抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则(中文版)

抗药抗体免疫原性分析方法学验证指点准绳之杨
若古兰创作
摘要：
几乎所有的生物制药产品都会惹起必定的抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）反应，抗药抗体反应可能会降低药物疗效或导致严重的不良反应.在人体内，抗药抗体通常不会惹起明显的临床反应.但是对于某些医治性蛋白质，抗药抗体反应能惹起各种临床的不良反应，包含暖和事件及严重不良事件.临床前研讨标明，抗药抗体能对药物流露、药物毒性感化、药物代谢动力学、药物效应动力学等形成影响.是以医治性蛋白质的免疫原性惹起了临床大夫、药企及监管机构的留意.为了评估生物药物分子的免疫原性，和将实验结果与临床事件联系起来，在临床前研讨和临床研讨中，很有须要开发可靠的能够无效评估抗药抗体反应的实验方法.这里方法学验证显得尤其次要，而且方法学验证是药物上市申请必不成少的.现行的监管文件对于免疫分析方法的验证的指点相当无限，特别是缺乏有关免疫原性分析方法的验证的指点.是以，本文对抗药抗体免疫分析方法的验证提供科学的建议.在现有的关于生物分析的规范性文件的基础上加入独特的功能验证.笔者建议采取实验和统计学的方法进行免疫分析的方法学验证.这些建议被视
为最好的例子，旨在促进全部医药行业构成一个更加统一的抗体检测方法.
1．简介：
生物制药产品包含氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸，普通通过人细胞系、哺乳动物细胞或细菌进行表达，比惯例的小分子药物更大（普通大于1~3KD）.因为以上特性，生物制药产品惹起免疫反应的潜力更大.生物制药的免疫原性与产品的内在身分（种属特异性表位、外源性、糖基化程度、聚合或变性程度、杂质和制剂）、内在身分（给药途径、慢性或急性给药、药代动力学及内源性当量）、患者身分（本身免疫性疾病、免疫按捺、和替代疗法）相干.
抗药抗体反应可能会导致严重的临床症状，包含过敏、本身免疫和分歧的药代动力学特征（例如，药物中和、生物分布异常和药物清除率加强等均可能会使药物的的疗效发生改变）.药物惹起的免疫反应是药物平安性和无效性的次要目标，这也是监管机构、生产企业、临床大夫和患者共同关注的.是以，美国食品药品监督管理局和欧盟、日本、加拿大、澳大利亚等国家的监管机构均请求通过药理学或毒理学相干的方法对抗药抗体进行评估.免疫原性与临床症状之间的相干性的研讨依附于临床前研讨和临床研讨中对于抗药抗体的客观检测和表征.是以免疫原性生物分析
方法在用于检测研讨样本之前应进行适当的开发及验证.已有出版物提供了关于抗药抗体检测和表征的计谋、方法开发及优化等方面的指南.方法学验证是对分析方法的评价，通过特定的实验室方法标明采取的分析方法适用于呼应的检测请求.具体到抗药抗体的检测方法，验证就是指证明该方法能可靠的（例如分歧性和反复性）在复杂的生物基质（血清或血浆）中检测出低量的药物特异性抗体.方法学验证应当通过事后研讨阶段和研讨阶段两个阶段进行，事后研讨阶段是指在分析样品之前的工作，研讨阶段是指样品的分析工作，事后研讨阶段和研讨阶段对于标明分析方法的无效性和可控性同等次要.本文次要介绍抗药抗体免疫分析方法验证的次要功能特征，推荐方法学验证相干的方法和措施.本指南该当被视为最好实践范例，考虑到具体实际分析方法时，在坚持科学合理性和客观性的情况下，也能够采纳替代方法.若采取替代方法，建议与监管机构进行充分讨论.以细胞功能为基础的中和抗药抗体生物检测和细胞介导的免疫分析不在本指南的讨论范围内.
2.1 抗药抗体检测
临床和非临床研讨通常是通过对医治惹起的抗药抗体反应的检测和表征来评估药物的免疫原性.目前可通过多种方法可用于抗药抗体的检测，包含酶联免疫法（ELISA）、放
射免疫检定法（RIA）、放射免疫沉淀法（RIPA）、概况等离子体共振（SPR）、电化学发光法（ECL）.每一种检测方法均有其长处和局限性，在比来的文章中已进行过讨论[8,14].不管是采取何种方法，在方法开发和优化后均应进行正式的方法学验证，以包管该方法适合呼应的检测请求.是以可以猜测，本指南的验证建议适用于大部分的抗药抗体免疫检测.研讨人员应根据检测零碎的特点确定合适的方法学验证方案.
临床研讨中抗药抗体的检测和表征通常包含四种分歧类型的方法.抗药抗体检测试验通常包含筛选试验和特异性确证试验，表征试验通常包含抗体滴定和中和抗体检测[10].利用到具体研讨样本时，抗药抗体分析试验须要两个关键决策参数，分别为筛选试验的筛选临界点（screening cut point）和特异性确证试验的特异性临界点（specificity cut point）.筛选临界点有助于抗药抗体检测结果的分类，高于筛选临界点为活性样品（活性样品通常为潜在阳性样品），低于临界点为无活性样品.活性样品通过特异性确证试验（如竞争性药物按捺旌旗灯号通路）检测是阳性（特异性活性）还是阴性（非特异性活性）.特异性临界点为按捺旌旗灯号通路所需的样品量，也就是具体药物的抗药抗体，须要通过试验确定.
抗药抗体的检测方法通常是非定量试验（有时是半定量试验），因为没有可用的尺度化的物种特异性的抗药抗体作为校订尺度品[15].阳性对照普通都是内部开发的（例如单克隆抗体或高免血清的多克隆抗体），不成能将受试者检测到的所有抗药抗体作为阳性对照.如果筹办使用质量单位标示抗药抗体水平，那应当证明尺度品和试验样品的平行性，以确定样品的浓度的精确性[8,10].若未证明样品与尺度品间的平行性，则精确性是可疑的.滴定法是另一种评估抗体水平的方法，该方法分歧样品浓缩间容易缺乏平行性.然而，值得留意的是已有研讨标明，滴定法适用于抗体水平的评估.几十年来，临床上感染、本身免疫疾病的诊断和医治和预防接种等都采取这一方法[16~22].滴定法比较抗药抗体反应
更为简便且所需的验证工作更少，因为其不须要再对分歧产品的抗药抗体与尺度品间的平行性进行具体描述与证明.此外质量单位法每当尺度品品改变时均须要进行从头验证.综上所述，两种方法都没法提供精确的定量数据.是以，援助商建议采取绝对浓度（质量单位）或滴度暗示抗药抗体水平.某些监管机构会更倾向于使用滴度单位.滴度是仍能发生阳性结果的最大浓缩倍数的倒数.
在方法的开发和优化阶段，应先确定方法并进行记录，例如选择所需的试剂、最好浓度、预期样品所需的最大浓缩倍数等.这些须要研讨人员在事后研讨阶段进行简单或反复确证.本文假定以部属性在验证之前已被确证：免疫分析方案及方法设计，分析基质的类型，最大浓缩倍数（MRD）、试剂的最好浓度、酶标板的均匀性评估（如地位的影响、漂移等）.监管机构可能会请求提供相干的数据撑持.在方法的开发和优化阶段，通过对对照品的检测，对方法的变异性有一个初步的认识.
2.2 统计学的利用
降低验证过程中的客观感化是本文的重点之一.为了确保实验的客观性必须依附于统计手段.因为大多数研讨者没法获得统计学家的服务，本文提供了简单且足够严酷和无效的统计学方法.所涉及的统计计算都可以采取商业统计软件进行计算，计算过程不须要经验丰富的统计学家.然而，如果有统计学家协助进行验证明验设计和数据处理的话，统计学的利用可能会比本文提供的更为严酷和无效.
临床和非临床研讨中在开始样品生物分析前的验证试验称为预研讨验证，它次要从数学和可定量方面描述分析方法的功能特征[8].预验证(prevalidation)是指研讨工作启动前的筹备工作，两者不克不及混淆.另一方面，在研讨验证是指
监控全部方法使用过程的功能特征，以确保方法的无效性和数据的可靠性.通过完好的方法开发和优化后，分析方法应具备验证的条件，如优化试验数据标明检测方法具有潜在的可靠性和适用于呼应的检测请求.方法的可靠性依附于分析设备和计算机零碎的正常运转和试验人员的熟练程度.实质上，
分析方法是包含多个身分的全体零碎而不但仅是试剂而已.验证方法应包含零碎适用性，这属于在研讨验证范畴.
建议开始预研讨验证之前拟定呼应的验证明验方案或验证明验尺度操纵程序（SOP），验证明验方案应说明该方法的预期目的、分析方法的具体说明、待验证的功能特征和精密度、稳健性、波动性和耐用性的预期验收尺度.此外建议在验证明验方案中加入适当的实验细节和数据处理步调，如许可觉得验证人员提供一个明确的指点以确保更好的处理数据.
抗药抗体检测应建立呼应的验收尺度，有助于确保在研阶段的试验的无效性.为此，应通过对验证过程中获得的数据进行统计评价后建立用于质控的零碎适用性尺度（可接受范围）.此外，在研验证阶段两头精密度试验，对照品和样品检测也应有呼应的验收尺度.当在研验证阶段的分析数据不符合验收尺度时，应拒绝该数据.在预研验证阶段不该
建立验收尺度，因为这可能会使某些验证数据被排除，导致不克不及精确估计分析误差.除了可明缘由（如技术误差）、成心或成心偏离实验方案所得分析数据应被剔除外，预研阶段的所有分析数据都应计算在内.目前，美国食品药品监督管理局（FDA）、国际调和会议（ICH）和美国药典的指点性文件论述了定量检测的分析验证应研讨的普通功能特点[23~25].因为抗药抗体免疫分析属于半定量检测，所以有些请求其实不不适用.对于抗药抗体免疫分析方法学验证，应对以下9项参数进行测定：
1. 筛选临界点
3.灵敏度*
4.零碎适用性控制（QCs）验收尺度
5.耐药性*
8.波动性*
9.耐用性（有条件时）
如果分析方法的开发和优化过程已充分说明并得到适当记录，在预研验证阶段不须要对以上标有*的参数进行反复验证，尽管验证陈述中应提供相干的数据.如果终极的方法有所变动的话，预研验证阶段应从头测定.
抗药抗体检测方法开发阶段的预期用处和产品上市后的用处可能会分歧.例如，在开发初期只要一个分析人员进行试验，开发工作完成后和上市后可能会有多个分析人员进行试验.全部产品生命周期的验证请求应随着检测方法利用的改变而改变.然后，在药物申请期间还是应对以上列出的参数进行验证.
传统分析方法的浓缩线性测试不适用于抗药抗体检测.当使用滴度标示抗药抗体反应时，须要使用阳性对照，或者最好使用累积抗药抗体阳性样品，在合理浓缩范围内不出现异常非线性.通常，在方法开发阶段都会包含最大浓缩浓度（MRD）的选择，验证阶段不须要进行反复测定.如果出现前带效应，建议选择一个不受前带效应影响的MRD，或者采取多种浓缩样品.浓缩线性信息有助于设计零碎适应性质量控制.
筛选临界点定义为筛选试验的呼应水平，呼应值高于该临界点的样品为活性样品（或者称为潜在阳性），呼应值低于该临界点的样品为阴性样品.一个无效的筛选临界点须要在预研讨验证阶段对一些列样品测定值进行零碎性的统计分析确定，所使用的样品请求来自代表药物使用目标群体或受试者.
当免疫分析的方法存在错误风险时，筛选试验宁可出现假阳性也要防止假阴性[8,10].如果筛选试验中不克不及识别出活性样品，应怀疑该方法检测低阳性样品的能力.约5%的筛选试验的阳性结果为假阳性，从而包管可以检测出低阳性样品[8].在实践中，假阳性结果总比没有阳性结果好（如假阳性率可能不等于5%）.
3.1.1 筛选临界点的类型
可以利用于在研验证阶段的筛选临界点共有三种：固定临界点、浮动临界点、动态临界点.
（a）固定临界点：
预研验证阶段确定固定临界点，然后利用于在研验证阶段.固定临界点用于测试样品的分析，直到须要从头验证或改变（如测定方法发生关键变更、转移到另一个实验室进行试验或仪器升级等）.固定临界值在一个目标人群的同一研讨中或多目标人群的各研讨间是固定的.当预研讨阶段的全部试验的均值相等、方差齐性时，采取固定临界点.
（b）浮动临界点
浮动临界点有两种计算方法，分析过程中数据须要进行对数（Log）转换时，通过预研阶段确定的特定归一化因子
乘以在研阶段的生物布景计算而得；分析过程无对数转换时，计算方法归一化因子加上生物布景，生物布景可以由阴性对照（由样品的基质构成，抗药抗体反应为阴性）、分析浓缩剂或预处理受试者样品（个体特异性临界点）标示.浮动临界点可所以每一次试验每一块板（每一次试验中的若干块板）所特有的或每一个受试者所特有的（使用受试者的预处理/基线样本结果）.如果采取个体特异性临界点，须要在同一块板上检测预处理样品和处理后样品（或至多在同一试验中检测）.因为浮动临界点的确定过程须要对预研讨验证的数据进行方差估计，所以分歧试验间的结果应表示出方差齐性.采取阴性对照进行归一化时，应确保阴性对照结果能代表目标人群的药物初治基质样品的结果，例如通过验证阴性对照均值和生物基质样品均值在全部试验中是相干联的.如果均值相干，阴性对照均值适用于计算浮动临界点.如果均值不相干，则使用浓缩液或预处理样品结果进行归一化处理更为合理.
（c）动态临界点、
同一试验的分歧板之间、同一研讨的分歧试验间或分歧研讨间的动态临界点均分歧.动态临界点的确定不须要预研讨阶段的方差估计.这一特征将动态临界点和浮动临界点区别开来.只要当分歧试验间的结果方差有明显性差别时，才
使用动态临界点.实际使用时，动态临界点的限制性身分是每次试验都须要大量的样本数才干确定临界点.建议优先采取固定临界点或浮动临界点.如果试验间的均值或方差存在差别，建议在采取动态临界点之前进步前辈行差别来源调查.例如，若果差别来源于分析员或设备，则采取分析员或设备的固定临界点或浮动临界点
代替动态临界点.因为动态临界点是一种不罕见的非惯例方法，建议谨慎拟定该临界点，最好能与监管机构进行充分沟通.
3.1.2 评估临界点的样品
建议从适当的人群中抽样用于分析临界点的评估.有时候须要在开始预研讨验证试验之前从目标疾病人群中获得样品基质是不实际的，甚至是不成能的.是以，普通从药物初治健康受试者的样本中进行评估，并确立一个起始临界点.该方法适用于于临床I期的研讨.当临床研讨开展到临床II 期当前，即可得到目标疾病患者的样本，应当对分歧的目标人群从头评估临界点.如果目标人群和正常意愿者的呼应值的平均值和方差相当，可以使用同一个临界点.如果没有可比性，则须要采取目标疾病特异性的临界点.
为了确定临界点，在验证阶段应分析足够数量的样本，如许才干对生物和分析变异进行无效的统计学评估.通常在临床研讨中，须要分析超出50个独立受试者的样本.非临床研讨至多须要15个样品.不该使用混合基质样品进行临界点评估，因为从混合样品中测试反复的样品，检测的只是分析变异而不是生物变异.建议采取平衡实验设计无效评估潜在的变异性来源（see Appendix A）.如果将有多个分析员在研讨过程进行分析样品操纵，那么在预研讨验证阶段应至多包含两位分析员.如果研讨过程中只要一个分析员进行样品分析，而这个分析员与验证阶段的分析员分歧，预研讨验证阶段也应至多包含两位分析员.是否须要对同一样品进行反复试验取决于在研验证的陈述方式（例如在微量滴定板中进行两个复孔或三个复孔）.
3.1.3 排除异常值
应确认药物初治患者的偶然活性样本，以确保药物的特异性.在这一点上，确证临界点将不克不及真实的确认阳性，此时应当使用科学的判断方法，应排除没法确定是否为偶然活性样本.在分析临界点的统计学评估时应去除抗药抗体阳性样品和统计学异常样品（样品呼应值过高或过低）.因为下部极端异常值通常会使差别性动摇从而影响临界点，所以该当排除.去除较高或较低异常值会得到一个较
低的临界点，通常会添加假阳性率而变得更为谨慎（假阳性样本会在随后的特
异性确证试验中被证明为阴性）.如果在临界点评估中使用了强大的统计方法（例如基于中位数的方法，图基的Tukey’s biweight函数），则不须要排除异常点.
3.1.4 确定筛选临界点
为了确定筛选临界点的类型，须要进行一系列的数据评估，如图1所示.首先，如果使用参数估计的方法，须要对药物初治的样本结果的分布类型进行检验（正态分布检验），如果数据不符合正态分布，则可以对数据进行适当的转换（如对数转换），然后排除异常值（Appendix B.1）.如果不须要用到参数估计（第95百分位），则不须要进行数据转换，但仍须要排除异常值.其次，采取单身分方差分析（ANOVA-based statistical methods）的统计学方法处理比较每一次试验运转的平均值和方差，从而决定采取固定临界点、浮动临界点还是动态临界点（Appendix B.2）.在浮动临界点的评价过程中，如果归一化过程使用了阴性对照，则应当将阴性对照的均值与目标人群的基质样本进行比较，以确定是否适合使用阴性对照.最初，基于以上评估，使用适当的统计学方法计算出临界点（Appendix B.3）.
3.2 确证临界点
特异性是分析方法在其它基质成分存在的条件下明确检测目标分析物的能力[23].筛选试验筛选出活性样品（通常称为潜在阳性），因为筛选临界点答应5%的假阳性率，所以这些活性样品可能是非特异性的.是以从活性样品中鉴定出阳性样品须要药物的特异性活性.检测人源样本的抗药抗体特异性是一种罕见的做法，动物样本也一样.特异性确证试验通常是一个竞争性按捺试验，通过检测含或不含预孵育研讨药物的样品的旌旗灯号变更来进行评估.此外还可通过比较不异大小和电荷的免疫有关的蛋白质进行评估.还有一些研讨者通过比较加药和不加药的旌旗灯号区别进行评估，然而本文建议与监管机构积极讨论这一方法的可接受性.以上的任何一种方法，确证阳性旌旗灯号的变更值称为确证临界点.确证临界点将抗体与药物的特异性结合和非特异性结合区别开来，其无效性非常关键，必须客观评估.不鼓励使用50%旌旗灯号按捺等客观尺度.旌旗灯号略高于临界点的低旌旗灯号的抗药抗体弱阳性样品的评价尤其次要.抗药抗体强阳性药品须要用过量的药物进行竞
争性按捺，所以普通不会出现这一成绩.当评价抗药抗体弱阳性样品时，即使是加标药物样品的旌旗灯号很纤细的减弱都可能会使绝对应的未加标药物样品的旌旗灯号降低
50%以上，从而导致假阳性.此外，只要将抗药抗体阳性样品的旌旗灯号降低到布景旌旗灯号，这旌旗灯号强度只要未按捺样品旌旗灯号的50%以下，如许可能会出现假阴性.是以，特异性确证临界点应当通过客观的方法进行评估，在弱阳性样本附近评估分析方法的变异性.有多种试验方法可以用于特异性确证临界点的评估.
建议在筛选临界点的验证过程评估特异性确证临界点.筛选临界点评估试验所用到的药物初治样本可以加入药物后再以不异的方式检验.计算未加标药物样本（按捺）的均值和尺度偏差（SD），特异性确证临界点为按捺平均值加上3.09倍的SD值（如果预期假阳性率为1%）.与筛选临界点的评估一样，特异性确证临界点的评估过程也须要排除异常值.特异性确证临界点的具体计算步调拜见附录C （Appendix C）.
在某些实验室，会在低于筛选临界点的样品（建议样本量大于等于25）中加标阳性对照使其旌旗灯号值等于或稍微大于筛选临界点.用过量药物孵育后，计算平均按捺百分率，并通过“×SD”值进行校订，确定特异性确证临界点（“×”取决于适当的假阳性率）.必须确保阳性对照样品的旌旗灯号不会高于筛选临界点太多，以避免使假阳性率增高.这一方法确定的特异性确证临界点高度依附于所使用
的阳性对照品.值得留意的是，研讨样本中的低抗药抗体亲和力样本（特别是多价IgM，亲和力成熟的IgG）可能会不被按捺.是以，使用单一阳性对照品确定的特异性确证临界点可能没法无效地将一个研讨样品分为特异性样品还是非特异性样品.
Neyer等提出了一种基于T检验（t-test）的暗示抗药抗体特异性的方法，该方法的道理是比较未加标药物样品与加标药物样品的旌旗灯号值.然而，该分析法的竞争性按捺结果的观测样本量相当无限，没有考虑到生物变异的影响.
然而，以上列举的方法均比人为的50%按捺率更为客观、可靠.一些研讨人员进行抗体免疫耗竭（如Protein A），这一方法其实不涉及特异性药物，它只能证明旌旗灯号来源于免疫球蛋白.这类方法可以用作撑持测试，不建议作为药物特异性的决定性试验.
3.3 灵敏度
完好定量方法普通采取适当的参考尺度曲线来估计分析方法灵敏度，而抗药抗体分析的灵敏度高度依附于所用的阳性对照试剂.例如，在同一个分析试验中，使用高亲和力阳性对照品得到的灵敏度优于低亲和力阳性对照品.是以当有一种以上的阳性对照品时，通常会发现分歧的阳性对照。