沉淀反应与凝集反应

免疫学及免疫学检验
(三) 方法评价
该试验是经典的血清学反应之一，简 便、快速、实用。故用于鉴定血迹和诊断 炭疽(Ascoli试验)。只能定性，不能定量、 敏感性较低(3~20mg/L)，对含有多个抗原 抗体对的反应系统缺乏分辨力。方法难以 推广。
免疫学及免疫学检验 三、免疫浊度试验
经典的免疫沉淀试验是抗原和相应抗体在 反应终点时判定结果，方法有耗时、敏感度 低(10~100mg/L)和不能自动化等缺点。70年代 以来，根据抗原和抗体所在液相内快速结合 并产生浊度的原理，建立了免疫比浊法。临 床常用3种微量免疫技术，即透射比浊法 (transmission turbidimetry) 、 散 射 比 浊 法 (nephelometry)和免疫胶乳比浊法(immunolatex turbidimetry) ，借助多种自动化分析仪器来完 成。
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(2) 操作步骤：
1) 用稀释液将待检抗原稀释成一定浓度。 2) 将稀释待检抗原和不同浓度抗原标准品 加至试管内，再加入一定量抗体，立即比 浊，记录速率单位(RU)。 3) 以抗原标准品含量为横坐标，RU值为纵 坐标，于普通坐标纸上绘制标准曲线。根 据待测抗原RU值，查出相应抗原含量。
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(一) 原理 把抗原溶液小心地加于已含抗体 溶液的细试管液面上。当对应的抗原 与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳 白色沉淀环。
免疫学及免疫学检验 (二) 操作步骤
1. 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管(内径 约1.5~2mm)底部，避免产生气泡。 2. 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面 上，形成清晰的交界面。 3. 置沉淀管于室温下使其反应，1~5min内 在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。 30min仍无沉淀环出现则为阴性。
免疫学及免疫学检验 1. 速率散射比浊法
(1) 原理：是一种抗原抗体结合动态测定法。所 谓速率是抗原抗体结合反应过程中，在单位 时间内两者结合的速度。速率法是测定最大 反应速率，即在抗原抗体反应达最高峰时， 通常为数十秒钟，测定其复合物形成的量。 峰值的高低在抗体过量情况下与抗原的量成 正比。峰值出现的时间与抗体的浓度及其亲 和力直接相关。不同抗原含量其速率峰值不 同，通过微电脑处理，求出抗原含量。
3. 方法评价
敏感度高于单相琼脂扩散试验5~10 倍，批内、批间重复性较好，变异系数 <10%，操作简便快速，1h可报告结果。
免疫学及免疫学检验 (二) 散射比浊法
散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰 到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏 转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小 不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一 定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度 与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形 成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速 率散射比浊法(rate nephelome-try)和终点散射比 浊法(endpoint nephelometry)。
免疫电泳 对流免疫电泳 火箭电泳 免疫印迹等
免疫学及免疫学检验 一）、免疫电泳
免疫电泳为区带电泳与免疫双向扩散的 结合。方法是先将样品加入琼脂中利用区带 电泳技术将抗原各成分依电泳速度不同而分 散开。然后在适当的位置上沿电泳方向挖一 直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原混 合抗体液，让各抗原成分与相应抗体进行双 向免疫扩散，可形成多条弧形沉淀线。
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2. 抗体稀释法
本法采用抗原量恒定与不同倍比稀释度的抗体反 应，出现沉淀物最多的管为抗体最适比例管。
3. 方阵滴定法
抗原和抗体同时稀释，亦称棋盘 (checkerboard) 滴定法，是前二法的结合，可一次完成抗原和抗体 的滴定并找出抗原、抗体的最适比。
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(三) 方法评价
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(一) 原理 抗原溶液与相应抗体溶液混合，在 电解质存在的条件下，抗原与抗体结 合出现可见的絮状沉淀。絮状沉淀易 受抗原与抗体比例的影响，由此可作 为最适比测定的基本方法。
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(二) 操作步骤
1. 抗原稀释法
(1) 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 (2) 各管加入一定浓度的适量抗血清。 (3) 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。 (4) 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物 最多的管为最适比例管。
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双免疫扩散试验
（ double immunodiffusion）
双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离打 数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗 体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在 两孔间可出现2～3条沉淀线，本法常用于抗原 或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材 料的抗原相关性分析。
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根据沉淀反应的介质和检测方 法的不同,沉淀反应可分为: 液相内的沉淀反应 凝胶内的沉淀反应
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第一节 液体内沉淀试验
根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又 可分为三类： 絮状沉淀 环状沉淀 免疫浊度沉淀
免疫学及免疫学检验 一、絮状沉淀试验 絮状沉淀试验是一项经典实验技术。曾 用于测定梅毒抗体的Kahn试验是絮状沉淀 的代 表试验 ， 现 今 已 被 更 简 便 而 敏 感 的 USR或RPR方法替代。
絮状沉淀试验方法简单，设备要求低， 敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明 显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适 比。
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二、环状沉淀试验 环状沉淀 (ring precipitation) 试验是 由Ascoli于1902年建立的一种经典的血 清学定性试验。用非常简便的技术了 解待测血清内是否存在某种抗原或抗 体。
免疫学及免疫学检验 2. 操作步骤
(1) 用稀释缓冲液将待检样品和标准品按规定稀 释，取一定量加至测定管中。 (2) 加最适工作浓度(用方阵法预先滴定)的抗体， 孵育一定时间，测定吸光度(A)值。 (3) 以不同浓度抗原含量为横轴，吸光度为纵轴， 绘标准曲线。从标准曲线可得待检抗原量。
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(2) 操作步骤
1) 用稀释液稀释待检抗原和抗原标准品。 2) 取一定量稀释待检抗原液和不同浓度抗原标 准品溶液加至试管中，加抗体充分混匀，孵 育一定时间，比浊。 3) 以抗原标准品量为横坐标，浊度值为纵坐标， 绘制标准曲线。根据待检抗原的浊度值，查 出抗原含量。
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免疫学及免疫学检验 (一) 透射比浊法
1. 原理 抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合 物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内 复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射 光减少，免疫复合物量越多，透射光越少， 即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度 和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与 待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准 曲线，可测出待检抗原含量。
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(3) 方法评价：
检测不必等到抗原抗体反应达到平 衡，大大节约反应时间，每小时可检测 数十份标本；敏感度高，最小检出量达 μg/L水平。
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2. 终点散射比浊法
(1) 原理：
让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平 衡后，测定其复合物的量。复合物的浊度不再 受时间的影响，但反应复合物聚合产生絮状沉 淀之前(大约反应数十分钟)进行浊度测定。
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沉淀反应
（precipitation reaction)
毛旭虎

医学检验系临床微生物学及免疫学教研室 二OO二年三月
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可溶性抗原+相应抗体 肉眼可见的沉淀
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1897年 Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应 抗血清混合出现沉淀 1905年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于 其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行 1946年 Oudin 报告了试管免疫扩散技术 1965年 Mancini 提出单向免疫扩散技术，使定性 免疫试验向定量化发展 免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、 微量、自动化的新阶段。
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2. 操作步骤
1) 用稀释液将待测抗原和抗原标准品稀释。 2) 将抗体致敏胶乳溶液和待测抗原、不同浓度的 抗原标准品反应一段时间，测吸光度值。 3) 以抗原标准品量为横坐标，吸光度值为纵坐标 绘制标准曲线，查出待测抗原量。
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3. 方法评价
敏感度高，试剂稳定，因反应液中 无PEC沉淀剂的影响，个体IC对结果影 响也小，所以结果稳定、可靠，特异性 好；不需特殊仪器设备，一般分光光度 计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均 可使用。
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常用此法进行血清的蛋白种 类分析。对于免疫球蛋白缺损或 增多的疾病的诊断或鉴别诊断有 重要意义。
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二）、对流免疫电泳
对流免疫电泳实质上是定向加速度的免疫双 扩散技术，其基本原理是：将琼脂板放入电泳 槽内，使琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负 极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗 体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体 分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正极的 位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗 原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形 成免疫复合物的沉淀线。只需1小时左右即可观 察结果。
免疫学及免疫学检验 单向免疫扩散试验示意图
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沉淀环的直径与待检标本内含量不 是直线关系，有两种计算方法：
(1) Mancini曲线：适用于大分子抗原，扩散 时间>48h，使用普通坐标纸作图，扩散环 直径平方和浓度呈线性关系。 (2) Fehcy曲线：适用于分子抗原，扩散时间 较短，使用半对数坐标纸作图，抗原量的 对数和扩散圈直径之间呈线性关系。
免疫学及免疫学检验 第二节 凝胶内沉淀试验
凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation)主要 是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(gel diffusion)。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙 稀酰胺凝胶等。根据实验目的与方法不同， 可将固相内沉淀验分为3类：①双相琼脂扩散 试验(double gel diffusion test)，②单相琼脂扩 散试验(single gel diffusion test)，③凝胶免疫 电泳(gel immunoelec-trophoresis)。这是一项凝 胶内电泳加扩散技术，专门一章介绍。
(3) 方法评价：
敏感度达mg/L水平，可自动化，但 反应时间较长
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(三) 免疫胶乳比浊法 1. 原理 选择一种大小适中，均匀一致的胶乳
颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则 发生凝集，单个胶ห้องสมุดไป่ตู้颗粒在入射光波长之内， 光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过 光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比， 与抗原量成正比。
免疫学及免疫学检验 对流电泳示意图
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三）、火箭免疫电泳
火箭免疫电泳技术又称作单向电泳 扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发 展起来的一项定量技术，实质上是加速 度的单向扩散。
免疫学及免疫学检验 方法：在含抗体的琼脂板一端打一排抗
原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端， 用横距2～3mA/cm的电流强度进行电泳。 抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发 生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀 逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。 抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈 正比，用标本中的抗原含量。
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一、单相琼脂扩散试验 (一) 原理
将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使 待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与 抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与 抗原浓度呈正相关。
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(二) 操作步骤
1. 将抗体和0.9%琼脂糖50~56℃混合，即刻 倾注成平板。 2. 待凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入已稀 释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶 液。 3. 置37℃，让其向四周自由扩散，24~48h后 可见其孔周围出现沉淀环。
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免疫学及免疫学检验
双向免疫扩散试验示意图
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第三节 免疫电泳技术
免疫电泳技术是电泳分析与沉淀 反应的结合产物。这种技术有两大优 点，一是加快了沉淀反应的速度，二 是将某些蛋白组分利用其带电荷的不 同而将其分开，再分别与抗体反应， 以此作更细微的分析。
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免疫电泳包括: