大肠杆菌O157H7实验诊断研究进展 PPT课件

7. 全自动抗原抗体检测系统
• VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直 接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、 弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗 体或毒素。 • 基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并 在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓 度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标 准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。
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二．血清学检测
1．玻片凝集试验 2. 胶体金免疫技术 3. ELISA 4．免疫荧光技术 5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA) 7. 全自动抗原抗体检测系统 8. 免疫印记法
1．玻片凝集试验
• 玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验 中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生 化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液 30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的 影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性, 应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于 诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应 同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做 动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。
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• 增菌液： • 含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液 • 含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白
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4．免疫荧光技术
• DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术 (Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数 样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检 测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行 过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌 细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧 光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底 杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。AbDEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧 光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察 计数。
3．生化反应
• • • 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交 叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。 典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下： 动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－） 枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱 羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－） 与O157有鉴别意义的生化反应见表1。 MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖 醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。 Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml置试管中,以无 菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5℃置20min, 暗室内高强度光 源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。
3. ELISA
• 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后 作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定, 一般需72 小时。 • Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠 杆菌 O157: H7, 并与标准培养方法加以对照。结 果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆 菌 O157: H7 9 份。常 规 培养 法 阴性 1 7 6 份 , 而 ELISA阴性174份。总特异性为98.9%。该法与 其它非 O157: H7 大肠杆菌无交叉反应 ,是一种准 确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤 其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行 病学调查。
大肠杆菌O157: H7实验 诊断研究进展
大肠杆菌O157: H7感染Hale Waihona Puke Baidu床表现
• 出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不 发热。 • 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出 现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可 高达50%。 • 血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年 人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、 溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病 死率高，有时可出现70%的病人死亡。
• 胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体， 利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端 的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。
阴性：出现一条线
阳性：出现两条线
无效：无线
中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技 术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大 肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测 粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显 色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为 少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用 于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减 少工作量。
6．间接血凝分析(IEHA)
• 该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未 加热抗原的抗体检测 , 对检测 H 抗原的抗 体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿 毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲 醛化羊红细胞 (SRBC) 有低水平非特异性 吸附 , 但不影响该方法作为一种有效、快 速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血 清的滴度明显高于非特异性吸附。
固相荧光毛细管免疫分析 • 此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作 等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细 管作固形支持物。 • 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一 段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种 荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、 吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花 青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。 样品
• Padhye 等用单克隆抗体进行直接 ELISA 反应检 测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、 结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌 等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌 O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用 于临床和食物标本的快速检测。 Clark 等近一 步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识 别的物质是 LPS, 这种 LPS 抗原决定簇用全细胞 ELISA 同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生 或不产生 Vero 毒素的大肠杆菌中检测到, 而且 易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过 结合免疫捕获的修饰方案来提高 ELISA 的特异 性。
• 目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的 培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检 测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学 发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果 显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm, 在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快, 一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比 在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间, 从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份 （8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培养和IMS分离。 23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由 CR－SMAC分离,其余61份(72.6%)仅IMS分离。用含吐温－ 20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结 合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS 具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。
一、细菌培养与鉴定
• 1．分离培养
• 早期培养对确定病原有重要意义。 • 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院 病人，再其次是高危接触者。 • 培养基： • 山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂 • 改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 • 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC） • 添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC） • “科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基 • 四溴荧光亚甲基兰琼脂 • H7抗血清—山梨醇发酵培养基 •
2．免疫磁珠分离法
• 免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能 被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特 性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。 • 方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免 疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁 架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管 壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃ 培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。
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Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离 法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。
• Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢 克肟的缓冲蛋白胨水培养 ,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠 分离细菌后 , 接种于 CT-SMAC, 结果直接次培养检出量为 200cfu/g, 而免 疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。 • Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆 菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直 接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪 便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 • Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌 O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培 养和多聚酶链反应 (PCR)检测Vero 毒素基因的携带 , 用三种方法对粪便 大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接 培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌 O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。
大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经
• 大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌， 可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、 牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等 感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。 • 在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、 兔、猪、牛等动物。 • 大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题 • 我国情况也不容乐观
O157: H7
生物素
抗体
亲和素
Cy5
• 直接免疫荧光抗体染色
• Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体 对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实 的菌株,检测时间<2h。
5．胶乳凝集
• 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特 异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标 本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳 试剂 , 呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即 为阳性。
8.免疫印记法
• 目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的 O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是 将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳 转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免 疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移 电泳、免疫检测三部分。 • 特点是具有比较高的特异性和敏感性 。
2. 胶体金免疫技术
• 胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进 行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电 镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜 载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫 渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应 用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。 • 胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还 原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠 檬酸三钠的量。