗生素终浓度Amp 100ug/ml。