单抗贴壁铺展法分离纯化造血干细胞实验指导书

实验一、单抗贴壁铺展法分离纯化造血干细胞
1、小鼠骨髓提取
1）实验材料与试剂
小白鼠：5-6周龄
70% 酒精
冷却D-PBS（去掉钙、镁离子）
配方：每一升去离子水（三蒸水）中：
NaCl 0.8g
KCl 0.2g
Na
2HPO
4
·12H
2
O 2.9g
KH
2PO
4
0.2g
高压灭菌，4℃冰箱保存。

IMDM （Iscove's Modified Dulbecco's Media）
镊子、剪刀、25G-10ml注射器
15ml离心管
离心机、CO
2
培养箱、细胞培养板
2）操作方法
（1）用70%酒精消毒解剖器皿，颈骨脱臼方法处死小白鼠，身上喷洒酒精粗略消毒。

切开股腹部到股股内侧皮肤，拨开肌肉露出骨干，捏住股
骨将膝关节以下部位切断，再切断股关节，取出股骨。

将粘附的肌肉等清
理掉。

（2）用消毒好的剪刀切断股骨两端，露出骨髓管，将已吸好2-5ml D-PBS(2‰,10-20μL肝素钠/ml)的注射器针头插入股骨一段，另一端对准
15ml离心管冲洗。

全部过程在超净工作台里完成，并装有骨髓的离心管应
放入冰中。

2、单个核细胞的分离（mononuclear cell,MNC）
1）实验材料与试剂
（1）调温低速离心机
（2）超净工作台
（3）PBS缓冲液、Ficoll Hypaque、甲基纤维素
（4）15ml离心管、吸管
2）操作方法
（1）骨髓液和PBS按1:1的比例混匀，再按4:1的比例与0.5%的甲基纤维素混匀，室温静置30min，待红细胞自然沉降至界限分明。

（2）吸取上清，置于15ml离心管中，20℃、1500rpm离心5min。

（3）弃上清，加5mlPBS重悬细胞。

（4） 15ml离心管中加入5ml Ficoll-Hypaque液，再缓慢沿管壁加入5ml细胞悬液，20℃、1500rpm离心20min，分4层-PBS层、MNC层、Ficoll
层、红细胞层。

（5）收集MNC层细胞，用PBS洗涤。

（6）加5mlPBS或 10%胎牛血清的IMDM，制作细胞悬浮液。

3、单抗贴壁铺展法
原理: 又称洗淘法(panning)，基本原理就是抗原-抗体的特异性结合反应。

将聚苯乙烯瓶或培养板用抗体包被，然后将细胞与其共孵育，表达相对已抗原的细胞，如CD34，被选择性地结合到培养瓶或板的表面，与其他细胞群分开。

具体用羊抗鼠抗体包被培养板，细胞和抗CD34单抗悬浮孵育，然后孵育过的细胞悬液注入包被好的培养板中进行培养，形成抗鼠抗体-CD34McAb侨联结合是CD34细胞固定在培养板底，以达到分离的目的。

1)实验材料、试剂：
（1）小鼠骨髓细胞
（2） 2%台盼蓝
（3） 6孔平底细胞培养板
（4）抗小鼠CD34单克隆抗体，羊抗鼠抗体
2)操作方法：
（1）制备洗淘板：6孔平底细胞培养板的每个孔加入2.5ml羊抗鼠抗体（抗体浓度4-8µɡ/ml），放置室温4-6小时或4℃过夜。

将上清液吸出，加1%FCS-PBS 2.5ml于每孔，轻轻振摇，吸出所加液体，重复两次。

最后
再加1%FCS-PBS 2.5ml在室温封存30分。

用前用PBS洗涤2次，吸尽孔中液体。

（2）单抗孵育：取2×107个/ml的骨髓细胞悬液置于15ml离心管，4℃、400g离心10min，弃上清，用 10μɡ/ml CD34抗体悬起细胞，在冰浴中孵育30min。

（3）Panning：将单抗悬浮液加入培养板（6孔板每孔加1ml悬液），在4℃孵育30-45min，吸弃上层液。

（4）Harvesting：用PBS洗一次，用预冷的PBS/0.2%BSA用力冲洗培养板底部，收集CD34细胞。

G和rpm换算公式:
G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２
G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示。

10-5即：10的负五次方。

[rpm]２即：转速的平方。

R为半径，单位为厘米。