京尼平苷对INS-1细胞增殖与凋亡的影响

京尼平苷对INS-1细胞增殖与凋亡的影响
白涛;任乐乐;刘萌萌;高璟英;郭阳艳;任毅;刘云峰;章毅
【摘要】目的观察京尼平苷对大鼠胰岛β细胞系(INS-1)增殖及凋亡的影响.方法用CCK-8法测定细胞增殖,用毒胡萝卜素处理细胞后,用流式细胞仪测定细胞凋亡率,并用CCK-8法测定细胞活力.结果京尼平苷同胰高血糖素样肽1(GLP-1)一样能促进INS-1的增殖,并有浓度依赖性;京尼平苷同GLP-1一样能抑制毒胡萝卜素处理后的细胞凋亡,并有浓度依赖性;同时京尼平苷能抑制毒胡萝卜素对细胞的毒性作用.结论京尼平苷能促进INS-1细胞增殖,抑制INS-1细胞凋亡.
【期刊名称】《中西医结合心脑血管病杂志》
【年(卷),期】2018(016)021
【总页数】4页(P3110-3113)
【关键词】京尼平苷;胰高血糖素样肽1;胰岛β细胞系;毒胡萝卜素
【作者】白涛;任乐乐;刘萌萌;高璟英;郭阳艳;任毅;刘云峰;章毅
【作者单位】山西医科大学太原030001;山西医科大学第一医院;山西医科大学太原030001;山西医科大学太原030001;山西医科大学太原030001;山西医科大学太原030001;山西医科大学第一医院;山西医科大学第一医院;山西医科大学第一医院;山西医科大学太原030001
【正文语种】中文
【中图分类】R329
2型糖尿病是以慢性高血糖为主要特征的一种代谢性疾病，病理特征为胰岛素调控葡萄糖代谢能力的下降及胰岛β细胞功能缺陷所导致的胰岛素分泌减少[1]。

越来
越多的动物实验和临床研究证实2型糖尿病存在胰腺β细胞数量减少[2]。

尸检结
果表明，糖尿病病人较正常人，胰腺β细胞凋亡增加进而体积减小[3]。

因此，促
进β细胞增殖且抑制其凋亡是2型糖尿病治疗的重要方面。

京尼平苷(geniposide，GP)是中药栀子的有效成分，是一种新的胰高血糖素样肽
1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受体激动剂[4]。

研究认为GLP-1受体激动
剂能促进胰岛β细胞的增殖并抑制其凋亡[5- 6]。

本实验用内质网应激诱导剂毒胡萝卜素[7](thapsigargin，Thap)处理大鼠胰岛β细胞系(INS-1)，观察京尼平苷对INS-1细胞增殖及凋亡的作用。

1 材料与方法
1.1 材料大鼠INS-1购自国家实验细胞资源共享服务平台(北京总部)；京尼平苷购自日本Wako公司；GLP-1购自英国TOCRIS公司；毒胡萝卜素购自Sigma公司；CCK-8、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自日本东仁公司；胎牛血清购自BI公司；磷酸缓冲盐溶液(PBS)、胰蛋白酶、RPMI 1640培养基购自生工生物公司；细胞培养瓶、培养板购自美国Corning公司。

1.2 仪器电子天平购自赛多利斯科学仪器有限公司；倒置显微镜购自奥林巴斯公司；二氧化碳(CO2)细胞培养箱购自上海力申科学仪器有限公司；流式细胞仪购自美国BD公司；酶标仪购自美国BIoTek公司；超净工作台购自上海智城分析仪器有限公司。

1.3 INS-1细胞的培养 INS-1细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素、50 μmol/L β-巯基乙醇的RPMI 1640培养液，置5% CO237 ℃的细胞培养箱中培养。

当细
胞融合至70%～80%，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.4 CCK-8法测定细胞增殖将INS-1细胞按1×104密度接种至96孔板，过夜后，用对照组、京尼平苷组、GLP-1组方法处理细胞24 h，弃培养液，按10∶1比例将培养液与CCK-8混匀，加入96孔板，孵育2 h，用酶标仪在450 nm下测吸
光度(OD值)。

1.5 流式细胞仪测定细胞凋亡 INS-1细胞以1×106接种于6孔板，过夜后，按对照组、毒胡萝卜素组、毒胡萝卜素+京尼平苷组、毒胡萝卜素+GLP-1组处理细胞
6 h。

弃培养液，PBS洗1次，加0.25%的胰酶消化5 min，培养液终止消化。

将细胞悬液收集到离心管中，1 000 r/min离心3 min。

弃上清，加入预冷的PBS
重悬，用300目滤网过滤，再次离心，弃上清，加入1×Annexin V binding buffer调整细胞量，加入Annexin V-FITC、PI Solution各5 μL，混匀，室温避
光15 min，流式细胞仪检测。

1.6 CCK-8法测定细胞活力将INS-1细胞按1×104密度接种至96孔板，过夜后，按对照组、毒胡萝卜素组、毒胡萝卜素+京尼平苷组、毒胡萝卜素+GLP-1组方法处理细胞6 h。

弃培养液，加入 CCK-8与培养液的混合液，孵育2 h，用酶标仪
在450 nm下测吸光度(OD值)，并计算细胞存活率：存活率(%)=(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)×100%。

1.7 统计学处理采用SigmaPlot 1
2.5进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果
2.1 京尼平苷对INS-1细胞增殖的影响用不同浓度的京尼平苷(1 μmol/L～100
μmol/L)和GLP-1(10 nmol/L)干预大鼠INS-1 24 h，发现京尼平苷同GLP-1一样，均能促进INS-1细胞的增殖，并有浓度依赖性。

详见图1。

与Control比较，*P<0.01
图1 京尼平苷对INS-1细胞增殖的影响
2.2 京尼平苷对Thap致INS-1细胞凋亡的保护作用用毒胡萝卜素(1 μmol/L)处
理INS-1细胞6 h，发现毒胡萝卜素组细胞早期凋亡率增加，毒胡萝卜素+京尼平苷(1 μmol/L～100 μmol/L)组或GLP-1(10 nmol/L)组早期凋亡率减少，提示京
尼平苷或GLP-1均能减轻毒胡萝卜素导致的细胞凋亡，且京尼平苷的抗凋亡作用
具有浓度依赖性。

详见图 2、图3。

图2 各组细胞凋亡流式图
与control比较，*P<0.01；与Thap比较，#P<0.01
图3 各组细胞凋亡率
2.3 京尼平苷对 Thap致INS-1细胞毒性的影响用毒胡萝卜素(1 μmol/L)处理
INS-1细胞6 h，同时用京尼平苷(10 μmol/L)及GLP-1(10 nmol/L)干预，可见毒胡萝卜素组细胞活力下降，数量减少，而京尼平苷及GLP-1可减弱毒胡萝卜素对
细胞的毒性作用。

详见图 4。

与Control比较，*P<0.01；与Thap比较，#P<0.01
图4 京尼平苷对 Thap致INS-1细胞毒性的影响
3 讨论
糖尿病是一种慢性终身性疾病，需要长期药物治疗。

随着糖尿病病程的延长，疾病的进展，胰岛素治疗成为很多病人不可避免的治疗方式。

胰岛素降糖效果明确，但注射疼痛、低血糖频发、体重增加等副作用，以及由此带来的严重心理负担时刻困扰着病人。

GLP-1受体激动剂的出现在一定程度上解决了上述难题。

GLP-1受体
激动剂是葡萄糖浓度依赖性的胰岛素促泌剂，具有注射次数少、低血糖发生概率小、可降低体重等优点，逐渐成为糖尿病治疗的新方向。

中药栀子的主要活性成分京尼
平苷是一种新型的GLP-1受体激动剂。

多项研究均证实，京尼平苷具有葡萄糖依
赖性的促胰岛素分泌作用[4，8]，且无须注射，可经胃肠道给药[9-10]，因此关于京尼平苷的研究越来越受到科研人员的重视。

人体血糖的平稳与胰岛β细胞的数量密切相关[11]。

β细胞的增殖、再生与死亡、清除一起维持着体内胰岛β细胞数量的动态平衡。

因此，促进胰岛β细胞增殖，
抑制其凋亡是糖尿病治疗的重要途径。

研究表明，GLP-1受体激动剂能促进胰岛β细胞增殖并抑制其凋亡。

本实验用京尼平苷干预大鼠INS-1，并用GLP-1作为阳
性对照，观察京尼平苷对INS-1细胞增殖和凋亡的作用。

实验结果表明，京尼平
苷可浓度依赖性地促进INS-1细胞的增殖，但促增殖能力低于GLP-1。

毒胡萝卜
素是内质网Ca2+-ATP酶选择性抑制剂，可以不可逆地使内质网钙池排空，使胞
质内Ca2+浓度持续升高，诱导细胞发生内质网应激反应并最终发生凋亡[12]。

本实验用毒胡萝卜素处理INS-1细胞，诱导细胞凋亡，同时用京尼平苷或GLP-1共孵育，结果发现，毒胡萝卜素处理后，INS-1细胞发生了明显的凋亡，早期凋亡率达到(15.72±0.57)%。

而用京尼平苷干预后，细胞早期凋亡率明显下降，最低达(5.11±0.25)%，并呈浓度依赖性，且抑制凋亡的作用强于阳性药物GLP-1[早期凋亡率(9.23±0.35)%]。

同时，用CCK-8法测定了毒胡萝卜素处理后的细胞活力，
发现京尼平苷同GLP-1一样，能减轻毒胡萝卜素对INS-1细胞的毒性作用，增加细胞活力。

上述实验结果表明，京尼平苷能够促进INS-1细胞增殖并抑制其凋亡，同既往文献报道[9，13]是一致的，说明京尼平苷可通过促进胰岛β细胞数量的增加，抑制β细胞数量减少，从而维持体内一定的胰岛素分泌量来保持血糖稳定，
起到降糖的作用。

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