α1肾上腺素能信号通路对阿霉素诱导心肌细胞凋亡的影响

α1肾上腺素能信号通路对阿霉素诱导心肌细胞凋亡的影响
叶玉娇;李卓妍;王青洁;李文娟;陈笋
【摘要】目的·研究选择性α1肾上腺素能受体激动剂去氧肾上腺素(phenylephrine,Phe)及拮抗剂哌唑嗪(prazosin,Pra)对阿霉素(doxorubicin,DOX)诱导心肌细胞凋亡的影响.方法·将大鼠H9C2心肌细胞分为4组;除对照组外,其他
3组均加入1.8 μmol/LDOX;DOX组仅给予DOX,激动剂组同时加入0.1 mmol/L Phe,拮抗剂组同时加入10 μmol/Pra.细胞培养24 h后,采用流式细胞术及TUNEL 染色检测细胞凋亡;Westem blotting检测凋亡效应物cleaved caspase 3的表达;实时定量PCR检测Bcl-2家族抗凋亡基因及促凋亡基因在mRNA水平的表
达;CCK-8检测细胞活力.结果·Phe抑制DOX诱导的心肌细胞凋亡,cleaved caspase 3表达量降低;Pra促进DOX诱导的心肌细胞凋亡,cleaved caspase 3表达量升高.与DOX组比较,激动剂组Bcl-2、Bcl-w在mRNA水平的表达升高,Bax、Bad在mRNA水平的表达降低;而拮抗剂组Bcl-2、Bcl-w的表达降低,Bax、Bad
的表达升高.给药24 h后,激动剂组心肌细胞活力较DOX组增高,拮抗剂组细胞活
力与DOX组无明显差异.结论·DOX诱导的心肌细胞凋亡受α1肾上腺素能信号通路调节.
【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2019(039)003
【总页数】6页(P233-238)
【关键词】心肌细胞;阿霉素;凋亡;去氧肾上腺素;哌唑嗪
【作者】叶玉娇;李卓妍;王青洁;李文娟;陈笋
【作者单位】上海交通大学医学院附属新华医院小儿心血管科,上海200092;上海交通大学医学院附属新华医院小儿心血管科,上海200092;上海交通大学医学院附属新华医院小儿心血管科,上海200092;上海交通大学医学院附属新华医院小儿心血管科,上海200092;上海交通大学医学院附属新华医院小儿心血管科,上海200092
【正文语种】中文
【中图分类】R453.1
阿霉素（doxorubicin，DOX），属蒽醌类抗肿瘤药物，广泛用于儿童白血病、淋巴瘤以及实体肿瘤等，可显著提高患儿生存率。

然而它在心脏中特异性蓄积导致的心脏毒性严重限制其临床使用[1-2]。

由于儿童敏感性高、耐受性低，DOX引起的心脏毒性问题在儿科更为普遍。

研究[3-4]报道57%的恶性肿瘤患儿在接受有效DOX治疗后出现不同程度心脏功能受损，其中发展为慢性心功能衰竭的比例超过15%。

DOX心脏毒性的病理生理机制尚未完全阐明。

现有基础研究及临床研究[5-6]证实心肌细胞凋亡是其主要的作用机制。

细胞凋亡即程序性死亡，是一种高度保守、能量依赖性的细胞死亡方式，受到多种信号通路的紧密调节。

当死亡配体与受体结合后激活天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶8（caspase 8），活化的caspase 8 激活线粒体膜上B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）家族的促凋亡蛋白，并最终导致凋亡效应物caspase 3活化；除此之外，活化的caspase 8还可以引发caspase家族的级联反应，直至信号传递至 caspase 3分子，引起细胞凋亡[7]。

上述信号通路中的Bcl-2家族包括抗凋亡基因如 Bc1-2、Bc1-w和Bc1-XL，及促凋亡基因如Bax、Bad和 Bid等，其均在细胞凋亡信号通路中发挥重要作用。

近年来大量研究[8]表明α1肾上腺素能信号通路可能是一种新的心肌内源性保护
信号通路，可通过促进锌指转录因子GATA4表达，稳定线粒体膜，抑制Fas途径介导的心肌细胞凋亡。

此外，Wright[9]、Huang[10]和Valks[11]等研究表明α1肾上腺素能信号通路激活后，Bcl-2抗凋亡蛋白表达增加；而促凋亡蛋白Bad通过Ser-112和Ser-155位点的磷酸化而失活，使得细胞凋亡减少。

但其作用机制尚
未完全明确，也尚无相关研究证实α1肾上腺素能信号通路可以调控DOX诱导的
心肌细胞凋亡。

本研究初步探索α1肾上腺素能信号通路激动剂及拮抗剂对DOX诱导的心肌细胞
凋亡的影响，以期为研究α1肾上腺素能信号通路心肌保护的分子机制、开发治疗DOX 心脏毒性药物提供参考。

培养箱（Thermo Fisher，美国），5417R台式高速离心机（Eppendorf，德国），Nanodrop紫外分光光度计（Thermo Fisher，美国），电泳仪EPS300（天能，中国），化学发光成像仪（Bio-Rad，美国），2720 Thermal Cycler（Applied Biosystems，美国）。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞大鼠心肌细胞系H9C2购自上海中国科学院细胞库（货号
CBP60588）。

1.1.2 试剂 DOX（Sigma，美国），去氧肾上腺素（phenylephrine，Phe）（Sigma，美国），盐酸哌唑嗪（prazosin，Pra）（Sigma，美国），Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒（BD，美国），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（碧云天，中国），CCK-8试剂盒（碧云天，中国），实时定量PCR试剂盒（TaKaRa，日本），反转录试剂盒（TaKaRa，日本），caspase 3抗体（Proteintech，美国），β-actin抗体（Abcam，美国），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，中国），蛋白上样缓冲液（碧云天，中国），
化学发光显影液（Millipore，美国），高糖DMEM 培养基（Hyclone，美国），DPBS（Dulbecco′s phosphate-buffered saline）缓冲液（Gibco，美国），胎
牛血清（Gibco，美国），胰酶（Gibco，美国），青/链霉素（生工，中国）。

1.1.3 仪器流式细胞仪（Beckman，美国），CO2恒温
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与处理用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5% CO2的
条件下培养H9C2细胞。

当细胞贴壁达80%时，用含0.25% EDTA的胰酶消化，计数后传代。

细胞接种24 h后，对照组更换新鲜完全培养基，DOX组仅给予DOX 1.8 μmol/L，激动剂组给予DOX 1.8 μmol/L和Phe 0.1 mmol/L，拮抗剂组给予DOX 1.8 μmol/L和Pra 10 mmol/L；培养24 h后收集细胞进行各项检测。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡率药物处理24 h后的细胞用胰酶消化至单个，DPBS清洗2次，300 μL Annexin缓冲液重悬，加入5 μL Annexin V-FITC，室
温避光孵育5 min，上机前5 min加入5 μL PI，1 h内上机检测，防止荧光淬灭。

所得结果用FlowJo软件处理。

1.2.3 TUNEL/DAPI染色观察细胞形态及凋亡情况 12孔板培养细胞，制备细胞爬片。

药物处理24 h后加入4%多聚甲醛4℃固定30 min，DPBS洗涤后加入含
0.3%Triton X-100的PBS室温通透5 min，随后按照说明书每孔加入50 μL TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min。

DAPI复染，抗荧光淬灭封片剂封片后显微镜下观察。

1.2.4 CCK-8检测细胞活力以1×103/孔的密度接种细胞至96孔板，培养24 h
后按照上述分组方案给予不同处理，每组5个复孔，另设置仅加入培养基的为空
白对照。

给药24 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养箱孵育1 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值。

每组的吸光度值为去除最高值和最低值后的平均值。

按（实验组吸光度值-空白对照吸光度值） / （对照组吸光度值-空白对照吸光度值）
×100% ，计算细胞活力。

1.2.5 实时定量PCR H9C2细胞处理24 h后DPBS清洗1次，每孔加入TRIzol 600 μL提取细胞总RNA，Nanodrop紫外分光光度计测量RNA浓度。

每组取1 μg RNA进行20 μL体系反转录，所得cDNA稀释20倍，-80 ℃保存或按照试剂盒说明书进行实时定量PCR。

以GAPDH为内参，各目的基因引物序列见表1。

得到Ct值后计算2-ΔΔC t分析mRNA相对表达量。

表1 实时定量PCR使用的引物序列Tab 1 Oligonucleotide primers sequences used for real-time PCRGAPDH正向 GTGGACCTCATGGCCTACAT反向TGTGAGGGAGATGCTCAGTG Bcl-2正向 ACGGTGGTGGAGGAACTCTTCA反
向 AGACAGCCAGGAGAAATCAAACAGA Bcl-w正向GTGAGACTGCCGATGCCTAGAGA反向 GAGGACTGGACTGTGAGTTCTAACG Bax正向 CCGAGAGGTCTTCTTCCGTGTG反向CAGATGGTGAGTGAGGCAGTGAG Bad正向CTAGGCTTGAGGAAGTCCGATCC反向 GGCTGCTGCTGAACGATGCT
1.2.6 Western blotting 药物作用24 h后收集细胞，加入RIPA裂解液和1%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）冰上裂解30 min，4 ℃、12 000×g离心20 min，吸取上清液，BCA法检测蛋白浓度。

剩余上清液加入
5×蛋白上样缓冲液，99 ℃变性10 min。

每孔蛋白上样量50 μg，计算上样体积；SDS-PAGE凝胶电泳后转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，剪膜后分别加入caspase 3 抗体（1:500）及β-actin抗体（1:5 000），4 ℃ 过夜。

第2日复温0.5 h后TBST缓冲液清洗，室温孵育二抗
2 h。

1:1配制显影液，充分覆盖PVDF膜，Bio-Rad化学发光成像仪成像，采用Image Lab软件对图像进行灰度分析。

1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。

所有实验均重复3次，实验数据以±s描述。

采用t检验分析2组间差异，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果
2.1 Phe和Pra对DOX诱导的心肌细胞凋亡的影响
流式细胞术统计分析结果显示对照组、DOX组、激动剂组和拮抗剂组的细胞凋亡
率分别为（1.8±1.1） %、（19.5±3.0） %、（10.2±2.0） % 和
（31.3±4.3） %；提示 DOX可明显诱导细胞凋亡（P=0.000），激动剂组细胞
凋亡率较DOX组降低（P=0.012），拮抗剂组细胞凋亡率较DOX组升高
（P=0.009）（图 1）。

图1 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig 1 Cell apoptosis rates detected by flow cytometry注：A. 流式细胞术结果代表图；B. 细胞凋亡率统计。

①P=0.000，与对照组比较；②P=0.012，③P=0.009，与DOX组比较。

DAPI染色观察各组细胞核形态，正常细胞核形态呈椭圆形，均匀淡蓝色，而凋亡细胞核浓缩或裂解，呈亮蓝色。

TUNEL染色显示DOX组含绿色荧光的细胞数量
较对照组明显增加（P=0.000），激动剂组在此基础上稍有减少（P=0.092），拮抗剂组绿色荧光的凋亡细胞数量最多（P=0.000）（图 2）。

图2 TUNEL/DAPI染色检测细胞凋亡Fig 2 Cell apoptosis detected by TUNEL and DAPI staining注：A. 细胞爬片TUNEL/DAPI染色结果；B. 细胞凋亡率定量统计。

标尺示50 μm。

①P=0.000，与对照组比较；②P=0.000，与DOX组比较。

Cleaved caspase 3 作为凋亡效应物，提示内源性凋亡通路的激活。

以β-actin为内参，蛋白条带及其定量结果显示DOX组cleaved caspase 3 蛋白表达量较对照组升高（P=0.004），激动剂组较DOX组降低（P=0.041），拮抗剂组较DOX
组升高（P=0.046），差异均有统计学意义（图 3）。

图3 Western blotting 检测 cleaved caspase 3 蛋白表达量Fig 3 Expression of
cleaved caspase 3 detected by Western blotting注：A. Western blotting 显示cleaved caspase 3蛋白条带；B. 蛋白表达量定量统计。

①P=0.004，与对照
组比较；②P=0.041，③P=0.046，与DOX组比较。

2.2 抗凋亡基因及促凋亡基因mRNA水平变化
与对照组相比，DOX组Bcl-2、Bcl-w mRNA水平降低（P=0.000，P=0.002），Bax、Bad mRNA 水平升高（P=0.000，P=0.000）。

与DOX组相比，激动剂组Bcl-2、Bcl-w mRNA水平升高（P=0.005，P=0.041），拮抗剂组降低
（P=0.027，P=0.025）；激动剂组Bax、Bad mRNA水平降低（P=0.027，
P=0.001），拮抗剂组升高（P=0.009，P=0.007）；差异均具有统计学意义（图4）。

图4 实时定量PCR检测抗凋亡基因及促凋亡基因mRNA水平变化Fig 4 Relative expression of anti- and pro-apoptotic gene detected by real-time PCR注：A. Bcl-2 mRNA相对表达量；B. Bcl-w mRNA相对表达量；C. Bax mRNA相对
表达量；D. Bad mRNA相对表达量。

①P=0.000，④P=0.002，与对照组比较；②P=0.005，③P=0.027，⑤P=0.041，⑥P=0.025，⑦P=0.009，⑧P=0.001，
⑨P=0.007，与 DOX 组比较。

2.3 各组心肌细胞活力水平的变化
CCK-8结果显示，以对照组为参考，DOX组细胞活力降低（P=0.002），激动剂组细胞活力较DOX组升高（P=0.047），拮抗剂组细胞活力较DOX组略有降低，但差异无统计学意义（P=0.127）（图5）。

图5 各组细胞活力Fig 5 Cell viability of different groups注：A. 处理不同时间（0、6、12、24 h）各组细胞活力变化趋势；B. 处理24 h各组细胞存活率统计。

①P=0.002，与对照组比较；②P=0.047，与DOX组比较。

3 讨论
DOX是常用的抗肿瘤药物，心脏毒性严重限制其临床使用。

目前普遍认为诱导心
肌细胞凋亡是其产生心脏毒性的主要机制。

本研究用DOX处理大鼠心肌细胞
H9C2，诱导其产生明显的细胞凋亡，表现为凋亡细胞比例明显增加，凋亡效应物cleaved caspase 3表达量增多，Bcl-2家族抗凋亡基因mRNA水平降低，促凋
亡基因mRNA水平升高，这与既往研究报道相一致[12-14]。

进一步将α1肾上腺素能信号通路的激动剂和拮抗剂分别与DOX共同作用于
H9C2细胞，观察到激动剂Phe能抑制DOX引起的心肌细胞凋亡，表现为细胞凋亡率下降，cleaved caspase 3表达减少，抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-w mRNA水平变升高，促凋亡基因Bax、Bad mRNA水平降低。

Montgomery等[15]也证实
α1A肾上腺素能受体的选择性激动剂能预防DOX所致雄性小鼠心肌损伤。

Caso
等[16]在乳鼠心肌细胞中也有类似研究结果，并且发现蛋白激酶A 锚定蛋白 13（A-kinase anchor protein 13，AKAP-Lbc）是该保护路径中的关键分子；其作用通过促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达并抑制促凋亡蛋白Bax向线粒体转运实现。

本研究观察到的Bcl-2家族抗凋亡基因mRNA表达水平增加与该研究结果一致。

既往临床研究[17]发现，使用α1肾上腺素能信号通路拮抗剂的患者会有心力衰竭加重的临床表现，表现为舒缩功能障碍、病理性肥厚、心肌细胞死亡和纤维化增加。

α1A和α1B肾上腺素能受体双敲除（α1ABKO）小鼠的心肌细胞死亡增加，纤维化加重，收缩功能恶化[18]。

α1ABKO小鼠心肌细胞在受到DOX刺激时凋亡水平增加[10]。

Pra作为可透膜的α1肾上腺素能受体拮抗剂，可产生与α1ABKO类似的效应。

本研究结果证实了这一假说。

添加Pra共培养加重了DOX诱导的心肌细胞凋亡，提示α1肾上腺素通路可介导内源性心肌保护，可能与下游蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）活化有关。

综上所述，本研究证实了α1肾上腺素能信号通路可影响DOX诱导的心肌细胞凋亡，其激动剂可抑制DOX诱导的心肌细胞凋亡，拮抗剂可加重DOX诱导的心肌
细胞凋亡，且该影响可能通过调节Bcl-2家族凋亡相关基因实现。

该结果对深入研究α1肾上腺素能信号通路心肌保护的分子机制、开发有效治疗DOX心脏毒性药物提供了新的实验证据；有望从促进心肌内源性保护潜能的角度对DOX心脏毒性制定有效防治策略，对改善DOX治疗肿瘤患儿的生存质量具有重要意义。

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