碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌耐药性及耐药基因分析

㊃论 著㊃
D O I :10.3969/j
.i s s n .1672-9455.2023.18.009碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌耐药性及耐药基因分析*
侯素君1,尹盟盟1,王均梅1,别海文1,梁永娟1,朱元祺2
1.山东省日照市中医医院检验科,山东日照276800;
2.青岛大学附属医院检验科,山东青岛266003
摘 要:目的 探讨医院碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(C R E )的临床耐药性及耐药表型和基因型,为医院C R E 菌株感染的临床治疗及医院感染暴发的预防和控制提供科学依据㊂方法 收集2020年7月至2023年1月日照市中医医院临床患者标本中分离的77株C R E 菌株,采用全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药敏试验,采用改良碳青霉烯酶灭活试验(m C I M )和乙二胺四乙酸(E D T A )改良碳青霉烯酶灭活试验(e C I M )联合检测碳青霉烯酶表型,采用聚合酶链反应(P C R )扩增耐药基因并进行测序分型㊂结果 77株C R E 菌株主要分离自痰液,其次是尿液㊁胸腔积液;科室来源主要是颅脑外科㊁重症医学科㊁脑卒中监护室㊂C R E 菌株中肺炎克雷伯菌33株,大肠埃希菌15株,阴沟肠杆菌12株,其他细菌17株㊂C R E 菌株对替加环素敏感性为97.4%,阿米卡星为44.2%,复方磺胺甲噁唑为39.0%,对其他抗菌药物的敏感性均低于20.0%㊂m C I M 筛选碳青霉烯酶菌株的灵敏度为95.9%,特异度为100.0%㊂P C R 扩增结果显示49株C R E 菌株携带N D M 基因,24株C R E 菌株携带K P C 基因,1株C R E 菌株携带I M P 基因,3株未检出碳青霉烯酶基因;基因测序比对确定耐药基因亚型分别为b l a K P C -2㊁b l a N D M -1㊁b l a I M P -4㊂结论 C R E 菌株以肺炎克雷伯菌㊁大肠埃希菌㊁阴沟肠杆菌为主,具有较强的耐药性,肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药基因主要为b l a K P C -2㊁大肠埃希菌耐药基因主要为b l a N D M -1,阴沟肠杆菌耐药基因主要为b l a N D M -1,临床需加强C R E 菌株检测,根据药敏试验结果合理选用抗菌药物,防范其在医院内暴发流行㊂
关键词:碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌; 细菌耐药性; 耐药基因
中图法分类号:R 446.5文献标志码:A 文章编号:1672-9455(2023)18-2667-05A n a l y s i s o n d r u g r e s i s t a n c e a n d d r u g r e s i s t a n c e g e n e s o f c a r b a p
e n e m -r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a e b a c t e r i a
*
H O U S u j u n 1,Y I N M e n g m e n g 1,WA N G J u n m e i 1,B I E H a i w e n 1,L I A N G Y o n g j u a n 1,Z HU Y u a n q
i 2
1.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,R i z h a o M u n i c i p a l H o s p i t a l o f T
r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e ,R i z h a o ,S h a n d o n g 276800,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Q i n g d a o U n i v e r s i t y ,Q i n g d a o ,S h a n d o n g 266003,C h i n a A b s t r a c t :O b j
e c t i v e T o e x p l o r e t h e c l i n i c a l d r u g r e s i s t a n c e ,d r u g r e s i s t a n c e p h e n o t y p e s a n d g e n o t y p e s o
f c a r b a p e n e m -r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a e (C R E )b a c t e r i a i n t h e h o s p i t a l s o a s t o p r o v i d e a s c i e n t i f i c b a s i s f o r t h e c l i n i c a l t r e a t m e n t o f C R E b a c t e r i a l s t r a i n s i n f e c t i o n a n d t h e p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l o f t h e C R E b a c t e r i a l s t r a i n s i n f e c t i o n o u t b r e a k s .M e t h o d s S e v e n t y -s e v e n C R E s t r a i n s i s o l a t e d f r o m t h e c l i n i c a l p a t i e n t s s a m p
l e s i n R i z h a o M u n i c i p a l H o s p i t a l o f T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e f r o m J u l y 2020t o J a n u a r y 2
023w e r e c o l l e c t e d ,t h e b a c t e r i a l i d e n t i f i c a t i o n a n d d r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t s w e r e c o n d u c t e d b y t h e f u l l a u t o m a t i c m i c r o b i o l o g
i c a l a n a -l y z e r ,a n d t h e c a r b a p e n a s e p h e n o t y p e w a s d e t e c t e d b y t h e m o d i f i e d c a r b a p e n e n a s e i n a c t i v a t i o n m e t h o d (m C I M )a n d E D T A m o d i f i e d c a r b a p e n e n a s e i n a c t i v a t i o n m e t h o d (e C I M ).T h e d r u g -r e s i s t a n c e g e n e s w e r e a m -p l i f i e d b y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n (P C R )a n d t h e s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d .R e s u l t s S e v e n t y
-s e v e n C R E s t r a i n s w e r e m a i n l y i s o l a t e d f r o m t h e s p u t u m s p e c i m e n ,f o l l o w e d b y t h e u r i n e a n d p l e u r a l e f f u s i o n .T h e d e -p a r t m e n t s w e r e m a i n l y t h e c r a n i o c e r e b r a l s u r g e r y
,i n t e n s i v e c a r e m e d i c i n e a n d s t r o k e i n t e n s i v e c a r e u n i t .A -m o n g t
h e C R E s t r a i n s ,t h e r e w e r e 33s t r a i n s o f K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ,15s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i ,12s t r a i n s o f E n t e r o b a c t e r c l o a c a e a n d 17s t r a i n s o f o t h e r b a c t e r i a .T h e s e n s i t i v i t y o f t h e C R E s t r a i n s t o t i g a c y c l i n e w a s 97.4%,w h i c h t o a m i k a c i n w a s 44.2%,w h i c h t o c o t r i m o x a z o l e w a s 39.0%,a n d w h i c h t o o t h e r a n t i b a c t e r i a l d r u g s w a s l o w e r t h a n 20.0%.T h e s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o f m C T M f o r s c r e e n i n g c a r b a p e n a s e s t r a i n w e r e 95.9%a n d 100.0%,r e s p e c t i v e l y .T h e P C R a m p
l i f i c a t i o n r e s u l t s s h o w e d t h a t 49s t r a i n s o f C R E b a c t e r i a c a r -r i e d t h e N D M g e n e ,24s t r a i n s o f C R E b a c t e r i a c a r r i e d K P C g e n e ,1s t r a i n o f C R E b a c t e r i u m c a r r i e d I M P g e n e
,㊃
7662㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n ,S e p
t e m b e r 2023,V o l .20,N o .18*
基金项目:青岛大学附属医院 临床医学+X 科研项目(2019-3399);山东省日照市中医医院2021年度院级科研立项项目(R Z Z Y 2021L C -
09
)㊂ 作者简介:
侯素君,女,副主任技师,主要从事临床病原微生物耐药监测及耐药机制方面的研究㊂Copyright ©博看网. All Rights Reserved.
a n d3s t r a i n s d i d n o t d e t e c t c a r
b a p e n e n a s e g e n e.T h e g e n e s e q u e n
c i n g c o m p a r i s o n
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e t e r m i n e d t h a t t h e s u b t y p e s o
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g r e s i s t a n c e g e n e w e r e b l a K P C-2,b l a N D M-1a n d b l a I M P-4.C o n c l u s i o n T
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i n s a r e m a i n l y K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e,E s c h e r i c h i a c o l i a n d E n t e r o b a c t e r c l o a c a e w i t h s t r o n g d r u g r e s i s t a n c e.T h e c a r b a p e n e m r e s i s t a n t g e n e o f K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e i s i s m a i n l y b l a K P C-2,w h i c h o f E s c h e r i c h i a c o l i i s m a i n l y b l a N D M-1,a n d w h i c h o f E n t e r o b a c t e r c l o a c a e i s m a i n l y b l a N D M-1.C l i n i c s h o u l d s t r e n g t h e n t h e C R E s t r a i n s m o n i t o r i n g.T h e a n t i b a c t e r i a l d r u g s s h o u l d b e r e a s o n a b l y s e l e c t e d a c c o r d i n g t o t h e d r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t r e s u l t s t o p r e v e n t i t s o u t b r e a k s a n d e p i d e m i c i n t h e h o s p i t a l.
K e y w o r d s:c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a e;b a c t e r i a l r e s i s t a n c e;d r u g r e s i s t a n c e g e n e
当前,细菌耐药已成为全球公共健康领域的重大挑战,其中尤以碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(C R E)引起的感染形势最为严峻,碳青霉烯类抗菌药物包括亚胺培南㊁美洛培南和厄他培南等,是治疗多重耐药革兰阴性杆菌所致感染最有效的抗菌药物之一㊂随着该类药物在临床的广泛应用,肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率呈逐年快速上升趋势[1]㊂耐药细菌感染致住院时间延长㊁费用增加㊁病死率增高,在社区或医院中可引起散发,交叉传播,甚至导致暴发流行,对婴幼儿㊁老年人和免疫缺陷者的威胁巨大㊂因此,探讨医院C R E菌株的耐药表型和基因型,可以为医院C R E菌株感染的临床治疗和医院感染暴发的防控提供科学依据㊂
1材料与方法
1.1菌株来源收集2020年7月至2023年1月日照市中医医院临床患者标本中分离的77株C R E菌株,剔除同一患者同一部位重复分离的菌株㊂
1.2质控菌株大肠埃希菌A T C C25922㊁肺炎克雷伯菌A T C C700603㊁大肠埃希菌A T C C700323㊁大肠埃希菌A T C C35218㊁肺炎克雷伯菌A T C C B A A1705㊁肺炎克雷伯菌A T C C B A A2146均由省临床检验中心提供㊂
1.3仪器与试剂 V I T E K2C o m p a c t全自动细菌鉴定及药敏分析仪(法国生物梅里埃公司)㊁L a b n e t C1301-230E U型手掌形离心机(美国L a b n e t公司)㊁B i o-R a d M y C y c i e r型P C R扩增仪(美国B i o-R a d公司)㊁E p p e n d o r f5415R型台式高速离心机(德国E p-p e n d o r f公司)㊁北京六一D Y C P-31D N型琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一生物科技有限公司)㊁B i o-R a d凝胶成像仪(美国B i o-R a d公司)㊁B i o-R a d电泳槽(美国B i o-R a d公司),2ˑA c c u r a t e T a q预混液(湖南艾科瑞生物工程有限公司),D L2000D N A M a r k e r(日本T a K a R a公司),琼脂糖(日本T a K a R a公司),4S G e l-r e d核酸染料(香港B B I L i f e S c i e n c e C o r p o r a t i o n), W i z a r d G e n o m i c D N A P u r i f i c a t i o n K i t(美国P r o-m e g a公司),胰蛋白胨大豆肉汤培养基(T S B,杭州滨和微生物试剂公司),E t e s t条(温州市康泰生物科技有限公司),头孢哌酮/舒巴坦㊁替加环素药敏纸片均为英国O x i d公司产品㊂
1.4方法
1.4.1菌株鉴定及药敏试验菌株分离与培养严格按照‘全国临床检验操作规程“(第4版)[2]进行,使用V I T E K2C o m p a c t全自动微生物分析仪进行菌株鉴定及药敏试验㊂药敏试验结果判断根据美国临床和实验室标准协会(C L S I)最新版标准判断,收集临床标本中分离的肠杆菌目细菌药敏试验报告中亚胺培南㊁美洛培南最小抑菌浓度(M I C)ȡ4μg/m L或厄他培南ȡ2μg/m L(已用E t e s t条复核)的菌株[3]㊂
1.4.2碳青霉烯酶表型确证试验改良碳青霉烯酶灭活试验(m C I M)操作步骤:参照C L S I2020年版M100操作标准,用1μL接种环挑一满环菌落,加入2 m L T S B肉汤中乳化,振荡10~15s,每管放入1张含10μg美洛培南的无菌纸片,确认纸片浸没于菌悬液中,35ħ孵育4h,将美洛培南纸片贴于已涂布大肠埃希菌A T C C25922悬液的MH平板,35ħ孵育18~ 24h,量取抑菌圈直径㊂乙二胺四乙酸(E D T A)改良碳青霉烯酶灭活试验(e C I M)操作步骤:另取一支试管,加入2m L T S B肉汤,再加入20μL0.5m o l/L E D T A溶液混匀,E D T A浓度最终为5mm o l/L㊂其余步骤同m C I M㊂m C I M判断标准:美洛培南抑菌圈直径为6~15mm或直径16~18mm但抑菌圈内有散在菌落时,为碳青霉烯酶阳性;抑菌圈直径ȡ19 mm,为碳青霉烯酶阴性;抑菌圈直径为16~18mm 或直径为19mm但抑菌圈内有散在菌落,则无法判断是否存在碳青霉烯酶,为碳青霉烯酶不确定[4]㊂e C I M判断标准:e C I M与m C I M结果比较,美洛培南抑菌圈直径相差ȡ5mm为金属β-内酰胺酶阳性,美洛培南抑菌圈直径相差ɤ4mm为金属β-内酰胺酶阴性,待测菌株产丝氨酸蛋白酶㊂
1.4.3基因检测煮沸裂解法提取D N A模板,采用P C R扩增碳青霉烯酶耐药基因,扩增条件为94ħ预变性5m i n;94ħ变性30s,52ħ退火40s,72ħ延伸50s,共35个循环;72ħ再延伸10m i n㊂扩增后产物取10μL通过1.5%琼脂凝胶电泳30m i n,最终在凝胶成像仪上观察结果㊂引物信息见表1,引物序列查阅文献[5]获得,由上海生工生物工程有限公司合成引物,并进行相应的测序分析,与目的基因㊁阳性对照条带位置的扩增产物送上海生工生物工程有限公司完成测序,基因序列在h t t p://b l a s t.n c b i.n l m.n i h.
g o v/b l a s t.c g i进行比对,确定耐药基因亚型㊂
1.5统计学处理采用全国细菌耐药监测网提供的W h o n e t5.6软件收集药敏试验结果,使用S P S S21.0统计软件进行分析,计数资料以例数或百分比表示,比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义㊂
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表1 P C R 扩增碳青霉烯类耐药基因引物
引物引物序列(5'-3'
)目的基因产物长度(b p )N D M -F G G T T T G G C G A T C T G G T T T T C
b l a N D M 621N D M -R
C G G A A T G G C T C A T C A C G A T C I M P -F
G G A A T A G A G T G G C T T A A Y T C T C b l a I M P 232I M P -R
G G T T T A A Y A A A A C A A C C A C C K P C -F m C G T C T A G T T C T G C T G T C T T G
b l a K P C 798K P C -R m C T T G T C A T C C T T G T T A G G C G V I M -F
G A T G G T G T T T G G T C G C A T A b l a V I M 390V I M -R
C G A A T G C G C A G C A C C A G O X A -48-F
G C G T G G T T A A G G A T G A A C A C b l a O X A -48
438
O X A -48-R
C A T C A A G T T C A A C C C A A C C G
2 结 果2.1 C R E 菌株的种类与临床分布 77株C R E 临床
分离株中,肺炎克雷伯菌33株(42.9%)
㊁大肠埃希菌15株(19.5%)㊁阴沟肠杆菌12株(15.6%)
㊁弗劳地枸橼酸杆菌7株(9.1%)
㊁雷氏普罗威登斯菌3株(3.9%)㊁产气肠杆菌3株(3.9%)
㊁奇异变形杆菌2株(2.6%)㊁产酸克雷伯菌2株(2.6%)㊂77株C R E 菌株来源标本以痰液和尿液为主,其中分离自痰液33
株(42.86%)㊁尿液30株(38.96%)
㊁胸腔积液6株(7.79%)㊁穿刺液5株(6.49%)㊁脑脊液2株(2.60%)㊂77株C R E 菌株的科室分布:颅脑外科23株,重症医学科10株,脑卒中监护室9株,急诊科6株,泌尿外科6株,肺病科5株,肝胆胰脾科3株,胸外科3株,脑病科2株,心血管内科2株,骨六科2株,康复科2株,髋膝骨科1株,风湿肾病科1株,妇科1株,肿瘤科1株㊂
2.2 C R E 菌株药敏试验结果 77株C R E 菌株中超
广谱β-内酰胺酶(E S B L s )的检出率为100.0%,
对替加环素敏感性最高(97.4%)
,其次为阿米卡星(44.2%)㊁复方磺胺甲噁唑(39.0%),对其余抗菌药物的敏感性均低于20.0%㊂大肠埃希菌对阿米卡星的敏感性为80.0%,肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌对阿米卡星的敏感性分别为48.5%和50.0%㊂见表2㊂
表2 C R E 菌株对常用抗菌药物的药敏试验结果(%)
抗菌药物总计(n =77)耐药敏感肺炎克雷伯菌(n =33)耐药敏感大肠埃希菌(n =15
)耐药敏感阴沟肠杆菌(n =12)耐药敏感阿米卡星55.8
44.251.5
48.520.0
80.050.0
50.0头孢唑啉100.00.0
100.00.0
100.00.0
100.00.0头孢吡肟89.610.487.912.180.020.091.78.3头孢替坦94.85.290.99.193.30.7100.00.0头孢呋辛100.0
0.0100.0
0.0100.0
0.0100.00.0妥布霉素83.116.969.730.386.713.391.78.3庆大霉素79.219.963.636.480.020.091.78.3亚胺培南100.00.0
100.00.0100.00.0
100.00.0
氨曲南80.519.597.03.020.080.083.316.7美洛培南100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0呋喃妥因98.81.293.96.154.446.6100.00.0头孢曲松100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0头孢他啶100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0环丙沙星98.71.3100.00.0
93.30.7100.00.0左氧氟沙星89.610.484.815.286.713.391.78.3复方磺胺甲噁唑61.0
39.036.463.680.0
20.050.050.0氨苄西林100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0替加环素2.697.40.0
100.00.0100.00.0
100.0头孢哌酮/舒巴坦96.13.993.9
6.193.30.7100.00.0哌拉西林钠/他唑巴坦100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0阿莫西林/克拉维酸
100.0
0.0100.0
0.0100.0
0.0100.0
0.02.3 耐药基因扩增结果 77株C R E 菌株中74株产
碳青霉烯酶,3株未检出㊂其中,33株肺炎克雷伯菌中20株携带K P C 基因,12株携带N D M 基因,1株未
检出碳青霉烯酶,主要产K P C (60.6%);15株大肠埃
希菌中12株携带N D M 基因,3株携带K P C 基因,
主要产N D M (80.0%);12株阴沟肠杆菌携带N D M 基
因(100.0%);7株耐弗劳地枸橼酸杆菌携带N D M 基因(100.0%);3株雷氏普罗威登斯菌中2株携带
N D M 基因,1株未检出碳青霉烯酶;3株产气肠杆菌中1株携带N D M 基因,1株携带K P C 基因,1株未检出碳青霉烯酶;2株产酸克雷伯菌中1株携带N D M
基因,1株携带I M P 基因;2株奇异变形杆菌携带N D M 基因㊂碳青霉烯酶基因型中N D M 占66.2%(49/74),K P C 占32.4%(24/74),I M P 占1.4%(1/74)㊂琼脂电泳图见图1~3㊂2.4 碳青霉烯酶表型试验结果 74株携带碳青霉烯酶基因的C R E 菌株,其中71株m C I M 试验阳性,3株m C I M 试验均阴性,m C I M 筛选碳青霉烯酶菌株的灵敏度为95.9%,特异度为100.0%㊂m C I M 阳性菌株中,肺炎克雷伯菌32株,大肠埃希菌15株,
阴沟肠㊃
9662㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n ,S e p
t e m b e r 2023,V o l .20,N o .18Copyright ©博看网. All Rights Reserved.
杆菌12株,
弗劳地枸橼酸杆菌7株,奇异变形杆菌2株,产气肠杆菌1株,
产酸克雷伯菌1株,雷氏普罗威登斯菌1株㊂m C I M 结合e C I M 试验初步判断产金属
β
-内酰胺酶51株(m C I M 阳性,e C I M 阳性),产丝氨酸蛋白酶20株(m C I M 阳性,e C I M 阴性)
㊂ 注:M 为D L 2000D N A 标志物;1为b l a N D M 阳性对照;2为b l a N D M
阴性对照;3~16为临床菌株b l a N D M
阳性㊂图1 P C R 扩增菌株b l a N D M
基因的电泳图
注:M 为D L 2000D N A 标志物;1为b l a K P C 阳性对照;2为b l a K P C
阴性对照;3~17为临床菌株b l a K P C
阳性㊂图2 P C R 扩增菌株b l a K P C
基因的电泳图
注:M 为D L 2000D N A 标志物;1为b l a I M P 阴性对照;2为b l a I M P
阳性对照;4为临床菌株b l a I M P 阳性;3㊁5~12为临床菌株b l a I M P
阴性㊂图3 P C R 扩增菌株b l a I M P 基因的电泳图
2.5 基因测序 耐药基因扩增结果将与目的基因㊁
阳性对照条带位置的扩增产物送上海生工生物工程
有限公司完成测序,基因序列在h t t p
://b l a s t .n c b i .n l m.n i h .g o v /b l a s t .c g
i 进行比对,确定耐药基因型为b l a K P C -2㊁b l a N D M -1㊁b l a I M P -4㊂3 讨 论
C R E 是当前最受关注的耐药威胁之一,
我国C R E 的流行情况也比较严重㊂中国C H I N E T 细菌耐
药性监测数据表明,2005年碳青霉烯类抗菌药物对肠
杆菌目细菌保持着较高的抗菌活性,耐药率低于2%;到2010年,
耐药率明显上升,达到5%;肺炎克雷伯菌的耐药率已高达10%[6
]㊂2018年肺炎克雷伯菌对碳
青霉烯类抗菌药物的耐药率全国平均为10.1%[7]
,
2021年肺炎克雷伯菌耐药率上升到23.1%[8]
,
肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物最常见的耐药机制
为产碳青霉烯酶[9]
㊂因此,快速㊁准确地检测本院耐
药菌是否产碳青霉烯酶,了解C R E 菌株基因分型对于临床治疗和医院感染控制至关重要㊂
本研究77株C R E 菌株中,
肺炎克雷伯菌占42.9%,大肠埃希菌占19.5%,阴沟肠杆菌占15.6%,其他肠杆菌目细菌占22.0%,与陆书华等[10]㊁崔超琼等[11]
的研究结果接近;主要碳青霉烯酶
基因型中N D M 占66.2%(49/74),K P C 占32.4%
(24/74),I M P 占1.4%(1/74)㊂C R E 菌株主要分离自痰液㊁尿液㊁胸腔积液,也可分离自脑脊液㊁血液㊁穿刺液等,说明耐药株引起的感染并不仅限于呼吸㊁泌尿系统,还可能引起颅内㊁血流㊁胸腔等多部位感染,其感染的广泛性应引起临床重视㊂C R E 菌株科室分布主要是颅脑外科㊁重症医学科㊁脑卒中监护室,这与重症监护室患者病因的复杂性㊁病情危重㊁免疫力低下㊁糖皮质激素和高效广谱抗菌药物长期应用,以及侵入性操作治疗较多有关㊂本研究药敏试验结果显示,77株C R E 菌株对青霉素类㊁
头孢菌素类㊁头霉素类耐药率均为90%以上,与王珍珍等[12
]研究结果一致,临床应慎重经验用药,对替加环素㊁阿米卡星㊁复方磺胺甲噁唑耐药率分别为2.6%㊁55.8%㊁
61.0%[13
],临床可选择这些药物治疗感染者㊂按照A m b l e r 分子分类方法可将碳青霉烯酶分为3类:(1)A 类丝氨酸碳青霉烯酶,以K P C 为主,该酶活性可被阿维巴坦抑制,产酶菌株通常仅对替加环
素㊁多黏菌素或头孢他啶/阿维巴坦敏感;(2)B 类金
属β-内酰胺酶,以N D M 型金属酶为主,该酶活性不能被阿维巴坦抑制,产酶菌株通常仅对替加环素㊁多黏
菌素敏感,少数菌株对氨曲南敏感;(3)D 类丝氨酸碳
青霉烯酶,以O X A -48为主,常见于儿童患者分离的肺炎克雷伯菌,该酶活性可被阿维巴坦抑制,产酶菌株通常仅对替加环素㊁多黏菌素或头孢他啶/阿维巴坦敏感㊂C R E 感染的治疗具有挑战性,应根据药敏试验结果㊁耐药表型或基因分型㊁感染的严重程度,选择有效的治疗方案㊂本研究利用C L S I 推荐的m C I M 和e C I M 试验联合检测碳青霉烯酶表型,m C I M 筛选碳青霉烯酶菌株的灵敏度为95.9%,
特异度为100.0%[1
],与之符合,结合e C I M 试验初步判断产金
属β-内酰胺酶51株,产丝氨酸蛋白酶20株㊂m C I M 试验操作简单,成本低,不需要特殊试剂,灵敏度和特异度高,适合所有微生物室开展㊂m C I M 与e C I M 联合检测筛选碳青霉烯酶表型,对临床选择用药具有重要意义㊂
P C R 扩增结果显示,77株C R E 菌株中74株产
㊃
0762㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n ,S e p
t e m b e r 2023,V o l .20,N o .18Copyright ©博看网. All Rights Reserved.
碳青霉烯酶,3株未检出,而E S B L s的检出率为100.0%,可能为高产头孢菌素酶(A m p C)或高产E S-B L s合并外膜孔蛋白缺失或变异以及细菌外排泵系统改变所致[14]㊂目前常见的碳青霉烯酶为K P C㊁V I M㊁N D M㊁I M P和O X A,国内以K P C㊁N D M和I M P为主[15]㊂本研究77株菌株主要流行的碳青霉烯酶基因型依次为N D M(66.2%)㊁K P C(32.4%)和I M P(1.4%),以N D M和K P C为主[16]㊂河南部分地区和海南省5家综合医院收集的C R E菌株中,主要的耐药基因型也是N D M[17-18],本研究耐药基因K P C 的检出率低于N D M,77株C R E菌株中,仅有1株耐碳青霉烯产酸克雷伯菌检出I M P基因㊂97.0% (32/33)的肺炎克雷伯菌㊁100.0%(15/15)的大肠埃希菌,100.0%(12/12)的阴沟肠杆菌携带碳青霉烯酶基因㊂碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌主要携带K P C-2基因[19],碳青霉烯类耐药大肠埃希菌和阴沟肠杆菌主要携带N D M-1基因,与陆书华等[10]报道一致㊂K P C和N D M耐药基因均可由质粒介导,通过菌株自身克隆以及不同菌种间水平转移,是C R E流行激增的主要原因㊂K P C-2和N D M-1可水解绝大多数β-内酰胺药物,包括碳青霉烯类,不同之处在于K P C-2为丝氨酸蛋白酶,水解氨曲南,能被新型酶抑制剂阿维巴坦所抑制,而N D M-1为金属酶,不水解氨曲南,不被阿维巴坦㊁韦博巴坦等抑制㊂
总之,C R E呈现广泛耐药甚至全耐药的特征,使临床抗感染治疗面临无药可用的困境,导致感染患者病死率高㊂实验室应快速鉴别产碳青霉烯酶菌株,选择早期快速筛查的方法,加快开展联合药敏试验,有效降低C R E感染患者的病死率[20]㊂临床医生应掌握医院C R E临床分布特征及耐药基因㊁细菌耐药情况,根据药敏试验结果合理选用抗菌药物;院感防控部门需加强监督检查,共同遏制C R E菌株在不同患者和不同区域间流行播散,降低医院C R E感染发生率㊂参考文献
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