最新第4章细菌药敏试验及其耐药表型检测PPT课件

纸片扩散法
1. 水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.2～7.4，做成琼脂厚度 4mm，直径90mm的平板；
2. 挑取孵育16 ～ 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中， 振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。
纸片扩散法
3. 用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液； 4. 然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度； 5. 最后沿平板内缘涂抹1周； 6. 平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化的纸片分配
百分位菌株的MIC值 单纯比较MIC50，MIC90是片面的，还要同时看平均
MIC及MIC范围 同时结合R，I，S，(不同药物血浓度不同，安全范
围不同)
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细菌耐药机制
细菌耐药机制主要有四种： 产生一种或多种水解酶、钝化酶和 修饰酶；
抗生素作用的靶位改变，包括青霉 素结合蛋白位点、DNA解旋酶、 DNA拓扑异构酶Ⅳ的改变等；
第4章细菌药敏试验及其 耐药表型检测
抗菌药物敏感试验
测定抗菌药物在体外对病原微生物有无 抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏 感性试验（Antimicrobial Susceptibility Test），简称药敏试验（AST）。
抑菌圈直径与MIC的关系
MIC (ug/ml)
>256
微量肉汤法 （ 0.1ml, 微量板） 自动化仪 优点：准确，可靠，可用于研究。 缺点：
劳动强度大 细菌生长情况不可查
30
琼脂稀释法
浓度 16
32
64
128
256 ug/ml
制备含对倍抗生素浓度梯度的平板，制备菌悬液， 点种菌，104/每个点，孵育，判读结果
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琼脂稀释法
优点：金标准 精确可靠 可同时测定多株菌（40株） 细菌生长情况可查
细菌膜的通透性下降，包括细菌生 物被膜的形成和通道蛋白丢失；
细菌主动外排系统的过度表达。 在上述耐药机制中，第一、二种耐药
机制具有专一性，第三、四种耐药机 制不具有专一性。
Β-内酰胺酶
β内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗 生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外， 革兰阴性杆菌间质中；
E test 法
细菌生长 区
E test 塑料
条
256
128
椭圆形
细菌生长
抑制区
8
判读抑菌浓度
（MIC ug/ml)
016
34
E test 法
菌液制备及接种均同纸 片扩散法。
90mm平板上可放E试验 试条1 ～ 2条，140mm 平板最多可放6条。
孵育温度及时间同纸片 扩散法。
E test 法
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）
纸片法，出现以下一种情况即可怀 疑该菌株产生ESBL （筛选阳性）：
• 头孢泊肟≤17mm • 头孢他啶≤22mm • 头孢噻肟≤27mm • 头孢曲松≤25mm • 氨曲南 ≤27mm
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）
纸片法（表型确认试验） 头孢他啶和头孢他啶/克
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）
稀释法（表型确认试验） 头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟
和头孢噻肟/克拉维酸。 任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相
应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该 菌为产ESBL菌株。
AmpC酶的特征
AmpC酶是在革兰阴性菌中发现的由染色体 或质粒介导的水解头孢菌素的Ⅰ型β内酰胺酶， 可分为诱导酶和非诱导酶。
1
256
3
128
7
64
1
32
3
16
7
8
1
4
3
2
7
1
1
0.5
3
0.25
7
0.125
抗菌药物的稀释和融解
肉汤稀释法
4
8
混
16 32 64 128 256 ug/ml 混清
抗生素倍比稀释，种菌105CFU/ml ， 孵育35℃， 16～20h，判读。
29
肉汤稀释法
调节离子浓度的MH肉汤 宏量肉汤法（2ml, 13x100mm ）
12
3
5
256 128
2 2 耐药
22
2
1
小误差
极重要误差
64
32
1
1
小误差
中介
小误差
16
8
4
2
重要误差
12
258
1
1
12
小误差
敏感 5
1 0.5
1
25
9
0.25 6
8 10 12 14 18 20 22 24 26 28 30 32 34
不同国家的判定折点 －可能不同
原因：
用药剂量不同，服药的间隔不同 评价敏感时较保守 更强调检测出耐药株（即特定的耐药群） 技术因素：接种、培养基
耐药（Resistance）
用常规用量治疗不能抑制细菌的生长 MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度
敏感性分类（2）
中介 (Intermediate)
MIC接近血、体液中药物的浓度，治 疗反应率低于敏感株
药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) 加大用药剂量可能有效
缓冲区：防止操作的系统误差造成重 大结果的判定错误
与ESBLs不同的是，AmpC酶对三代头孢菌 素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制 剂克拉维酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西 林和硼酸抑制。
AmpC酶的检测方法
头孢西丁三维试验是检测AmpC酶的经典方法；
除此之外，还有以硼酸化合物为抑制剂检测肺 炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶、AmpC Disk、头孢西丁琼脂基础法等。
流感嗜血杆菌
氨苄西林，青霉素 复方磺胺 头孢呋肟，头孢噻肟 头孢他啶，氯霉素 阿奇霉素，头孢克罗 环丙沙星，亚胺培南
肺炎链球菌
青霉素，红霉素 复方磺胺 氧氟沙星，四环素 万古霉素 氯霉素，利福平 利福平，四环素
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预报用药(一)
测试药 菌名 苯唑西林 葡萄球菌 四环素 所有（除葡
萄球菌和不 动杆菌〕 红霉素 G＋球菌
）
5120 512 512 512 64 64 64
8 8 8 1 1 1
来源
储存液 步骤1 步骤1 步骤1 步骤4 步骤4 步骤4 步骤7 步骤7 步骤7 步骤10 步骤10 步骤10
体积 (mL)
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
CAMHB 最终浓度 (mL) （mg/mL）
9
512
替卡西林，哌拉西林
三级
氨曲南，头孢他啶
头孢曲松
卡那霉素，奈替米星
氯霉素，奈替米星
妥布霉素
四环素，氯霉素
21
常规测试并报告的药物分组(2)
葡萄球菌
肠球菌
一级 苯唑西林，青霉素 青霉素，氨苄西林
二级 红霉素类
万古霉素
克林霉素，万古霉素
三级 氯霉素
庆大霉素
22常规测ຫໍສະໝຸດ 并报告的药物分组(3)一级 二级 三级
-测试抑菌圈周围的细菌；
-如果β-内酰胺酶阳性,报告青霉素R。
Pos
Neg
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）
ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌 素类和单环内酰胺类氨曲南的一类酶；
ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被 克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂 所抑制；
ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外 也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙 雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单 胞菌。
碳青霉烯酶
A类酶
缺点： 测多个药时劳动强度大 制备平皿费时费力
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E test 法
E试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固 定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗 菌药物，另一面有读数和判别的刻度； 抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的 宽度范围； 将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜， 围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交 点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。
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常规测试并报告的药物分组(1)
肠杆菌科
绿脓和非肠杆菌科
一级
氨苄西林
头孢他啶，庆大霉素
头孢唑林，庆大霉素
替卡西林，哌拉西林
二级
阿米卡星
阿米卡星
氨苄西林/舒巴坦
头孢吡肟，头孢哌酮
阿莫西林/克拉维酸
氨曲南
头孢呋肟，头霉素
环丙沙星，亚胺培南
头孢噻肟，头孢曲松
替卡西林/克拉维酸
环丙沙星，亚胺培南
妥布霉素，复方磺胺
药敏试验的方法学
半定量…纸片扩散法 (抑菌圈直径) MIC法：
稀释法(肉汤、琼脂) 自动化仪法 抗生素连续梯度法 (Etest ) 流式细胞仪
纸片扩散法（Kirby-Bauer法）
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼 脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后 不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周 围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无 菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度， 并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。
如果青霉素的药敏结果出现以下情况，需 要做诱导β-内酰胺酶的检测 ： MIC ≤0.12 µg/ml Zone diameter ≥29 mm
诱导β-内酰胺酶试验
苯唑西林 (诱导剂)
-接种纯菌落于琼脂上 (例如，BAP,
MHA) ；
-贴ß-内酰胺类纸片 (例如,苯唑西林,
头孢西丁)；
-孵育过夜；
在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的抗菌药 物选择原则。
敏感性分类(CLSI的定义)
敏感（Susceptible）
用常规用量治疗有效 常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的
MIC 5倍以上。
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纸片扩散法－标准化
CLSI：美国实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute)
每年修订更改
包括质控 新药的判定标准 特殊耐药性的检测
19
CLSI的法规
规定纸片含量、接种浓度、培养基、平 皿厚度、判定标准、质控；
规定常规测试报告的抗生素； 不同的药判定标准不同； 不同的菌判定标准也不同。
克林霉素 所有
推测其他药物的敏感性 所有β-内酰胺类 多西环素，米诺环素
罗红霉素，克拉霉素， 阿奇霉素 林可霉素
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测试药
氨苄西林 青霉素G
头孢噻吩
奈啶酸 万古霉素
预报用药(二)
菌名
肠球菌 葡萄球菌
肠杆菌科
肠杆菌科 所有
推测其他药物的敏感性
青霉素 氨苄西林，美洛西林 替卡西林 头孢拉定，头孢氨苄 头孢克罗 所有氟喹诺酮类 替考拉宁
器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm， 纸片距平板内缘大于15mm。
纸片扩散法
7. 35℃孵育16～24小时量取 抑菌圈直径；
8. 根据抑菌环的直径，按照 CLSI标准判读，报告敏感、 中介、耐药。
纸片扩散法－影响因素
MIC 接种菌量 细菌生长率 抗生素含量、扩散性 平皿厚度 温度，预孵育时间
拉维酸、头孢噻肟和头孢 噻肟/克拉维酸。 任一复方制剂的抑菌圈直 径与相应单药抑菌圈直径 相差≥5mm时，即可判断 该菌产ESBL。
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）
稀释法，出现以下一种情况即可怀疑该菌 株产生ESBL： • 头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲 南MIC≥2mg /mL • 或头孢泊肟MIC≥8mg /mL
优点
连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好 影响因素少，稳定性高 操作简单，省时
缺点：昂贵 用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌，
分枝杆菌
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评价药物体外抗菌活性的指标
MIC50, MIC90, MIC 均值， MIC 范围，R，I，S MIC50/ MIC90：MIC从小到大排列，位于第50 / 90
碳青霉烯酶
碳青霉烯酶可以定义为具有水解碳青霉烯类抗生素 活性的β-内酰胺酶，主要分布于β-内酰胺酶A、B、 D类中。
根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶 分为两大类：
一类称为金属碳青霉烯酶，这类酶以金属锌离子为活性 作用位点，可以被EDTA抑制，属于B类β-内酰胺酶；
另一类以丝氨酸（Ser）为酶的活性作用位点，可以被酶 抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制，属于A、D类β-内酰 胺酶。
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药敏试验-稀释法
以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进 行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培 养后观察其最低抑菌浓度。
稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培 养基者为肉汤稀释法。
常用抗菌药物容积稀释法
步骤
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
浓度 （mg/mL
检测方法有微生物培养法、碘－淀粉法、头 孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为 简单、方便、快速，应用于临床检测。
葡萄球菌属 – 青霉素
方法 MIC
纸片扩散法
敏感 0.12 mg/ml
29 mm
中介 -
-
耐药 0.25 mg/ml
28 mm
CLSI M100-S20. Table 2C.
诱导β-内酰胺酶的检测