食品生物技术-第二章 基因工程

六、T4 多聚核苷酸激酶
该酶来源 T4 噬菌体感染的大肠杆菌，能够催化 ATP 的 γ-磷酸基转移至 DNA 或 RNA 的 5ˊ-OH 末端，主要作用是为 DNA 的 5ˊ末端进行标记；对准 备连接但缺乏 5ˊ磷酸的 DNA 或化学合成片段的 5ˊ-OH 加上磷酸基团。
6.食品基因工程
利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗 传物质，以改良食品的品质和性状，提高食品的营养价值、 贮藏价格性状以及感官性状的技术。
二、基因工程的发展简史
（一）遗传物质的研究 （二）基因工程的诞生和发展
（一）遗传物质的研究
加拿大细菌学家 Avery、美国生物学家 Macleod 和 Maclarty 在纽约的洛克 菲勒研究所于 1944 年发表的著名实验证明了 DNA 是细胞的遗传物质；1953 年 Wastson 和 Crick 建立了 DNA 双螺旋结构模式；1961 年 Crick 提出蛋白质的合 成中心法则：遗传信息是从 DNA 到 DNA 的自我复制，DNA 将所贮存的遗传信 息转录给信使核糖核酸(mRNA)，再由 mRNA 翻译成蛋白质，最后由蛋白质直 接或间接地表现出遗传性状；随后，Jacob 和 Monod 发现操纵子模型，奠定了原 核生物基因表达调控的理论基础。
一、限制性内切核酸酶
（一）限制性内切酶的命名 （二）限制性内切酶种类 （三）限制性内切酶的基本特性
限制作用（restriction）：指一定类型的细菌可以通过 其限制性内切核酸酶的作用，切割降解入侵的外源DNA， 使得外源DNA的入侵受到限制的现象。
修饰作用（modification）：指在DNA甲基化酶作用 下，生物体自身DNA分子在特定碱基的特定位置上发生 甲基化而得到修饰，从而免遭自身限制性内切核酸酶降解 的现象。
（二）基因工程的诞生和发展
1965 年 Sanger 提出了蛋白质氨基酸的序列分析法和核酸序列分析方 法，使人们对 DNA 的结构与功能的关系有了更加深刻的认识。同时， 酶学、细菌学、病毒学的发展也为基因工程的产生准备了必要的工具， 1972 年美国科学家 Berg 等首次利用限制性内切酶在体外将猿猴病毒 SV40 和噬菌体的 DNA 分别切割，并用 DNA 连接酶连接起来，构成了 第一个重组 DNA 分子；1973 年 S.N.cohen 等人在体外成功的获得质粒 DNA，命名为 pSC109，最后将重组质粒 DNA 转移到大肠杆菌细胞中并 得到表达，这一研究成功标志着基因工程的诞生；1979 年人胰岛素基因 的重组获得成功，1997 年英国科学家成功的克隆了“多莉”羊，标志着 基因工程开始走向成熟。
4.重组DNA技术（recombinant DNA technique）
利用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同的DNA进 行体外切割、连接构成新的DNA分子的技术。
5.基因工程（gene engineering）
运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行 体外切割、连接构成重组DNA，再将重组DNA经生物介导 或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从 而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为 人类提供有用产品等的技术。
第二章 基因工程
与食品产业
第一节 基因工程概述
一、基因工程的定义
1.基因（gene） DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质
最小功能单位。 2.基因组（geneome）
一个生物体的全部基因序列。 3.基因表达（gene expression） 遗传信息转录和翻译的过程。 （1）转录。在DNA分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的 RNA的过程。 （2）翻译。在RNA的控制下，根据核苷酸链上每三个核苷酸决 定一个氨基酸的三联体密码规则，合成出具有特定氨基酸顺序的 蛋白质肽链过程。 （3）逆转录。以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成 DNA的过程。
（二）大肠杆菌Klenow片段
该酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草芽孢杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解得到 的一条多肽链，具有 5ˊ→3ˊ聚合酶活性和 3ˊ→5ˊ外切酶活性，失去了 5ˊ →3ˊ外切酶活性。它可用于填补 DNA 末端成为双链。
五、碱性磷酸酯酶
该酶来自大肠杆菌和牛小肠，能催化 DNA、RNA、NTP 和 dNTP 分子中去 除 5ˊ磷酸基团，其作用为：（1）去除 DNA 两端的 5ˊ-磷酸基，防止 DNA 自 我环化；（2）同位素 32P 标记的 5ˊ-OH 末端制备 DNA 或 RNA 探针时，先用 该酶去除 5ˊ-磷酸基，产生 5ˊ-OH 末端，再进行标记。
基因工程的三大理论和三大技术基础
1.三大理论基础 （1）1940年代Avery等人的肺炎球菌的转化试验证明了
生物的遗传物质是DNA。 （2）1950年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺
旋结构及DNA半保留复制机理。 （3）1960年代Crick关于遗传中心法则的确立，即生物
体中遗传信息是按DNA→RNA→蛋白质方向进行传递。 2.三大技术基础 （1）如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需要的
3. Ⅲ类限制性内切酶
该酶由两个不同的亚基组成，辅助因子为 ATP、Mg2+，其切割位点在识别 序列周围 24～26bp 处，因此，Ⅲ型限制酶在基因工程技术中也不常用，如 EcoP Ⅰ、HinFⅢ等。
（三）限制性内切酶的基本特性
1. 识别特定序列
大多数Ⅱ型内切酶的识别序列很严格，且识别的 DNA 序列碱基数一般为 4～8 bp，富含 GC，该识别序列常具有 180o 旋转对称性的回文结构，少数Ⅱ型 内切酶能识别更长的序列，还有一些Ⅱ型内切酶能识别多种核苷酸，如 HinDⅡ 型的识别位点是-GTPyPuAC-，其中 Py 可代表 C 或 T，而 Pu 可因组的遗传信息，贮存 在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应 用它分离所需要的目的基因，）用限制酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA。
二、DNA甲基化酶
DNA 甲基化酶简称甲基化酶，是指能够识别 DNA 特定序列，并在其特定 位置上引入甲基进行修饰的一类酶，甲基化酶与限制性内切酶具有相同的识别 序列，甲基化酶使序列中的某个碱基发生甲基化，保护 DNA 不被限制性内切酶 切开，因此在体外重组操作中，常用甲基化酶保护基因组 DNA 中的相应位置不 被限制性内切酶切割。
性末端，在识别序列双链 DNA 两条链的对称轴 5ˊ侧切割产生 5ˊ端突出的黏性末端，如
EcoRⅠ
5ˊ-G AATTC-3ˊ 在箭头所指处切割产生 3ˊ-CTTAA G-5ˊ
5ˊ-G AATTC-3ˊ 3ˊ-CTTAA G-5ˊ
（3）在识别序列双链 DNA 两条链的对称轴 3ˊ侧切割产生 3ˊ末端突出的黏性末端，如
2. 切割方式
（1）在识别序列对称轴处平齐切割 DNA 两条链而形成的平头双链末端，称为平整末端，
简称平末端。如 HaeⅢ识别序列为：
5ˊ-GG CC-3ˊ 在箭头所指处切割产生 5ˊ-GG
3ˊ-CC GG-5ˊ
3ˊ-CC
CC-3ˊ GG-5ˊ
（2）限制性内切酶交错切割 DNA 双链而形成彼此互补的单链末端，可形成氢 键，称为黏
四、DNA聚合酶
（一）大肠杆菌DNA聚合酶 （二）大肠杆菌Klenow片段
（一）大肠杆菌DNA聚合酶
DNA 聚合酶Ⅰ是大约 1,000 个氨基酸的多肽链，含有一个二硫键、一个-SH 以及 Zn2+。该酶有三种作用：（1）5ˊ→3ˊ的聚合作用，可修补 DNA 或切除 RNA 引物后留下的空隙；（2）3ˊ→5ˊ的外切酶活性，消除在聚合作用中掺入 的错误核苷酸；（3）5ˊ→3ˊ的外切酶活性，切除受损伤的 DNA。
（一）限制性内切酶的命名
限制性内切酶的命名主要是参考 1973 年 H.O.Smith 和 D.Nathaus 提 出的原则进行的：第一个字母为细菌属名的第一个字母，第二、三个字 母为细菌种名的前两个字母，构成三字母符号，该三字母符号用斜体书 写，接下去是细菌株的第一个字母，用正体书写，如果同一菌株中分离 出几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……表示，如 EcoR Ⅰ表示从 Escherichia coli（大肠杆菌）菌株 RY13 中分离出的第一种限 制性内切酶。
2. Ⅱ类限制性内切酶
该类酶由两个亚基构成，辅助因子为 Mg2+。这类酶切割作用特异性 强，能够识别专一的核苷酸序列，并在该序列内固定位置上或其附近特 异切割，所以总能够得到同样核苷酸顺序的 DNA 片段，而且还能构建 来自不同基因组的 DNA 片段，形成杂合 DNA 分子，因此，这种限制性 内切酶是基因工程技术中常用的工具酶之一，如 BamHⅠ、EcoRⅠ等。 这类酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是 4 个或 6 个，少数也有 7 个、 9 个、10 个、11 个核苷酸。
基因片段切割下来（限制性内切核酸酶）。 （2）如何将获得的基因片段进行连接（DNA连接酶）。 （3）如何将切割下来的基因片段进行繁殖扩增（基因载
体）。
基因工程的主要内容
• 在供体细胞内用限制性内切酶切割基因，以分离出含
切 有特定的基因片段或人工合成目的基因并制备运载体
• 把获得的目的基因与制备好的运载体（质粒、病毒或
三、连接酶
DNA 连接酶是指能将两段 DNA 拼接起来的酶类，这类酶能够催化双链 DNA 分子中相邻的 3ˊ-羟基末端与 5ˊ-磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。在基 因工程中应用最广的 DNA 连接酶为 T4 噬菌体 DNA 连接酶，它既可以连接带有 匹配黏末端的双链 DNA，又可连接两个平末端双链 DNA，但这种酶只能连接双 链 DNA，不能连接单链 DNA。T4 噬菌体 RNA 连接酶可催化单链 RNA（或 DNA） 分子的 5ˊ-磷酸基末端与 3ˊ-羟基末端形成共价键。
限制性内切核酸酶没有种属特异性，即限制性内切核酸 酶识别、切割特定序列的能力同底物DNA的来源无关， 它可识别、切割各种来源的DNA。
DNA甲基化酶具有种属特异性，生物体的DNA甲基化 酶只修饰保护自己的DNA，而不修饰保护非己的DNA。 生物体的限制性内切核酸酶不能降解自身被修饰保护的 DNA，而只能降解外源的DNA。
PstⅠ
5ˊ-CTGCA G-3ˊ 3ˊ-G ACGTC-5ˊ
在箭头所指处切割产生
5ˊ-CTGCA G-3ˊ 3ˊ-G ACGTC-5ˊ
限制酶的主要用途
（1）在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切割的 DNA片段。
（2）建立DNA分子的限制酶图谱。
限制酶图谱（restriction map）:指一系列限制酶的特异识 别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。
切割位点
距其特异识别位点至 在特异切割位 距其识别位点3’
少00bp处随机切 点上或其附近 端24～26bp处 特
割
特异切割
异切割
基因工程常用
1. Ⅰ类限制性内切酶
该类酶由三种不同的亚基组成，辅助因子为 ATP、Mg2+、S腺苷甲硫氨酸，它能识别和结合特定的 DNA 序列位点，随机切 断识别位点以外的 DNA 序列，通常在识别位点周围 1,000bp 范围。 这类酶切割的核苷酸顺序没有专一性，无法用于分析 DNA 结构 或克隆基因，这类酶如 EcoK、KcoB 等。
（二）限制性内切酶种类
主要特性
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
酶蛋白构成
三种不同亚基
ATP、Mg2+及S-腺 酶活辅助因子 苷甲硫氨酸
两个相同亚基 Mg2+
两种不同亚基 ATP、Mg2+
识别序列特性
EcoB Ⅰ:TGAN8TGCT EcoKⅠ:AACN6GTG
C
旋转对称
EcoP Ⅰ:AGACC EcoP15
Ⅰ:CAGCAG
接 噬菌体）用DNA连接酶连接组成重组体。
贴 • 把重组体引入宿主细胞
检查 • 筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体 修复
基因工程相关技术
基因工程工具酶 基因工程载体及其选择 目的基因的制备 基因的克隆与检测 外源基因的表达
第二节 基因工程工具酶
一、限制性内切核酸酶 二、DNA甲基化酶 三、连接酶 四、DNA聚合酶 五、碱性磷酸酯酶 六、T4 多聚核苷酸激酶 七、S1核酸酶 八、反向转录酶