实验一、骨髓瘤细胞的培养
实验一、骨髓瘤细胞的培养
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1∶2稀释传代，每2～3天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
二材料：
1.试剂：
（1）培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um滤膜），分装，4℃保存。
不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml,100×L.G.溶液1ml，双抗溶液溶液1-2ml，HEPES溶液1ml。
1ml，7.5% NaHCO
3
3.7g，100×L.G.
不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml，NaHCO
3
溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤溶液10ml，双抗溶液10ml，7.5% NaHCO
3
除菌，分装4℃保存。
完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml，灭活小牛血清15-20ml，用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后杂交瘤细胞培养。
（2）小牛血清灭活：从-20℃冰箱取出小牛血清，室温自然融化，56℃ 30min即可充分灭活，分装小瓶（5ml/瓶），-20℃冻存备用，尽量避免反复冻融。
（3）青、链霉素（双抗）溶液（100×）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。
2.器材：
恒温培养箱、普通冰箱、电子天平，药物天平、巴氏吸管、10ml吸管、超净工作台、CO
2
100ml细胞培养瓶、滴管、灭菌小瓶等
三方法：
细胞冻存及复苏
先用24孔细胞培养板扩大骨髓瘤细胞或单克隆抗体细胞株，当长满时，再扩大到100ml 细胞瓶。当其处于对数生长期时，将细胞洗下，用细胞冻存液（含10﹪DMSO，40﹪FCS的DMEM培养基）将细胞悬浮，调配成1-3×106个/ml,每个细胞冻存管分装1ml，移至液氮罐口悬吊2小时或-70℃冰箱过夜，然后沉入液氮中。复苏时，从液氮中取出冻存管后迅速置入40℃水浴中，在1min内融化，1500rpm离心5min，弃上清，用少量完全培养基轻轻悬浮细胞，移入24孔板中培养。
四、细胞培养应注意事项
1. 细胞培养瓶、吸管：使用前要严格消毒，对于新购置或已经使用的玻璃器皿，一般先用先用0.1%新洁而灭浸泡24小时，再用自来水清洗，晾干，然后放置酸缸浸泡24小时，带胶手套，捞起，用自来水将酸液冲洗干净（一般冲洗8-10次），用去离子水浸泡12小时，
再用超纯水浸泡12小时，捞起烘干，细胞瓶用锡铂纸包扎瓶口，吸管塞上绵花，装入吸管桶内，165.5℃干热灭菌2-3小时，待冷却后，转入消毒柜里备用。
2. 培养基：大多数实验室采用的基础培养基是DMEM或RPMI-1640，按厂家规定的方法配制一般不会出问题。但是配制培养基的水的质量和血清添加成分是影响融合最重要的培养基素因各地水质差异很大，所以至少应用三蒸水或四蒸水，并定期检查制成的纯水质量。国内实验室大多采用新生犊牛血清配制培养基，不同来源和不同批次的血清支持杂交瘤生长的差异很大，应筛选出好的血清供作配制融合后选择性培养的HA T培养基。
准备重组药物的实验：
1、配制AMP+ LB固体培养基600ml，倒AMP+ LB平皿20个
2、AMP+ LB液体培养基400ml
3、空的试管20支
4、1.5ml EP管1盒
将以上灭菌。
附：LB培养基配方：
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Y east extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 10g/L
另外根据经验值用5mol/LNaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4。
LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。
LB固体培养基倒板
①配制：100ml LB培养基加入1.5g琼脂粉
②抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
③倒板：一般20ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
④保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
抗生素终浓度Amp 100ug/ml
杂交瘤细胞制备
杂交瘤细胞的制备 1. 骨髓瘤细胞的准备 选择生长状态良好的细胞，浑圆透亮，大小均一，边缘清晰，排列整齐，呈半致密分布。弃上清，以不完全培养基洗涤一次后，用10mL不完全培养基将骨髓瘤细胞（SP2/0）轻轻吹下。 2. 脾淋巴细胞的准备 a、取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血供分离阳性血清。 b、颈脱位将小鼠致死，用75%酒精消毒体表5min，随即放入超净台内小鼠解剖板上，左侧卧位，用7号针头固定四肢。 c、无菌打开腹腔取出脾脏，用基础培养基洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织。 d、随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM的平皿中。以弯头针头压住脾脏，用小针头在脾脏上插孔，并用镊子挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。 3. 饲养细胞的制备 取一只健康的ICR小鼠，摘眼球采血，颈脱臼处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用10mL注射器，12#针头，注射5-10mL HAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的容器中。 4. 细胞融合 a、将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50mL的带盖的离心管中，1000rpm离心10min，上清要充分吸净，以免影响PEG的作用。 b、将融合管置于手掌中，轻轻振荡底部，务使两种细胞充分混匀。 c、用1mL吸管将预热的PEG在45~60s内缓慢加到融合管中，边加边轻轻摇匀。 d、立即滴加37℃预热的DMEM，使PEG稀释而失去作用，具体加法是用吸管在第一分钟内加1mL预热的不完全培养基，第二分钟内加2mL，第三分钟加8mL （遵照先慢后快的原则），37℃静置10min，1000rpm离心10min，弃上清。 e、加入5mL的HAT培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞，最后补加HAT至50mL左右。 f、分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃，5%CO2培养箱内培养。 g、5d后用HAT培养基换出一半培养基。 h、观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行抗体检测。
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，
小鼠骨髓基质细胞使用说明
小鼠骨髓基质细胞 小鼠骨髓基质细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠骨髓基质细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠骨髓基质细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠骨髓基质细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠骨髓基质细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
杂交瘤细胞培养及其注意事项
杂交瘤细胞培养及其注意事项 单克隆抗体的应用是一项迅速发展的技术。本文阐述了单克隆抗体制备前杂交瘤细胞的培养条件和应用，包括细胞的培养、培养基的选择，融合时期的选择，从而指导和优化实验室中杂交瘤的培养，促进融合细胞的融合率和后继单克隆抗体筛选实验的顺利进行。 标签：杂交瘤；细胞培养；单克隆抗体 随着杂交瘤细胞株不断的建立和生产单克隆抗体的日益广泛应用，杂交瘤细胞的培养和优化不断得到改善，但是国内实验室设备和条件有限，多数的单克隆抗体的筛选还是应用基础的免疫抗原包被，结合Elisa方法联合有限稀释法来筛选单克隆抗体。为了获得特异性较强的杂交瘤细胞株，融合前后细胞的培养以及杂交瘤的培养和储存，仍是基础实验室中必须注意和重视的技术。 1杂交瘤的起源和生产 1.1杂交瘤所用的骨髓瘤细胞系1966年Petingel等在体外培养小鼠浆细胞成功。Milstein等1972年由P3中用20μg 8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）筛选出缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的新细胞系，称之为P3-X63-Ag8。由于X63本身分泌IgG1，形成的杂交瘤除分泌B细胞的特异性抗体外，同时分泌X63产生的抗体，因其抗体不纯，现多改用不分泌型骨髓瘤细胞系。国内现已引进NS-1，SP2/0，FO，X63-Ag8-653等小鼠骨髓瘤细胞系。最常使用的是SP2/0及NS-1[1]。 1.2人骨髓瘤细胞系为产生稳定的人免疫球蛋白的杂交瘤，需要人的缺某种酶的骨髓瘤细胞系。国外已筛选了一些人骨髓瘤细胞，但融合率不高，还没有推广使用。目前人一人杂交瘤技术仍存在着杂交瘤在不同培养基中的生长速度问题。细胞生长缓慢，抗体分泌力弱及效价较低，且难于克隆化等困难[2]，限制了人骨髓瘤细胞的应用。 1.3淋巴细胞和骨髓瘤细胞的关系B淋巴细胞容易与浆细胞瘤融合，而T细胞则需要同胸腺淋巴肉瘤融合（Kohler，et al. 1977；Schwaber，1977）。脾脏是大量T或B细胞的来源，与小鼠骨髓瘤细胞融合时，最常用的是小鼠的脾细胞。按照Burnet的细胞系选择学说，一个B淋巴细胞只能产生一种抗体，其”后代”也只能产生此种抗体，因为抗体是由DNA上的基因所决定，基因是可以遗传的。在正常情况下，小鼠脾中含有能产生各种不同抗体的B细胞，一只纯种小鼠体内可有（1～5）×107种不同的抗体，即有（1～5）×107种不同的B细胞。为了提高获得某种杂交瘤的机会，就需要设法增加小鼠体内分泌该种抗体的B细胞的数量。最常用的方法是用特定抗原多次免疫小鼠，使之产生特异性抗体。通过将免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合，然后经过多次筛选，从而得到特异性的杂交瘤细胞。这样所获得的特异性的杂交瘤细胞在既具有脾细胞分泌抗体的能力的同时，又具有小鼠骨髓瘤细胞永生的特性，从而可以无限制地提供
造血干细胞分离培养方法
一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。
杂交瘤细胞的培养,保存和复苏
杂交瘤细胞培养冻存与复苏 杂交瘤细胞适用于无血清的培养基，无血清培养的基础培养基和添加物质杂交瘤细胞的无血清培养基通常是在标准的基础培养基中添加小分子和大分子物质，以代替血清的各种功能。不同基础培养基对细胞的无血清培养有一定的影响。不同细胞系对基础培养基也有选择性。最常用的基础培养基有RPMI 1640，F12，IMDM，DMEM+F12,DMEM+F12+RPMI 1640。形成的无血清培养基常能支持杂交瘤细胞在分批培养中生长到1×106细胞/ml以上，最终的单抗浓度可达10 μg/ml~100 μg/ml。基本上你说的那两种都有可能，你可以参考以下操作： 【转贴】细胞融合和杂交瘤细胞培养用试剂的配制 ①RPMI-1640基础培养液，1 000ml RPMI-1640粉 10.4g 丙酮酸钠 0.11g 用900ml三蒸水(或无离子水再经过双蒸)，通CO2搅拌溶解。称取1.8g NaHCO3，用少量三蒸水溶解，边搅拌边加入1640液中。补足1 000ml，通过0.22μm滤膜正压过滤除菌(用CO2钢瓶加压)，分装，置30℃，菌检48小时4℃存放。效期不超过三个月。 ②RPMI-1640完全培养液，100ml 双抗(青、链霉素) 0.1ml 3％L-谷氨酰胺 2.5ml 犊牛血清 15.0ml 1640基础培养液 81.5ml 用时现配，4℃下存放不超过一周，用于细胞融合和克隆化培养的全培养液，可将小牛血清增至20％。 ③200mmol/L(3％)L-谷氨酰胺溶液 L-谷氨酰胺 5.846g 三蒸水 200ml 加热至50℃使全溶，0.22μm膜滤除菌，按每管4ml分装，-20℃保存。 ④双抗溶液 青霉素(钠盐) 100万iu 链霉素(硫酸盐) 1g 溶于100ml灭菌三蒸水中，小量分装，-20℃冻存。 杂交瘤细胞的保存 当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免
小鼠骨髓干细胞取样制备方法
小鼠骨髓干细胞取样制备方法 Mouse SP protocol 1.水浴设置在37度，并用温度计量确认温度。预热DMEM+，预冷HBSS+ 2.使用 5-8 周龄雄性小鼠，取大腿骨和胫腓骨处的骨髓悬浮于HBSS+、 1)杀死小鼠，背朝下躺着，用70% 酒精喷洒腹部灭菌、 2)臀部稍下方用齿状刀口的剪刀水平切开腹部皮肤、 3)从此刀口同时向上向下同时撕裂皮肤，用钳子钳住膝盖骨扯下所有腿部皮肤、 4)从膝盖处剪断，取下胫腓骨，尽可能将肌肉组织剔除干净，剪掉脚，将其放于陪替 氏培养皿，其中放有5 ml左右预冷的HBSS+，置于冰上、 5)剔除干净大腿骨上的肌肉类组织，在臀部处剪掉大腿骨，骨髓细胞主要在这里，所 以尽可能取得更多的大腿骨，骨上组织尽可能剔出的越干净越好，以免骨髓细胞粘 附上面、将其置于培养皿、 6)一个小鼠取得四段腿骨, 用钳子固定垂直培养皿方向固定腿骨，用27-G 10ml注射 器打入HBSS+、骨髓细胞会从另一端推出，尽可能取得更多细胞，腿骨上下颠倒再 推打, 骨髓取出后腿骨会变白的、 7)用 18-G 针头反复推吸4-5次培养皿里的细胞，以打散团块细胞、但尽量不要打入 气体，因为气泡容易导致细胞死亡、将细胞转移到50ml的PP离心管里，同时用 70um的滤网过滤去处碎骨或团块, 计数有核细胞、 3.精确计数有核细胞、（平均5 x 107 有核细胞/6周龄的C57Bl/6 小鼠）、 4. 5 min 500g 4°C离心，弃上清，加溶血素裂解红细胞： 注：当红细胞较多时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：8室温静置10min 当红细胞较少时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：4室温静置5min 红细胞裂解液为10×，临用前用DDW稀释成1× 5.用HBSS+（2%FBS）洗细胞（5 min 500g 4°C离心） 6.用预热的DMEM(2%FBS)调整细胞浓度为106/ml 7.分两管，其中一管加入verapamil，verapamil的终浓度为100 μM，封口膜封好37度水 浴10min后，和另一管同时加入Hoechst 33342染色，终浓度5ug/ml ，37度水浴90min，
【CN110423276A】一株杂交瘤细胞制备及其应用【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910167483.7 (22)申请日 2019.03.06 (83)生物保藏信息 CCTCC NO：C201929 2019.03.05 (71)申请人 思格（苏州）生物科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市工业园区金鸡 湖大道99号苏州纳米城西北区20幢 403-17 (72)发明人 任宝永 沈飞 (74)专利代理机构 苏州翔远专利代理事务所 (普通合伙) 32251 代理人 王鑫 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C12N 5/20(2006.01) G01N 33/68(2006.01)G01N 33/577(2006.01) (54)发明名称 一株杂交瘤细胞制备及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种分泌抗人PD -1分子单克隆 抗体杂交瘤细胞的制备方法，以及根据该方法获 得的杂交瘤细胞株、抗体及其应用。本发明所述 单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CCTCC NO： C201929。所述方法包括小鼠免疫、细胞融合与、 抗人PD -1抗体检测、杂交瘤细胞克隆。本发明的 分泌高效价抗人PD -1分子单克隆抗体的杂交瘤 细胞株能够持续性地产生抗人PD -1分子单克隆 抗体，为检测癌症病人PD -1分子表达提供了抗体 源。权利要求书1页 说明书5页序列表2页 附图4页CN 110423276 A 2019.11.08 C N 110423276 A
权 利 要 求 书1/1页CN 110423276 A 1.鼠抗人PD-1单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C201929。 2.鼠抗人PD-1单克隆抗体，其特征在于该抗体由保藏编号为CCTCC NO：C201929的杂交瘤细胞分泌产生。 3.保藏编号为CCTCC NO：C201929的杂交瘤细胞分泌产生的抗PD-1 单克隆抗体在流式免疫荧光检测细胞表面PD-1抗原表达中的应用。 2
大鼠的骨髓间充质干细胞提取
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
实验设计-骨髓基质细胞系的建立
小鼠骨髓细胞群细胞系的建立 一、实验目的： 1) 通过培养小鼠骨髓基质细胞，建立小鼠骨髓基质细胞系 2) 了解细胞培养的一般步骤和注意事项，培养无菌操作意识 二、实验原理： 细胞培养：多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞。移植到体外后，只要条件适合，依然保持着分裂增殖的能力。利用这个原理,将小鼠骨髓基质细胞移植到体外培养。通过一定的纯化方法，从原代细胞得到传代细胞，经过若干代中，部分细胞发生遗传物质的变化成为无限传代的性质，分离得到细胞系。 培养细胞纯化：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞先脱壁，利用此道理，采用多次差别消化法将上皮细胞核成纤维细胞分离而达到纯化的目的 三、材料：实验小白鼠 四、药剂及配制：
五、仪器器材： （1）培养皿×3、500ml烧杯×1、棉花、医用解剖器材（剪刀、镊子、解剖刀）、10ml注射器、4号针头、离心管若干、三角瓶若干、25ml卡式瓶若干、滴管、精密pH试纸、0.22μm微孔滤膜、血球细胞计数板、标签纸、油性笔、冻存管（2）超净工作台、CO2培养箱、高速离心机、高压灭菌锅、显微镜、水浴锅、-86℃冰箱
2、无菌工作室及其内物品的消毒灭菌（1）超净工作台 检查超净工作台是否正常；用之前用沾了75%酒精的脱脂棉擦拭，再开30min的紫外照射（2）小件物品 用牛皮纸（报纸）将小件物品(如镊子、解剖刀等)包裹好放进饭盒里，放进灭菌锅，其他物品也一并放入蒸汽灭菌锅内，95KPa、121℃下灭菌30min （3）其他仪器灭菌 3、试剂配制（如上表） 4、器材准备 5、注意： 1) 使用高压灭菌锅时注意正确使用方法，以免引起危险 2) 超净工作室和工作台必须清理干净，以免引起细胞污染 浸泡 ?用5%的盐酸溶液浸泡过夜 刷洗 ?用足量的洗衣粉反复刷洗,将瓶壁上的残渍洗干净 浸酸 ?将干燥后的器皿用重络酸钾溶液(重络酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水 1L)浸泡过夜 冲洗 ?将浸酸后的玻璃器皿用自来水冲洗,然后用蒸馏水,最后干燥、待用 第二部分原代培养 器材：解剖刀、剪刀、镊子、平皿、注射器、离心机、血球计数板、15ml离心管×4、培养瓶×2，冰块 试剂：乙醚、D-Hank’s溶液、生理盐水仪器：超净工作台、离心机、显微镜步骤： 1.取样 1) 超净工作台上的物品：灭菌后的解剖刀、剪刀、镊子、注射器、平皿、冰块 2) 将小鼠用乙醚麻醉后引颈处死（用培养皿盛），在盛有75%酒精的烧杯中浸 泡5min。在超净工作台上分离双侧股骨（培养皿下置冰块），在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织（皿下置冰块）。 3) 剪去骺端。用10mL注射器抽取食量D-Hank’s液冲洗骨髓腔，将骨髓冲入 培养瓶。
第十二章造血干细胞及免疫细胞的生成
第十二章造血干细胞及免疫细胞的生成 免疫细胞都属于血细胞，所有血细胞都来源于造血干细胞。因此在一定意义 上讲，免疫细胞的发育分化就是造血干细胞分化成熟的过程。 第一节 造血干细胞的特性和分化 一、造血干细胞的起源和表面标记 （一）造血干细胞的起源 哺乳动物的造血最早发生在卵黄囊，随后转移到胎肝，胚胎发育中期以后以 及出生后，骨髓成为主要的造血场所，并为B细胞发育的中枢免疫器官；胸腺 是T淋巴细胞的分化成熟的中枢免疫器官。 早期的造血干细胞是多能造血干细胞（pluripotent hematopoietic stem cell）， 具有自我更新（self?renewing）和分化（differentiation）两种重要的潜能，赋予 机体在整个生命过程中始终保持造血能力。多能造血干细胞最初分化为共同淋巴 样祖细胞和共同髓样祖细胞等等。 （二）造血干细胞的表面标记 白细胞分化抗原和单克隆抗体技术的应用，为造血干细胞表面标记的研究及其分离纯化提供了重要的理论和实验依据。人造血干细胞的主要表面标记为CD34和c-kit （CD117），不表达谱系（lineage）特异性标记。 （1）CD34：CD34是一种高度糖基化跨膜蛋白，有1%~4%骨髓细胞表达 CD34，其中包括了造血干细胞，是造血干细胞的一种重要标记，应用CD34单 克隆抗体可从骨髓、胎肝或脐血中分离、富集造血干细胞。随着造血干细胞的分 化成熟，CD34表达水平逐渐下降，成熟血细胞不表达CD34。 （2）CD117：CD117是干细胞因子（stem cell factor，SCF）的受体，是原 癌基因c?kit的编码产物Kit。CD117是属于含有酪氨酸激酶结构的生长因子受体，胞膜外区结构属IgSF。CD117+细胞约占骨髓细胞的1%~4%，50%~70% CD117+骨髓细胞表达CD34，因此，CD117也是多能造血干细胞的重要标记。 （3）Lin－细胞：应用针对T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细 胞、巨核细胞、髓系以及红系等多种谱系相应单克隆抗体的混合抗体（CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A等抗体）结合免
实验一、骨髓瘤细胞的培养
实验一、骨髓瘤细胞的培养 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同 一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653 等。 骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640, DMEM培养基。小牛血清的浓度 一般在10?20%,细胞的最大密度不得超106/ ml, 一般扩大培养以1 : 2稀释传代，每2? 3天传代一次。细胞的倍增时间为16?20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴 壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。 二材料： 1. 试剂： （ 1 ）培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640 或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um滤膜），分装，4 C保存。 不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml,100 X L.G.溶液1ml，双抗溶液1ml, 7.5% NaHCO溶液1-2ml , HEPES溶夜1ml。 不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml, NaHCO3.7g , 100X L.G. 溶液10ml，双抗溶液10ml , 7.5% NaHCO溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4C保存。 完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml，灭活小牛血清15-20ml ,用于骨髓瘤细胞SP2/0 和建株后杂交瘤细胞培养。 （2）小牛血清灭活：从-20 C冰箱取出小牛血清，室温自然融化，56C 30min即可充分灭活，分装小瓶（5ml/瓶）,-20 C冻存备用，尽量避免反复冻融。 （3）青、链霉素（双抗）溶液（100X ）取青霉素G （钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20 C 冻存。 2. 器材： 超净工作台、CQ恒温培养箱、普通冰箱、电子天平，药物天平、巴氏吸管、10ml吸管、100ml 细胞培养瓶、滴管、灭菌小瓶等 三方法： 细胞冻存及复苏 先用24 孔细胞培养板扩大骨髓瘤细胞或单克隆抗体细胞株, 当长满时, 再扩大到100ml 细胞瓶。当其处于对数生长期时，将细胞洗下，用细胞冻存液（含10% DMS0 40% FCS的DMEM培养基）将细胞悬浮，调配成1-3 X 106个/ml,每个细胞冻存管分装1ml，移至液氮罐口悬吊2小时或-70 C冰箱过夜，然后沉入液氮中。复苏时，从液氮中取出冻存管后迅速置入40C水浴中，在1min内融化，1500rpm离心5min,弃上清，用少量完全培养基轻轻悬浮细胞,移入24 孔板中培养。 四、细胞培养应注意事项 1. 细胞培养瓶、吸管：使用前要严格消毒,对于新购置或已经使用的玻璃器皿,一般先用先用0.1%
动物骨髓干细胞细胞分离液试验方法
动物骨髓干细胞细胞分离液试验方法 货号：P8600 规格：200mL 保存：常温保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 产品内容： 名称规格 动物骨髓干细胞分离液200mL 匀浆冲洗液200mL 样本稀释液200mL 清洗液200mL 洗涤液200mL 无菌硅化离心管5支 实验前准备： 1、适用仪器 最大离心力可达1200g的水平转子离心机 骨髓单细胞悬液的制备： 1.以适当方式处死动物，剥离出股骨或胫骨，用剪刀剪断骨头两端，露出内腔。 2.用注射器吸取适量（根据动物大小）的匀浆冲洗液冲洗出内腔中的骨髓。 3.收集悬液到合适离心管中，反复吹打成单细胞悬液，以70μm细胞筛网（随试剂盒附赠5个）过滤。 4.450g，离心10min，弃上清。 5.用样本稀释液重悬细胞浓度为2×108-1×109/ml的单细胞悬液备用（以小鼠为例，一般使用1ml样本稀释液重悬骨髓细胞）。 检验方法： 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。 1.取一支离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于3ml）。
2.用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min。（注：根据骨髓单细胞悬液量确定离心条件，骨髓单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。 3.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色目的细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 4.用吸管小心吸取第二层环状乳白色目的细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入5-10ml洗涤液，混匀细胞。 5.400g，离心10min。 6.弃上清。 7.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。 8.250g，离心10min。 9.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 差异贴壁法纯化细胞： （1）用干细胞无血清培养基或干细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。 （2）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。 （3）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。 （4）不贴壁的为淋巴细胞。
_骨髓间充质干细胞在骨科中的应用
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
多发性骨髓瘤常见分子细胞遗传学异常及其意义
多发性骨髓瘤常见分子细胞遗传学异常及其意义多发性骨髓瘤是一种常见的浆细胞恶性肿瘤，重要的染色体与基因异常导 致疾病的进展，在多发性骨髓瘤中具有独立的预后判断价值。随着检测方法的更新及技术的进步，异常染色体与基因的检出率越来越高，主要包括13号染色体全部或部分缺失伴或不伴14q32/IGH的重排等染色体异常。异常染色体与基因的检测具有重要价值，可完善MM预后评估体系，指导临床个体化治疗并为新药开发提供新的靶点。 标签：多发性骨髓瘤；分子细胞遗传学；预后 1染色体数目异常 1.1超二倍体 MM患者超二倍体主要表现为1、3、7、9、11、13、15、17、18、19、21、22三体型[1]；另外，近年来国内也有人发现MM患者8号染色体三体，王晓炜等[2]应用荧光免疫表型和间期细胞遗传学（FICTION）技术对MM骨髓涂片进行8号染色体检测，9例MM患者中，发现8号染色体三体1例，这可能与应用FICTION技术提高了检测效率有一定关系。 1.2亚二倍体 MM患者亚二倍体主要表现为6、8、13、14、X、Y单体型为特征；其中13号染色体单体缺失及其部分缺失是目前研究较为广泛的染色体异常之一。 2染色体结构异常 2.113号染色体异常 13 号染色体部分或完全缺失是MM 最早发现的染色体异常，MM 中较常见，而且是MM预后及生存期预测的指标之一。13号染色体异常，特别是13单体（-13）和13号染色体长臂部分缺失（13q-）与MM预后的关系越来越受到重视。目前认为13号染色体上存在MM 抑癌基因，其缺失与疾病危重、疗效和预后密切相关。Pérez-Simón等[3]采用荧光原位杂交（FISH）方法分析了15 种不同染色体异常在常规剂量化疗患者中的预后价值，发现13号染色体缺失是最重要的预示生存期短的预后指标，但对治疗反应无影响。由于13q-的断裂点范围在13q11~13q14，RB1基因正好也于这个区域，因此有人推测13号染色体完全或部分缺失所致MM预后不良可能与RB1基因改变有关。 Chiecchio等[4]通过FISH技术对400例新发MM患者染色体检测发现，至少有一种染色体数目或结构异常者达99%，其中13号染色体缺失：单体缺失及部分缺失约占47%。Fonseca等[5]采用cig-FISH 技术在54%的MM患者中检测
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体 来源：https://www.360docs.net/doc/0e18873623.html, 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体制备的一般流程如下:
单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后
佛教慈济骨髓干细胞中心
壹、計畫說明 長期以來造血幹細胞捐贈的傳統觀念中，認為骨髓捐贈是「抽龍骨水」，以至於願意捐贈造血幹細胞的民眾並不多，然而，骨髓捐贈並非抽龍骨水，而現在更有一種新的捐贈方式－週邊血幹細胞捐贈，是多數民眾所不知。台灣每年仍有約300位血癌患者需要尋找非親屬捐贈者，在血液病患日漸增加的情況下，我們更需要持續不斷推廣捐贈造血幹細胞的正確認知，讓民眾在正確的認知下，重新思考捐贈造血幹細胞的意義。 為推動造血幹細胞捐贈，希望透過宣導進而達到提升捐贈率的效果，並藉此將辦理「因為有愛-微電影創意影片」之徵選活動，向民眾徵求創意，吸引更多人加入捐贈行列。 貳、報名資格 一、一般民眾、不限年齡。(歡迎學校及社團踴躍參加) 二、個人或組隊報名均可，一組最多五人。 三、為符合公平原則，已獲得國內外獎項之作品，均不得參賽，違者取消參賽 資格。 四、不拘任何表現方式，發揮創意用5分鐘以內影片投稿參賽。 五、參賽作品不得使用非法取得下載之音樂、影像或影片片段。參賽者若有抵 觸任何著作權之法律，一切法律責任由參賽者承擔。 六、參賽者之作品如涉及智慧財產權者，主辦機關取得全部權利。 七、本活動之參賽作品，無論入選與否，一經送件即視為同意本活動評審所有 規則，並同意授權主辦單位得自行運用相關業務範圍內，對所有參賽作品 之公開發表、公開展示、公開播放、影像及圖文宣導、攝影、重製、改作、 編輯、印製、散布、出版、網頁製作、下載傳輸等相關非商業行為之用途， 日後不得有異議。且不另支付稿費及版稅，參賽者無異議亦不另行索取費 用。
參、徵件期間： 一、報名收件日期：即日起至6月30日止。以郵戳為憑，逾期恕不受理。 二、初審結果公佈：102年7月15日(一) 三、網路投票期間：102年8月1日～8月31日 請上「骨髓幹細胞中心Facebook粉絲團」投票 四、決審：102年9月 五、公布優勝結果：102年9月 六、頒獎典禮：102年本中心週年慶活動(預計9月) 七、成績公佈：公布於活動網站及慈濟骨髓幹細胞中心網站 肆、創作主題 須與造血幹細胞捐贈方式緊密連結，且畫面上需呈現自行設計的標語。 伍、作品規格： 一、類型：不限(劇情片、紀錄片、動畫短片皆可) 二、相關規格： 1.片長：嚴格規範5分鐘以內(包含片頭與片尾) 2.拍攝工具：不限 3.影片格式：像素至少720(W)x480(H)的avi/mov/mpg格式。 4.輸出格式：mpeg格式 5.參賽影片畫面大小至少720x480，最大不得超過1,920x1,080。 6.請將原始影片格式及輸出之mpeg格式，以數位檔案存於隨身碟中或以 CD/DVD-R片燒錄轉檔成之作品繳交。 7.提交作品不予退還，未符合作品競賽規格者不另行通知與退件。