代谢组学技术及其在中西医结合研究中的应用展望

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30600794,90409001);上海市和中国博士后基金资助项目(No.20060390147)
Correspondence :Prof.Zi 2yin SH EN ;Tel :02126248999926311;E 2mail :ziyinshen @126.
com
代谢组学技术及其在中西医结合研究中的应用展望
吴斌1,严诗楷2,沈自尹1,张卫东2,3
1.复旦大学华山医院中西医结合研究所,上海200040
2.上海交通大学药学院天然药物化学教研室,上海200240
3.第二军医大学药学院天然药物化学教研室,上海200433
关键词:代谢组学;中西医结合;医学;综述
中图分类号:R22031;文献标识码:A ;文章编号:167221977(2007)0420475206
Me t a b o n o mic t ec h ni q ue a n d p ros p ec t of i t s ap p lica t i on i n i nt e gra t e d t ra di t i o nal Chi nes e a n d Wes t e rn m e dici ne res earc h
Bin WU 1
,Shi 2kai Y AN 2
,Zi 2yin S HEN 1
,Wei 2dong ZHANG
2,3
1.Institute of Chinese Integrative Medicine ,Huashan Hospital ,Fudan University ,Shanghai 200040,China
2.Department of Natural Medicinal Chemistry ,School of Pharmacy ,Shanghai Jiao Tong University ,Shanghai 200030,China
3.Department of Natural Medicinal Chemistry ,School of Pharmacy ,Second Military Medical University ,Shanghai 200433China
K eyw ords :meta bonomics ;inte grate d tra ditional Chines e me dicine and Western me dicine ;me dicine ;review
Wu B ,Yan SK ,Shen ZY ,Zhang WD.J Chin I nteg r Med /Zhong X i Yi J ie He X ue B ao.2007;5(4):4752480.Received November 7,2006;published online J uly 15,2007.Free f ull text (PDF )is available at
代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一种研究生物系统的组学方法。

它是英国Nicholson 教授及其同事于1999年正式提出的[1]。

代谢组指的是“一个细胞、组织或器官中,所有代谢组分的集合,尤其指小分子物质”,而代谢组学则是一门“在新陈代谢的动态过程中,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质”的科学[2],它所关注的是相对分子质量为1000以下的小分子。

近年来代谢组研究已引起众多研究者的注意,代谢组学与基因组学和蛋白质组学不同,基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生什么,而代谢组学则告诉你已经发生了什么;还有研究者认为代谢组学是“组学”研究的终端[3]。

为更好地将代谢组技术应用于中西医结合研究中,本文根据近年来国外的相关资料,对代谢组学的实验技术、分析技术及其在现代医学中的应用现状进行了综述,同时对代谢组学在中西医结合研究中的发展趋势进行了展望。

1　代谢组学的实验技术
1.1　代谢组学研究的常用技术　代谢组学研究常用核磁共振(nuclear magnetic resonance ,NMR )和
质谱联用技术,比如气相色谱2质谱联用仪(gas chromatograp hy 2mass spect rometer ,GC 2MS )和液相色谱2质谱联用仪(liquid chromatograp hy 2mass spect rometer ,L C 2MS )等[4]。

核磁共振光谱分析法是目前代谢组学研究应用最广泛的方法,NMR 的优势在于对样品无破坏性,样品处理简单,无需分离过程;缺点是灵敏度低,很难同时测定生物体系中共存的浓度相差较大的代谢产物,所需硬件的投资也较大。

目前常用的是1D 2NMR ,比如Brindle 等[5]应用NMR 研究高血压患者血清的代谢谱特征;Lehnhardt 等[6]应用NMR 研究原发性和继发性脑
肿瘤的代谢谱差异等。

1
D 2NMR 光谱的信息量大,但不可避免地存在峰图的重叠,影响了随后的分析,
而2D2NMR大大地改善了1D2NMR峰图的质量[7],一些研究者开始应用2D2NMR开展代谢组研究,如Choi等[8]为了研究被烟草花叶病毒感染烟草的代谢谱变化,应用2D2NMR方法,结果发现52绿原酸等代谢物明显增多。

气相色谱2质谱联用是当前最为活跃的联用技术,一般供试物经GC分离为单一组分,按其不同保留时间,与载气同时流出色谱柱,再经接口,进入质谱仪,然后可通过EI或其他方法产生一定的MS图谱。

GC2MS有很好的分离效率,可由计算机对MS 图谱进行化合物数据库的自动检索核对,有利于迅速鉴识样品。

缺点是需要对样品进行衍生化预处理,这一步骤额外费时,甚至引起样品的变化;衍生化预处理限制了GC2MS的应用范围,无法分析热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。

如A 等[9]针对GC2MS的代谢组研究,应用多元统计方法对人血浆的提取和衍生化预处理方法进行了研究。

液相色谱2质谱联用主要是高效液相色谱质谱(high performance liquid chromatograp hy2mass spect romet ry,HPL C2MS)联用,H PL C2MS进样前不需进行衍生化处理,适合那些不稳定、不易衍生化、不易挥发和分子量较大的化合物。

缺点是分离效率不高,分析的时间相对较长;没有化合物数据库可供检索和比对,样品的鉴别还需进一步的分析[10]。

如Yang等[11]使用L C2MS方法结合主成分分析(principle co mponent analysis,PCA)方法,比较肝炎、肝硬化与肝癌病人的尿液代谢谱的差异,结果发现一组尿代谢物与肝癌的相关性优于传统单一的甲胎蛋白。

无论NMR、色谱和质谱都有各自的优缺点,为了充分发挥各种技术的优势,有研究者将三种技术联合应用于代谢组的研究。

如Lenz等[12]应用1H2 NMR和HPL C2TO F2MS2MS技术相结合研究庆大霉素的肾毒性尿液的内源性的代谢物变化,结果发现葡萄糖增加,三甲胺N2氧化物(t rimet hylamine n2oxide,TMAO)降低等变化特点。

1.2　代谢组学研究的新技术　微量样本是研究中经常面对的难题,而毛细管电泳2质谱(capillary electrop horesis2mass spect romet ry,CE2MS)所需样品量少,已广泛地应用于代谢组的研究中,如Sato 等[13]选择了CE2MS进行了水稻叶的代谢物检测,成功地检测了88种代谢物,这些代谢物涉及到醣酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、光呼吸作用和氨基酸的生物合成等。

近年来为了监测活体动物特定组织区域内代谢物的动态变化,研究者将微透析(microdialysis)技术引入了代谢组的研究,如Price 等[14]应用微透析结合NMR比较了SD大鼠各组织在局部缺血状态下的代谢情况。

作者提出微量渗析技术和NMR相结合是代谢组研究的强有力工具。

可见代谢组同其他实验技术一样,有一个不断完善的过程,一些研究者正致力于代谢组实验技术的研究。

1.3　代谢组的研究材料　代谢组研究的样本包括生物液体和组织,由于血浆和尿液收集简单、易于长期检测和包含大量的代谢信息,已经成为代谢组研究常用的标本;唾液也逐渐成为代谢组研究的另一种生物液体样本,如Ramadan等[15]选择了150个健康男性和女性,取唾液、血浆和尿液,应用1H2NMR研究不同性别之间的代谢物差异等。

此外还有应用脑脊液进行代谢组研究的报道,如Coen 等[16]应用NMR研究细菌、真菌、病毒性脑膜炎脑脊液的代谢组变化,进行脑膜炎的代谢组临床诊断的探索研究。

血浆或尿液代谢物为全身各细胞、组织、器官代谢的分泌物,但是血浆或尿液只能代表生物体的平均代谢状态或代谢组“整体模式”,不能获得具体组织的代谢状态。

组织代谢研究提供了局部的代谢信息,而一些疾病本身可能就只影响了局部的代谢,如Viant等[17]研究早期脑外伤动物模型大脑组织与血浆的代谢物变化,结果在大脑组织有氧化应激(比如维生素C)兴奋性中毒(比如谷氨酸)等代谢紊乱,而血浆中并没有发现明显的变化,因此组织代谢的研究具有重要的意义。

目前组织标本研究还不是很多,主要有肝、大脑皮层和小脑等,肝组织主要用于一些毒理学研究,如Azmi等[18]应用NMR技术,采集肝组织样本研究肝毒性的代谢组变化等。

大脑皮层、小脑组织主要用于神经系统疾病的研究,如Griffin等[19]应用NMR研究脊髓小脑性共济失调动物模型小脑、大脑的提取物的代谢谱变化,结果发现谷氨酰胺增加,而γ2氨基丁酸、胆碱、磷酸胆碱和乳酸盐下降等特征。

1.4　代谢组研究的影响因素　充分了解代谢组研究的影响因素是应用好代谢组技术开展医学研究的前提,目前研究者们已经注意到了代谢组研究的影响因素[20],除了实验技术本身对代谢组研究的影响外,还有如样品制备(抽提溶剂和温度等)、仪器性能和数据分析方法等。

不同生理状态对代谢组的影响也引起了研究者的重视,比如性别、年龄、饮食、昼夜变化、文化等,因为这是代谢组技术在临床应用的关键问题[21]。

如Stanley[22]等为了探索不同性别间的代谢物差异,选择了NMR结合化学计量方法研究不同性别Wistar大鼠尿液的代谢谱,结果发现羟苯基丙酸等代谢物存在明显的性别差异;K ochhar
等[23]选择了150名健康人,应用NMR方法研究不同性别人血清和尿液的代谢谱差异,结果发现女性脂类的合成高于男性,男性的蛋白质转换多于女性等差异。

Bollard等[24]还综述了不同生理状态下的动物尿的代谢物特征,尤其在不同个体之间、性别、年龄、饮食、物种、品系、激素状态、压力及昼夜变化等,发现不同的生理状态对代谢组有明显的影响。

Lenz等[25]收集了给予标准饮食的12名健康男性相隔14d的血浆和尿液进行NMR检测,应用PCA 进行数据分析,结果发现血浆的差异很小,但在尿液中存在很大的个体差异,同时发现所有受试者代谢谱存在昼夜变化规律。

Lenz等[26]还比较了不同国家之间人群的代谢谱的差异情况,选择单身的受试者,不进行饮食限制,收集晨尿,应用NMR进行分析,使用PCA分析数据,结果发现一些有统计学意义的差异,研究表明内源性尿代谢谱受到文化、饮食的严重影响,因此在疾病或治疗标志物的筛选中需要特别注意这些影响因素,此外还需结合数学的方法以排除这些影响因素。

2　代谢组的分析技术
2.1　谱峰的预处理　谱峰的预处理对代谢组的后期分析有较大的影响,质谱峰的预处理包括背景扣除、滤噪、保留时间校正、谱峰匹配和归一化或标准化等。

NMR谱峰的预处理包括背景扣除、滤噪、归一化或标准化等。

一些学者正对谱峰预处理的方法进行研究,比如针对1H2NMR原始光谱资料, Stoyanova等[27]介绍了一种基于时间窗口的自动校正谱峰的方法;Webb2Robert so n等[28]就对谱峰整合和归一化方法进行了研究。

此外样品的分析过程中不可避免地会出现谱峰漂移,Forshed等[29]比较了bucketing和PL F两种最近发展的NMR峰位校正法,并应用实例对两种方法进行了比较。

气或液2质联用技术,通过常规的重叠峰析法后,能分离300多种代谢物,但该方法耗时而且不能自动化。

Jonsson等[30]发展了一种半自动的逐级多元曲线分辨处理质谱数据的方法,该方法已经应用于不同发育时间植物叶的代谢物研究,结果表明该法和常规的重叠峰析法具有类似的可信度。

还有研究者开发谱峰的预处理软件,比如Katajamaa等[31]针对L C2MS开发了MZmine软件,该软件主要用于代谢组资料的滤噪、谱峰匹配和标准化等预处理。

2.2　数据分析　医学中的代谢组研究常常需要对疾病机制或治疗相关的代谢标志物进行研究,常用的分析方法有PCA、t检验和方差分析等。

如Coen 等[32]应用PCA方法对乙酰氨基酚肝毒性的代谢组资料进行分析,结果发现该肝毒性可能与肝脏线粒体利用丙酮酸盐和脂肪酸β2氧化功能下降有关; J ansen等[33]还介绍了一种权重PCA方法处理代谢组资料;Smilde等[34]提出了一种基于方差分析的同时成分分析(ANOVA2simultaneo us component analysis,ASCA)方法处理代谢组数据。

在疾病的诊断研究方面常常应用判别分析,比如应用代谢组资料对患者进行某病的是与否判别等。

常用的方法有类模拟软独立建模(soft inde2 pendent modeling of class analogy,SIMCA)、偏最小二乘法判别分析和人工神经元网络(artificial neural networks,ANN)等,比如Odunsi等[35]使用1H2NMR研究上皮卵巢癌。

选择38名上皮卵巢癌病人,12名良性卵巢囊肿和53名健康妇女,应用PCA方法降维数据和SIMCA方法进行模式识别,结果分析判断的准确率为97%。

Wang等[36]应用L C2MS技术研究2型糖尿病的血浆代谢谱,应用PCA和偏最小二乘法显著性分析(partial least squares discriminant analysis,PL S2DA)方法能成功地将糖尿病人和对照正常人区分开来,为临床诊断提供了参考。

Bundy等[37]选择了6种蜡样芽胞杆菌,其中3种为实验室使用的无毒的菌株,另3种为从脑膜炎患者分离的有毒的菌株,应用核磁共振方法进行代谢组学研究,采用主成分分析和权威的判别分析(canonical discriminant analysis,CDA)方法,结果发现判别分析能正确地将有毒、无毒菌株分开。

Taylor等[38]使用433种代谢物资料,应用人工神经网络的方法建立数学模型,该模型能成功地对植物的基因型进行判别分析。

3　代谢组技术在现代医学研究中的应用
3.1　在疾病机制研究中的应用　目前代谢组在疾病机制研究中的应用还不多,主要应用于肿瘤、遗传病和少数几种常见病之中。

如Akira等[39]应用NMR研究高血压大鼠与正常大鼠尿的代谢谱差异,应用PCA的方法进行分析,结果发现牛磺酸、肌酸及一些未鉴定的代谢物存在明显的差异。

Pears 等[40]应用NMR结合统计学的模式识别方法,研究Cln3基因敲除的巴藤病小鼠动物模型脑组织的代谢组变化,结果发现谷氨酸含量增加、γ2氨基丁酸(γ2aminobutyric acid,GABA)下降,提示在谷氨酸/谷酰胺与GABA之间存在神经递质循环的不足,这些变化代表了Cln3小鼠表型出现前的生化变化。

Ippolito等[41]为了研究预后不良前列腺癌的特征,首先分析原发性前列腺癌及细胞株的基因表达谱资料,获得446条高表达的基因,应用这些基因结
合代谢组学研究前列腺癌的代谢途径,结果发现预后不良前列腺癌存在谷氨酸脱羧酶等一些特征性代谢途径。

为了更好地应用代谢组资料进行疾病的机制研究,一些研究者将代谢组技术和其他技术相结合进行疾病机制的探索研究,如Stentiford等[42]应用代谢组结合蛋白质组和组织病理学方法研究肝癌的发病机制等。

3.2　在疾病诊断中的应用　由于代谢组监测是一种快速和无损伤的方法,在疾病诊断方面的研究开展相对较多,如Brindle等[43]应用NMR技术研究冠心病患者血清的代谢组变化,PL S2DA模式识别方法不仅能对冠心病进行有无的诊断,而且还能判断病情的轻重。

Yang等[44]以毛细管气相色谱结合模式识别方法研究2型糖尿病血清代谢组的变化,结果发现血清脂肪酸谱能有效地将2型糖尿病和正常人区分开,模式识别方法提高了诊断的敏感性。

Wishart[45]还将代谢组方法应用于器官移植中监测排斥反应,在器官移植前后监测血清肌酸酐的代谢产物,认为代谢组可能成为器官移植生存能力和排斥反应的理想监测工具。

最近代谢组学技术还应用于艾滋病的研究中,如Hewer等[46]应用1H2NMR 检测患者血清的代谢谱,结合模式识别方法,发现血清的代谢谱能够将艾滋病阳性和阴性的患者区分开来。

随着研究的深入,代谢组技术必将应用于更多的疾病研究之中。

3.3　在药理学研究中的应用　代谢组在药理学方面的研究,主要集中于毒理学研究,如Kleno等[47]为了研究肼苯哒嗪诱导的肝毒性,选择肝脏样本,应用NMR技术研究血清样本代谢谱,结果发现肼苯哒嗪引起了代谢物的明显变化,主要与葡萄糖、脂肪、氧化应激代谢相关。

Heijne等[48]将溴苯诱导的肝炎大鼠血浆和尿液的代谢组资料结合大鼠的肝脏的基因表达谱资料分析,结果发现转录组和代谢组结合能提高肝毒性检测的敏感性。

Coen等[49]为了鉴定扑热息痛肝毒性引起的生化变化,进行了肝组织的基因表达谱和肝组织及其提取物和血浆代谢组研究,从生化途径对3种资料进行分析,在完整肝组织中,肝葡萄糖和肝糖原下降,血浆中的脂肪成分丙酮酸盐、醋酸盐、乳酸盐增加,水提物中丙氨酸、乳酸盐增加。

整合这些资料提示肝脏的糖酵解率增加,代谢组研究结果和基因表达谱的变化是一致的,主要涉及脂肪和能量代谢,两种技术相结合起到互补的作用。

4　代谢组学在中西医结合研究中的应用展望
由于代谢组技术的一些优势和特点,目前代谢组已在现代医学中开展了一些研究,并取得了一系列的成绩。

因此中西医结合也应积极应用代谢组技术开展证候、方药及针灸等方面的研究。

2005和2006年度国家自然科学基金开始对该方向进行了资助,主要集中在肾虚、肾阳虚、脾虚及虚实证等少数几个项目。

目前中医药应用代谢组技术研究的报道还极少,相信随着研究的深入,代谢组技术必将广泛地应用于中西医结合研究中。

另外,尽管代谢组是一种高通量的研究方法,但是由于代谢组关注的是小分子的代谢物,所以如果缺乏与基因组等知识的联系,代谢组资料是很难解释的。

将代谢组与基因组和蛋白质组进行结合研究也引起众多学者的注意[50,51],因此中西医结合也应积极地将代谢组与基因组和蛋白质组进行结合研究,即站在系统生物学的高度进行研究。

REFERENCES
1　Nicholson J K,Lindon J C,Holmes E.Metabonomics: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data.Xenobi2 otica.1999;29(11):118121189.
2　Lindon J C,Holmes E,Nicholson J K.So what’s the deal with metabonomics?Anal Chem.2003;75(17): 384A2391A.
3Nicholson J K,Wilson ID.Opinion:understanding global systems biology:metabonomics and the continu2 um of metabolism.Nat Rev Drug Discov.2003;2(8): 6682676.
4　Dunn WB,Bailey NJ,Johnson H E.Measuring the metabolome:current analytical technologies.Analyst.
2005;130(5):6062625.
5　Brindle J T,Nicholson J K,Schofield PM,et al.Appli2 cation of chemometrics to1H2NMR spectroscopic data to investigate a relationship between human serum met2 abolic profiles and hypertension.Analyst.2003;128
(1):32236.
6　Lehnhardt F G,Bock C,Rohn G,et al.Metabolic differences between primary and recurrent human brain tumors:a1H2NMR spectroscopic investigation.NMR Biomed.2005;18(6):3712382.
7Tang H,Wang Y,Nicholson J K,et e of relaxation2edited one2dimensional and two dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy to improve detection of small metabolites in blood plasma.Anal Biochem.2004;325(2):2602272.
8Choi YH,K im H K,Linthorst HJ,et al.NMR metabo2 lomics to revisit the tobacco mosaic virus infection in Nicotiana tabacum leaves.J Nat Prod.2006;69(5):
7422748.
9　A J,Trygg J,Gullberg J,et al.Extraction and GC/MS analysis of the human blood plasma metabolome.Anal Chem.2005;77(24):808628094.
10　Wilson ID,Plumb R,Granger J,et al.HPL C2MS2 based methods for the study of metabonomics.J Chro2 matogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2005;817
(1):67276.
11　Yang J,Xu G,Zheng Y,et al.Diagnosis of liver cancer using HPL C2based metabonomics avoiding false2positive result f rom hepatitis and hepatocirrhosis diseases.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2004;
813(122):59265.
12　Lenz EM,Bright J,Knight R,et al.Metabonomics with1H2NMR spectroscopy and liquid chromatography2 mass spectrometry applied to the investigation of meta2 bolic changes caused by gentamicin2induced nephrotox2 icity in the rat.Biomarkers.2005;10(223):1732187. 13　Sato S,Soga T,Nishioka T,et al.Simultaneous deter2 mination of the main metabolites in rice leaves using capillary electrophoresis mass spectrometry and capillary electrophoresis diode array detection.Plant J.
2004;40(1):1512163.
14　Price KE,Vandaveer SS,L unte CE,et al.Tissue targeted metabonomics:metabolic profiling by microdialysis sampling and microcoil NMR.J Pharm Biomed Anal.2005;38(5):9042909.
15　Ramadan Z,J acobs D,Grigorov M,et al.Metabolic profiling using principal component analysis, discriminant partial least squares,and genetic algo2 rithms.Talanta.2006;68(5):168321691.
16　Coen M,O’Sullivan M,Bubb WA,et al.Proton nuclear magnetic resonance2based metabonomics for rapid diag2 nosis of meningitis and ventriculitis.Clin Infect Dis.
2005;41(11):158221590.
17　Viant MR,L yeth B G,Miller M G,et al.An NMR metabolomic investigation of early metabolic disturb2 ances following traumatic brain injury in a mammalian model.NMR Biomed.2005;18(8):5072516.
18　Azmi J,Griffin JL,Shore RF,et al.Chemometric analysis of biofluids following toxicant induced hepato2 toxicity:a metabonomic approach to distinguish the effects of12naphthylisothiocyanate f rom its products.
Xenobiotica.2005;35(8):8392852.
19　Griffin JL,Cemal CK,Pook MA.Defining a metabolic phenotype in the brain of a transgenic mouse model of spinocerebellar ataxia3.Physiol G enomics.2004;16
(3):3342340.
20　Gullberg J,Jonsson P,Nordstrom A,et al.Design of experiments:an efficient strategy to identify factors
influencing extraction and derivatization of A rabi dopsis thaliana samples in metabolomic studies with gas chro2 matography/mass spectrometry.Anal Biochem.2004;
331(2):2832295.
21　Lindon J C,Holmes E,Nicholson J K.Metabonomics techniques and applications to pharmaceutical research &development.Pharm Res.2006;23(6):107521088. 22　Stanley EG,Bailey NJ,Bollard M E,et al.Sexual di2 morphism in urinary metabolite profiles of Han Wistar rats revealed by nuclear2magnetic2resonance2based metabonomics.Anal Biochem.2005;343(2):1952202. 23　K ochhar S,J acobs DM,Ramadan Z,et al.Probing gender2specific metabolism differences in humans by nuclear magnetic resonance2based metabonomics.Anal Biochem.2006;352(2):2742281.
24　Bollard M E,Stanley EG,Lindon J C,et al.NMR2based metabonomic approaches for evaluating physiological influences on biofluid composition.NMR Biomed.
2005;18(3):1432162.
25　Lenz EM,Bright J,Wilson ID,et al.A1H NMR2 based metabonomic study of urine and plasma samples obtained f rom healthy human subjects.J Pharm Biomed Anal.2003;33(5):110321115.
26　Lenz EM,Bright J,Wilson ID,et al.Metabonomics, dietary influences and cultural differences:a1H2NMR2 based study of urine samples obtained f rom healthy British and Swedish subjects.J Pharm Biomed Anal.
2004;36(4):8412849.
27　Stoyanova R,Nicholls AW,Nicholson J K,et al.Auto2 matic alignment of individual peaks in large high2 resolution spectral data sets.J Magn Reson.2004;170
(2):3292335.
28　Webb2Robertson BJ,Lowry DF,J arman KH,et al.A study of spectral integration and normalization in NMR2 based metabonomic analyses.J Pharm Biomed Anal.
2005;39(324):8302836.
29　Forshed J,Torgrip RJ,Aberg KM,et al.A compari2 son of methods for alignment of NMR peaks in the con2 text of cluster analysis.J Pharm Biomed Anal.2005;
38(5):8242832.
30　Jonsson P,Gullberg J,Nordstrom A,et al.A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.Anal Chem.2004;76
(6):173821745.
31　Katajamaa M,Oresic M.Processing methods for differential analysis of L C/MS profile data.BMC Bioinformatics.2005;6:179.
32　Coen M,Lenz EM,Nicholson J K,et al.An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy.Chem Res
Toxicol.2003;16(3):2952303.
33　Jansen JJ,Hoef sloot HC,Boelens HF,et al.Analysis of longitudinal metabolomics data.Bioinformatics.
2004;20(15):243822446.
34　Smilde A K,Jansen JJ,Hoef sloot HC,et al.ANOVA2 simultaneous component analysis(ASCA):a new tool for analyzing designed metabolomics data.
Bioinformatics.2005;21(13):304323048.
35　Odunsi K,Wollman RM,Ambrosone CB,et al.Detec2 tion of epithelial ovarian cancer using1H2NMR2based metabonomics.Int J Cancer.2005;113(5):7822788. 36　Wang C,K ong H,Guan Y,et al.Plasma phospholipid metabolic profiling and biomarkers of type2diabetes mellitus based on high2performance liquid chromatogra2 phy/electrospray mass spectrometry and multivariate statistical analysis.Anal Chem.2005;77(13):41082 4116.
37　Bundy J G,Willey TL,Castell RS,et al.Discrimination of pathogenic clinical isolates and laboratory strains of Bacill us cereus by NMR2based metabolomic profiling.
FEMS Microbiol Lett.2005;242(1):1272136.
38　Taylor J,K ing RD,Altmann T,et al.Application of metabolomics to plant genotype discrimination using statistics and machine learning.Bioinformatics.2002;
18(Suppl2):S2412248.
39　Akira K,Imachi M,Hashimoto T.Investigations into biochemical changes of genetic hypertensive rats using 1H nuclear magnetic resonance2based metabonomics.
Hypertens Res.2005;28(5):4252430.
40　Pears MR,Cooper JD,Mitchison HM,et al.High resolution1H2NMR2based metabolomics indicates a neurotransmitter cycling deficit in cerebral tissue f rom a mouse model of Batten disease.J Biol Chem.2005;280
(52):42508242514.
41　Ippolito J E,Xu J,Jain S,et al.An integrated
f unctional genomics and metabolomics approach for de2
fining poor prognosis in human neuroendocrine cancers.
Proc Natl Acad Sci U S A.2005;102(28):990129906.42　Stentiford G D,Viant MR,Ward D G,et al.Liver tumors in wild flatfish:a histopathological,proteomic, and metabolomic study.OMICS.2005;9(3):2812299. 43　Brindle J T,Antti H,Holmes E,et al.Rapid and non2 invasive diagnosis of the presence and severity of coro2 nary heart disease using1H2NMR2based metabonomics.
Nat Med.2002;8(12):143921444.
44　Yang J,Xu G,Hong Q,et al.Discrimination of type2 diabetic patients f rom healthy controls by using metabo2 nomics method based on their serum fatty acid profiles.
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2004;
813(122):53258.
45　Wishart DS.Metabolomics:the principles and potential applications to transplantation.Am J Transplant.
2005;5(12):281422820.
46　Hewer R,Vorster J,Steffens FE,et al.Applying biofluid1H2NMR2based metabonomic techniques to distinguish between HIV21positive/AIDS patients on antiretroviral treatment and HIV21negative individuals.
J Pharm Biomed Anal.2006;41(4):144221446.
47　Kleno T G,Kiehr B,Baunsgaard D,et bination of’omics’data to investigate the mechanism(s)of hydra2 zine2induced hepatotoxicity in rats and to identify poten2 tial biomarkers.Biomarkers.2004;9(2):1162138.
48　Heijne W H,Lamers RJ,van Bladeren PJ,et al.Pro2 files of metabolites and gene expression in rats with chemically induced hepatic necrosis.Toxicol Pathol.
2005;33(4):4252433.
49　Coen M,Ruepp SU,Lindon J C,et al.Integrated appli2 cation of transcriptomics and metabonomics yields new insight into the toxicity due to paracetamol in the mouse.J Pharm Biomed Anal.2004;35(1):932105. 50　Nielsen J,Oliver S.The next wave in metabolome anal2 ysis.Trends Biotechnol.2005;23(11):5442546.
51　Thomas CE,Ganji G.Integration of genomic and meta2 bonomic data in systems biology—are we’there’yet?
Curr Opin Drug Discov Devel.2006;9(1):922100.。