中药材川贝母的DNA分子标记鉴定研究

摘要 ：贝母 为常用贵重 中药材 ， 药用历 史悠久 ， 我 国贝母属植物 已超过 ５ ０种（ 变种 ） ， 全 国各地 用作 贝母 的原植 物种类繁 多， 此 外 商品 贝母 中还 常混有土 贝母 、 唐 菖蒲等伪 品， 严重影响 了药品的安全 性和 有效 性， 由于 贝母 类药材 的形态 学上 的差 异较 小， 但是 化 学成分差异 大， 因此 准确地鉴 定贝母类 药材 的基 源种类是 一项极 为重要 的工作 ， 为 了探 索 贝母 类药材 的快速 、 准确 的鉴 别方 法 ，
川 贝母系百合科 植物川 贝母 Ｆ ｒ ｉ ｔ ｉ ｌ ｌ ａ ｒ ｉ ａ ｃ ｉ ｒ ｒ ｈ ｏ ｓ ａ Ｄ． Ｄ ｏ ｎ 、 暗紫 １ ２ ０ ０ ０转） １ 分钟 ， 将洗脱液再加入吸附柱 中， 室温放 置 ２分钟 ， 离 贝母 Ｆ ｒ ｉ ｔ ｉ ｌ ｌ ａ ｒ ｉ ａ ｕ ｎ ｉ ｂ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ａ ｔ ａ Ｈ ｓ ｉ ａ ｏ ｅ ｔ Ｋ ． Ｃ ． Ｈ ｓ ｉ ａ 、 甘肃贝母 Ｆ ｒ ｉ ｔ ｉ ｌ ｌ ａ ｒ ｉ ａ 心（ 转速为 每分钟 １ ２ ０ ０ ０转 ） １分钟 ］ ， 取洗 脱液 ， 作 为供试 品溶 ｐ ｒ ｚ ｅ ｗ ａ ｌ ｓ ｋ ｉ ｉ Ｍａ ｘ ｉ ｍ． 、 梭砂 贝母 Ｆ ｒ ｉ ｔ ｉ ｌ ｌ ａ ｒ ｉ ａ ｄ ｅ ｌ ａ ｖ ａ ｙ ｉ Ｆ ｒ ａ ｎ ｃ ｈ ． 、 太 白贝 液 ， 置４ ℃冰箱中备用 。另取Ｊ ｌ Ｉ 贝母 对 照药材 ０ ． １ ｇ ， 同法制成 对 母Ｆ ｒ ｉ ｔ ｉ ｌ ｌ ａ ｒ ｉ ａ ｔ ａ ｉ ｐ ａ ｉ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ Ｐ ． Ｙ ． Ｌ ｉ 或 瓦布 贝母 Ｆ ｉ ｆ ｔ ｉ Ｈ ａ ｉ ｆ ａ ｕ ｎ ｉ ｂ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ａ ｔ ａ 照药材模 板 Ｄ Ｎ Ａ溶 液。 Ｈ ｓ ｉ ａ ｏ ｅ ｔ Ｋ ． Ｃ ． Ｈ ｓ ｉ ａ ｖ ａ ｔ ． ｗ ａ ｂ ｕ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ （ Ｓ ． Ｙ ． Ｔ ａ ｎ ｇ ｅ ｔ Ｓ ． Ｃ ． Ｙ ｕ ｅ ） Ｚ ． Ｄ ． ２ ． ２ Ｐ Ｃ Ｒ ～Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ反 应 ： 鉴别 引 物： ５ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ａ Ｇ ・ Ｌ ｉ ｕ ． Ｓ ． Ｗａ ｎ ｇ ｅ ｔ Ｓ ． Ｃ ． Ｃ ｈ ｅ ｎ的干燥鳞茎。按 性状 不同分别 习称” 松 Ｇ Ｔ Ｉ ＇ ｒ Ｃ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ａ Ａ ３ 和５ Ｇ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ ｒ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ｔ ３ 。 贝” 、 ” 青 贝” 、 ” 炉贝” 和” 栽 培 品” 。川贝母 性微寒 而 味甘苦 ， 人 Ｐ Ｃ Ｒ反应体系 ： 在２ ０ ０ ｔ ｘ ｌ 离心管中进行 ， 反应总体积为 ３ ０ １ ｘ １ ， 反应 心肺经 ， 能润肺 、 止 咳、 化痰， 是 一 味珍 贵 的中药材 。 ” 中 国药 典 ” 体系包括 １ ０ Ｘ Ｐ Ｃ Ｒ缓 冲液 ３ １ ， 二氯化镁 （ ２ ５ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ） ２ ． ４ ｔ ｘ ｌ ， 规定药用川贝母为 以上 ６个 品种 ， 但 我 国贝母属 植物 已超过 ５ ０ ｄ Ｎ Ｔ Ｐ （ １ Ｏ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ） ０ ． ６ ｌ ， 鉴 别 引物 （ ３ ０ ｌ ｘ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ） 各０ ． ５ ｌ ， 高保 真 种， 造成 贝母基 源极为 复杂 ， 并且 随着 需求 量 的增加 ， 基 源混 乱 Ｔ ａ ｑ Ｄ Ａ Ｎ聚合 酶 （ ５ Ｕ ／ Ｉ ｘ １ ） ０ ． ２ １ ｘ ｌ ， 模板 １ ｔ ｘ ｌ ， 无 菌 超纯 水 ２ １ ． ８ ｔ ｚ ｌ 。 Ｃ Ｒ仪 ， Ｐ Ｃ Ｒ反应参数 ： ９ ５ ￣ Ｃ预变性 ４分钟 ， 循环 反 的现象呈现不断增加 的趋势 ， 直接影 响川贝母 临床用药 的安全 、 将 离心管置 Ｐ 疗效 。运用分子标记 技术 鉴定川 贝母 的 真伪 ， 以克 服 目前仅 依 应 ３ ０次 （ ９ ５ ￣ Ｃ ３ ０秒 ， ５ ５～ ５ ８ ℃３ ０秒 ， ７ ２ ℃３ ０秒 ） ， ７ ２ ℃ 延 伸 ５分 据形态 、 显微 特征及 理化进 行鉴 别 的不足 。使 中药 鉴定 的手 段 钟。取 Ｐ Ｃ Ｒ反应液 ， 置５ ０ ０ ｐ ￣ ｌ 离心 管 中， 进 行酶 切反应 ， 反应 总 从传统 的形态表征扩展到 了遗传物 质 Ｄ Ｎ Ａ 。特 别是近年来微 量 体积为 ２ ０ ｐ Ｊ ， 反应 体 系包 括 １ ０ Ｘ酶 切缓 冲液 ２ ｌ ， Ｐ Ｃ Ｒ反 应 液 Ｄ Ｎ Ａ的 Ｐ Ｃ Ｒ技术 的应 用发展 ， 使分 子生物 学技术 与方法 以特 异 ６ ｔ ｘ ｌ ， Ｓ ｍａ Ｉ （ Ｉ Ｏ Ｕ ／ Ｉ ￣ Ｉ ） ０ ． ５ １ ｘ ｌ ， 无菌超纯水 １ １ ． ５ ｔ ｚ ｌ ， 酶 切反应在 ３ ０ ℃ 性强 ， 稳定 性好 ， 微量、 准确 等特点 ， 被广 泛应 用 于近缘 种 、 珍 稀 水 浴 反应 ２小 时 。另 取 无 菌 超 纯 水 ， 同法上 述 Ｐ Ｃ Ｒ —Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ反 应 作为空 白对照 。 种、 破碎药材 等的鉴定 。本 实验 应用 分子 生物 学技术 对 Ｊ ｌ Ｉ 贝母 操作 ， 进行 了研究 ， 建立 了川 贝母 Ｄ Ｎ Ａ分子标记鉴定方法 ， 为川 贝母 与 ２ ． ３ 电泳 检测 ： 胶浓度为 １ ． ５ ％， 胶 中加入核酸凝胶染色剂 其伪品 的鉴定提供 了科学依据。 Ｇ ｅ ｌ Ｒ ｅ ｄ ； 供试品与对照药 材酶 切反 应溶 液 的上样 量分 别 为 ８ ｔ ｘ ｌ ， １ 材 料 与仪 器 Ｄ Ｎ Ａ分子量标 记上 样量 为 １ Ｉ ｘ ｌ （ ０ ． ｓ ｔ ａ ｇ ／ １ ） 。电泳 结束 后 ， 取凝 １ ． １ 药材 ： （ １ ） 伊 贝母对 照药材 、 平 贝母对 照药 材 、 湖北 贝 胶 片在凝胶成像仪上检视 。 母对照药材 、 浙 贝母对 照药材 、 Ｊ Ｉ Ｉ 贝母 对 照药材 （ 中国药 品生 物 ３ 结 果 制 品检定所 ） 。（ ２ ） 青贝、 炉贝、 浓 蜜贝母 （ 广西锦 莹药业 有 限公
运 用分 子 标 记 技 术 鉴 定 川 贝母 的 真 伪 ， 以克 服 目前 仅 依 据 形 态 、 显微 特征 及 理 化进 行 鉴 别 的 不足 。 关 键 词 ：川 贝母 ； Ｄ Ｎ Ａ； Ｐ Ｃ Ｒ 】 Ｂ
【 文章编号 】 １ ６ ７ ２ — ８ ６ ０ ２ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ３ — ０ １ ９ ６ 一 Ｏ １
中 医中药
Ｆ 家 庭 心 理 医 生 ａ ｍ ｉ ｌ ｙ ｐ ｓ ｙ ｃ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｄ ｏ ｃ ｔ ｏ ｒ
２ ０ １ ４年３月第３期
中药 材 川 贝母 的 Ｄ Ｎ Ａ分 子标 记 鉴 定 研 究
笪 宁虞 （ 广 西锦 莹药业有 限公 司 广西 南宁 ５ ３ ０ ２ １ ９ ）