6实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测

7. 弃去收集液，加入720μl用乙醇稀释的DNA洗涤 缓冲液洗涤柱子，室温10,000×g离心1min，弃去 洗涤液。
五、实验结果与讨论
1. 实验结果 2. 讨论
附I：碱法提取质粒的原理和方法
(一)试剂等
1. SolutionⅠ 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.· Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4℃保存备用。 2. SolutionⅡ(现用现配制) 0.2 mol/L NaOH 1% SDS
9. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管 中，在吸附膜的中间部位加60-100 μl洗脱缓 冲液EB或双蒸水（洗脱缓冲液事先在65℃70℃水浴中加热效果更好）,室温放置1分钟， 13,000rpm离心1分钟洗脱质粒DNA，可立即 用于下游分子生物学实验或-20℃保存。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒 浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小不应 少于50μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒 产量。
(四) 实验操作步骤
1.
2.
3.
收集1.5-3mL 菌液的沉淀于1.5 mL Eppenforf离心管中，加入100μl溶液1，振 荡至彻底悬浮。 加入150 μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管 数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体 变得清亮。随后将离心管放置于冰上1-2 分钟（时间勿超！）。 加入150 μl溶液3，立即温和颠倒离心管 数次，室温放置5分钟。12，000rpm 离心 12 分钟。
4. 加400μl溶液P3，立即温和的上下翻转
6-10次，室温放置5分钟。室温13， 000rpm离心10分钟，小心取上清。 5 . (将吸附柱安置于收集管上，加入500μl 溶液P4 ，室温13,000rpm离心1分钟， 弃滤液；) 将上一步所得上清液加入吸附柱AC中 （吸附柱放入收集管中）， 13,000rpm离心1分钟，弃滤液。

载体结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性， LacZ） • 独立的复制单位 载体种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体 （YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
pBC SK map
三、实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 恒温摇床 超净工作台 高压灭菌锅 高速台式离心机 微量取液器、 1.5mLEP管 LB液体和固体培养基 卷纸、无水乙醇、双蒸水
如有必要，可把裂解液置于室温静置2min。避免剧烈混 和裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯 度降低。 当使用完ZL-II以后，须盖紧其瓶盖保存好。
4. 往上述混和液中加入350μl ZL-III，并温和地上下 颠倒离心管数次，直至形成白色絮狀沉淀。于室 温下10,000×g离心10min。 5. 仔细 取一干净的Mu-Pu质粒微量分离柱裝在一个 2ml收集试管上(已备)。小心吸出上清，并将其转 置于柱子內，确保转至柱內的上清中没有细胞杂 质沉淀。于室温下10,000×g离心1min，使裂解液 完全流过柱子。 6. 弃去离心甩出液，加入500μl的ZL缓冲液到柱子 上，室温下10,000×g 离心1min，确保除去残余 的蛋白质以得到后面操作所需的高质量DNA。
•
• • • •
实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论
一、实验目的
了解高纯质粒小量制备试剂盒和
碱法提取质粒的原理
掌握百泰克高纯质粒小量制备试
剂盒方法提取质粒的方法
二、实验原理
(百泰克高纯质粒小量制备试剂盒方法)
本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
一、原理简介 本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞， 离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值 状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA， 再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细 菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓 冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
11. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或
真空干燥沉淀。 12. 每管中加入25μL无菌水1μL RNase， 37℃溶解质粒DNA。
(三)实验结果及讨论
碱法提取质粒是实验室最常用的质粒 提取方法之一，提取量较大，便于操 作。 如有蛋白质残留，干燥后不透明，而 呈白色。
附II： B型质粒小样快速提取试剂盒
B．操作方案
1. 取1.5~5ml的菌液，于室温下10,000×g离心1min 以沉淀菌种。 2. 倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250μl 的ZL-I／RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全 重新悬浮。
细胞沉淀的完全重悬对于获得高的产量是十分重要的。
3.往重悬混和液中加入250μl ZL-II，轻轻翻转试管 4~6次混和溶液，以获得一澄清的裂解液。
附III：H.Q.&.Q. 高纯度质粒微量试剂盒
（HP Plasmid Miniprep Kit） A．样本制备
将带有目的质粒的E. coli 接种于裝有5ml LB/氨苄 青霉素(50μg/ml)培养基的10~20ml培养管中，37℃ 搖床培养12~16 hr，以扩增质粒。 建议使用endA 敏感型的E. coli 菌株来作常规质粒 的分离，例如DH5α® 和JM109®等菌株。
3. Solution Ⅲ（100 ml）： 5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋 酸 （pH 4.8）。 4. 胰RNA酶：将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶 于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃ 加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小 份保存于-20℃。 5. 氯仿，乙醇 ，70%乙醇。

2. 用250 μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振 荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解， 导致提取量和 纯度偏低。
3. 加250 μl的溶液P2，温和的上下翻转6-10 次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。
温和的混匀，不要剧烈震荡，以免基因组 DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免 质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如 果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。
（二） 材料和试剂
1. 含pUM-T (pMD18-T或 KS，pRT101)
质粒的大肠杆菌 DH10B（DH 5α或 HB101）。 2. 含外源基因的重组pUM-T (pMD18-T 或 KS，pRT101)质粒的大肠杆菌 DH10B（DH 5α或HB101） 。 3. 氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制 成50-100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保 存备用。
（二）实验步骤
1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液 2. 3.
4.
5.
体培养基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37℃ 振荡培养过夜。 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。 沉淀悬于200μL SolutionI 中, 涡旋使充分 悬浮。 加入300μL SolutionII，混匀（注意动作 轻），冰箱3 ℃放置5 min。 加入300μL SolutionIII,混匀（注意动作 轻） ，冰箱3 ℃放置5 min。
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. STE缓冲液 (溶液1) Lysis Buffer (溶液2) 3 M NaAc, PH 4.8 (溶液3) 结合缓冲液 浓缩漂洗液 洗脱缓冲液 离心吸附柱 废液收集管 RNaseA (10mg/ml)
(三) 实验准备
1.
2.
3.
试剂盒使用前，在5 mL溶液1中加入 300μl RNaseA（RNaseA终浓度为 0.6mg/mL）。溶液1使用完毕后，立即 于4 ℃保存。 浓缩漂洗液使用前按1：3的比例加入 无水乙醇，例如15 mL浓缩漂洗液中加 入45 mL无水乙醇，混匀后方可使用。 实验前检查溶液2及结合缓冲液是否有 高盐结晶。如有结晶，将盖拧松后加 热10-15秒，高盐结晶溶解后再使用。
4. 将420μl结合缓冲液加入离心吸附柱中，
然后将步骤3中的上清加入离心吸附柱中 （尽量去除杂质），混匀，12，000rpm 离心30秒钟。倒掉废液收集管中的废液。 5. 加入750 μl漂洗液于离心吸附柱中，静置1 分钟，12，000rpm 离心15秒。倒掉废液 收集管中的废液。重复一次。倒掉废液后， 再次于12，000rpm 离心2 分钟，尽量除去 漂洗缓冲液。 6. 下心取出离心吸附柱，将其套入一个干净 的1.5 mL Eppendorf离心管中，加入洗脱 缓冲液，常规50μl，室温放置2-5分钟，12， 000rpm 离心1 分钟。
实验原理（碱法）
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主 复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构 的小型DNA分子。 碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来 分离它们。

在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体 DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA 的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕， 紧密结合在一起。 当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA 分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性， 离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀 出来，而质粒DNA则留在上清液中。 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯 的质粒DNA。
四、实验步骤
百泰克高纯质粒小量制备试剂盒
第一次使用前请先在15ml(25ml)漂洗液WB 中加入45ml (75ml)无水乙醇! 将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，每次 使用后置于2-8℃保存。 1. 取1.5-4.5毫升过夜培养的菌液，9000rpm， 离心30秒，弃上清，收集菌体， 尽可能的 倒干上清。 处理超过1.5毫升菌液可以离心去上清后， 在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复 步骤1，直到收集到足够的菌体。
6. 12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新
7.
8.
9. 10.
Eppendorf 管中，注意所取体积（约600 μL ） 。 加入等体积氯仿（约600 μL ），混匀（注 意动作轻）。12,000rpm，4℃，离心 10min，取上清液。 上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20℃ 沉淀 20~30 min。 12,000 rpm离心15 min。 去上清，沉淀加入500μL 70%乙醇洗涤2次 （ 12,000 rpm离心3分钟）。
6. 加入500 μl去蛋白液PE，13,000rpm离 心30-60秒，弃滤液。
此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用 菌株为JM系列、HB101等，因为核酸酶含量 丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1 Blue 和DH5α等，核酸酶含量低，则可忽略此步骤。
7. 加入500 μl漂洗液WB（请先检查是否已 加入无水乙醇！），13,000rpm离心3060秒，弃滤液。 8. 重复步骤7一次，13,000rpm离心30-60秒， 弃滤液。 9. 空柱13,000rpm离心2 分钟。室温放置35分钟，除去残留乙醇。
一原理简介本试剂盒采用改进sds碱裂解法裂解细胞离心吸附柱内的硅基质膜在高盐低ph值状态下选择性地结合溶液中的质粒dna再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除最后低盐高ph值的洗脱缓冲液将纯净质粒dna从硅基质膜上洗脱
实验一 质粒的提取和琼脂糖 凝胶电泳检测
(高纯质粒小量制备试剂盒方法,百泰克)
北京博大泰克（BioDev）生物基因技术有限责任公司
(一) 概述
采用碱裂解--中和法，应用常规台式高速 离心机，经反应条件最优化后，使含有质粒 DNA的上清通过设计独特的离心吸附柱式结 构时，被特殊硅基质材料高效、专一地吸附。 被吸附的质粒DNA随后可用洗脱缓冲液从离 心吸附柱上洗脱下来。
(二) 试剂盒组成及包装
pMD18-T Vector
4. LB液体培养基（1L）：
胰蛋白胨 10g , 酵母提取物 5 g , Байду номын сангаасaCl 10 g 。 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶 解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子 水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 5. LB固体培养基（1L）： 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉 (Agar)15g。